李田田， 程重陽， 許俊杰， 張 猛， 孟顥光， 耿月華

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450000； 2.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276005）

河南省地處暖溫帶，是我國的主要平原地帶，地表形態(tài)復(fù)雜多樣，土壤中含有豐富的真菌物種資源，也是我國小麥的主產(chǎn)區(qū)［1］. 在河南小麥病害中以小麥赤霉病和小麥莖基腐病為主，這兩種病害的主要病原菌均為鐮刀菌屬. 鐮刀菌屬（Fusarium Link）因大型分生孢子為鐮刀形而得名，兼寄生或腐生生活，廣泛存在于自然界土壤中. 鐮刀菌屬可引起多種植物病害［2］，如禾谷鐮刀菌（F.graminearum）可引起小麥的赤霉病，導(dǎo)致小麥根腐、穗腐［3］；木賊鐮刀菌（F.equiseti）可引起火龍果果柄腐爛?。?］；藤倉鐮刀菌（F.fujikuroi）可引起水稻惡苗病、百香果果實(shí)和葉部病害、甘蔗梢腐?。?］；層出鐮刀菌（F.proliferatum）可引起小麥莖基腐病、水稻和玉米穗部及葉鞘腐爛，也可引起大白菜枯萎?。?-9］；腐皮鐮刀菌（F.solani）可引起大豆根腐病、甘薯莖基部根腐?。?0］；尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）可引起番茄枯萎病、香蕉枯萎病、香蘭草莖腐病、西瓜猝倒病等一系列枯萎和莖基腐?。?1-13］等. 由此可見，鐮刀菌屬是植物病原真菌中的重要類群之一. 目前，由于鐮刀菌屬中不同物種形態(tài)特征差異不大，造成對其分類鑒定一直存在很大爭議［14］.

鐮刀菌以產(chǎn)生有毒次生代謝產(chǎn)物而聞名，這些次生代謝產(chǎn)物因?qū)游?、人類和植物?gòu)成很大健康威脅而被認(rèn)為是十大最具經(jīng)濟(jì)和科學(xué)價(jià)值的植物病原屬［15］. 鐮刀菌物種復(fù)合體包括許多“隱形”物種，其中很多不受《藻類、真菌和植物國際命名規(guī)范》的標(biāo)準(zhǔn)限制. 目前，對于小麥相關(guān)鐮刀菌的研究大多集中在小麥病原性或者是內(nèi)生性的鐮刀菌，很少有關(guān)注小麥生長期間土壤中鐮刀菌物種數(shù)量的研究.

本研究調(diào)查了河南省部分地區(qū)小麥田土壤中鐮刀菌的種類，采集河南省部分地區(qū)小麥田土壤樣品進(jìn)行調(diào)查，利用翻譯延伸因子TEF1-α的基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)合形態(tài)學(xué)分析對鐮刀菌種進(jìn)行鑒定. 翻譯延伸因子TEF1-α的基因在鐮刀菌屬中以單拷貝的形式存在，在比較密切相關(guān)的物種之間顯示出高水平的序列多態(tài)性［16］. 因此，可以用該基因標(biāo)記來分析鐮刀菌屬的遺傳進(jìn)化關(guān)系，從而進(jìn)一步探明鐮刀菌與小麥病害之間的關(guān)系，為小麥病害防治提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

實(shí)驗(yàn)樣品來自河南省鄭州、焦作、安陽、濟(jì)源、周口等不同地區(qū)小麥種植季節(jié)的小麥田土壤樣品，活菌株與DNA樣品保存于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)標(biāo)本室.

1.2 樣本的采集、菌株的分離與菌落特征觀察

采集樣品：首先將土壤表面的枯枝落葉、雜質(zhì)和表層土去除，取2～10 cm處的土壤約100 g，同一地區(qū)多點(diǎn)采集. 將采集的土壤樣品充分混合，取一定量的混合土壤樣品裝入自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，也可短期保存在4 ℃冰箱中［17］.

稀釋平板法處理樣品：取200 μL的土壤懸浮液在水瓊脂-麥稈培養(yǎng)基涂板，25 ℃培養(yǎng)14 d左右. 將平板放在體視鏡下觀察，挑取單孢至PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)、純化并保存. 對菌株進(jìn)行顯微形態(tài)特征觀察，用添加康乃馨葉片的PD培養(yǎng)基25 ℃，150 r/min搖培2 d，制作玻片，觀察孢子形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)并拍照［18］.

1.3 DNA的提取，基因片段擴(kuò)增及測序

菌株DNA的提?。簩⒕暝赑DA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)3 d，取0.5 cm2大小的菌塊于2 mL離心管中，加一顆滅菌鋼珠，采用改良CTAB法提取菌株的DNA.

TEF1-α基因序列獲?。荷舷掠我镄蛄蠩F-1：ATGGGTAAGGARGACAAGAC和EF-2：GGARGTACCAGTSATCATGTT［19］，所用引物由上海生工生物股份有限公司合成提供. 反應(yīng)體系為20 μL 體系，包括ddH2O 7.5 μL，2x Taq Mix 9.5 μL，模板DNA 1 μL（50～100 ng·μL-1），正反向引物各1 μL（10 μmol·L-1）. 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃最終延伸7 min，4 ℃終止.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)分析

2.1.1 層出鐮刀菌Fusarium proliferatum（Matsush.）Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg，Mitt. biol. BundAnst.Ld-u.Forstw.169：38（1982）；Cephalosporium proliferatum Matsush.，Microfungi of the Solomon Islands and Papua-New Guinea（Osaka）：11（1971） 層出鐮刀菌形態(tài)特征見圖1. 在PDA 上，7 d 直徑達(dá)到4.6 cm，菌落白色，菌絲棉絮狀，背面為白色至淺紫色；菌落氣生菌絲呈棉絮狀，白色，可產(chǎn)生大型分生孢子和小型分生孢子，不產(chǎn)生分生孢子座；大型分生孢子散生于氣生菌絲中，較直，薄壁，足細(xì)胞不明顯，頂細(xì)胞彎曲，通常有3～5個(gè)隔膜，大小27～58 μm×2.5～5.0 μm；產(chǎn)生大量小型分生孢子，串生，有時(shí)呈假頭狀著生，橢圓形或棍棒形，不分隔，大小5.0～15.5 μm×1.5～4.5 μm，不產(chǎn)生厚垣孢子.

圖1 層出鐮刀菌的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The morphology structure of Fusarium proliferatum（HN17064）

2.1.2 腐皮鐮刀菌Fusarium solani（Mart.）Sacc.，Michelia2（No.7）：296（1881）；Fusisporium solani Mart.1842 腐皮鐮刀菌形態(tài)特征見圖2. 在PDA培養(yǎng)基7 d 直徑達(dá)5 cm，菌落從白色到淺黃色，邊緣顏色較淺. 在后期培養(yǎng)基上會出現(xiàn)許多墨綠色黏狀物質(zhì)；菌落背面產(chǎn)生黃色色素，有明顯的輪紋產(chǎn)生；分生孢子從產(chǎn)孢瓶體產(chǎn)生，單瓶梗產(chǎn)孢，瓶梗較長；有3種類型分生孢子，小型分生孢子比較多，卵形或倒梨形、橢圓形，0～1 個(gè)隔膜，多1 個(gè)隔膜，6～9 μm×2.5～3.5 μm；大型分生孢子鐮刀形或者紡錘形，兩端頓，略彎曲，1～3個(gè)隔膜，10～30 μm×2.5～5 μm；厚垣孢子圓形，單生或串生.

2.1.3 富士鐮刀菌Fusarium fujikuroi Nirenberg，Mitt. biol.BundAnst.Ld-u.Forstw.169：32（1976）；Alysidium verticillioides（Sacc.）Kuntze［as‘verticilliodes’］，Revis.gen.pl.（Leipzig）3（3）：442（1898）；Fusarium moniliforme J.Sheld.，Nebraska Agric.Exp.Stat.Rep.17：23（1904）；Fusarium moniliforme var. fici Caldis，Hilgardia 2：295（1927）；Fusarium sacchari var.subglutinans（Wollenw.& Reinking）Nirenberg，Mitt.biol.BundAnst.Ld-u. Forstw.169：53（1976）；Fusarium verticillioides（Sacc.）Nirenberg，Mitt.biol.BundAnst.Ld-u.Forstw.169：26（1976）；Gibberella fujikuroi（Sawada）S.Ito，in Ito&Kimura，Hokkaido Agric.Exp.Sta.Rep.，No.27：28（1919）；Gibberella moniliformis Wineland，J.Agric.Res.，Washington 28：909（1924）；Oospora verticillioides Sacc.，Syll.fung.（Abellini）4：14（1886）；Fusarium verticillioides（Sacc.）Nirenberg，Mitt.biol.BundAnst.Ld-u.Forstw.169：26（1976） 富士鐮刀菌形態(tài)特征見圖3. 在PDA培養(yǎng)基上，菌落顏色初期白色，微發(fā)黃，氣生菌絲棉絮狀至氈狀；產(chǎn)孢瓶梗多單生；可產(chǎn)生大型分生孢子和小型分生孢子，小型分生孢子呈卵形，無隔膜，大小4～8 μm×1.3～4 μm；大型分生孢子量少，有3～5隔膜，呈鐮刀形，大小26.0～39.5 μm×3.5～7.5 μm；不產(chǎn)生厚垣孢子.

圖2 腐皮鐮刀菌的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The morphology structure of Fusarium solani（HN17038）

圖3 富士鐮刀菌的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The morphology structure of Fusarium fujikuroi（HN17126）

2.2 Fusarium分子系統(tǒng)學(xué)分析

本研究中鐮刀菌屬菌株共24株，3個(gè)種. 通過TEF1-α基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），利用引物EF-1/EF-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫里面進(jìn)行比對，用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，外群為Saccharomyces cerevisiae（NM001178466.1），與鐮刀菌屬的各個(gè)物種的遺傳距離較遠(yuǎn). 從系統(tǒng)發(fā)育樹上來看，分離出的菌株與層出鐮刀菌（F.Proliferatum）、腐皮鐮刀菌（F.Solani）和富士鐮刀菌（F.Fujikuroi）遺傳距離比較近，所以鑒定HN17018、HN17042、HN17063、HN17064、HN17085、HN17092、HN17138、HN17271、HN17379、HN17548、HN17562、HN17588 和HN17603 為層出鐮刀菌（F. proliferatum），HN17038、HN17531、HN17566、HN17599 和HN17602鑒定為腐皮鐮刀菌（F.solani），HN17001、HN17126和HN17601鑒定為富士鐮刀菌（F.fujikuroi）.

圖4 利用最大似然法對鐮刀菌屬的TEF1-α基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed from the TEF1-α gene of Fusarium using the maximum likelihood method

3 討論

鐮刀菌是子囊菌的一個(gè)形式屬，該屬是很多植物的病原菌、內(nèi)生菌或者腐生菌. 以往描述鐮刀菌的所有種類都是在形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征相結(jié)合的基礎(chǔ)上定義的，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及和多個(gè)基因片段的測序和評估，系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)在鐮刀菌分類上的作用越來越大. 該屬大多數(shù)物種產(chǎn)生一系列次生代謝物，這些代謝物在化學(xué)形式上差異很大. 鐮刀菌屬從1809年最初的描述到Wollenweber 和Reinking 發(fā)表的Die Fusarien，共描述了1000多個(gè)分類群. Wollenweber和Reinking將所有這些分類群整合成16個(gè)部分，包含65個(gè)種，55個(gè)變種和22 個(gè)型，并形成了一個(gè)分類框架［20］. 在接下來的大約50 年里，分類學(xué)爭論主要集中在現(xiàn)有形態(tài)特征（分生孢子）的相對重要性上. 系統(tǒng)發(fā)育物種的概念都被用于物種描述. 目前的實(shí)踐大多是尋找一個(gè)基因，其序列可以作為診斷工具，最好是對屬內(nèi)的每一個(gè)物種都有效，TEF1-α基因目前是鐮刀菌分類上應(yīng)用最廣泛的基因［16］.

通過對焦作、安陽、濟(jì)源、周口、鄭州等地小麥田地土樣的分離培養(yǎng)，鑒定出3種鐮刀菌，并通過形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定，鑒定出它們分別是層出鐮刀菌（F.proliferatum）、腐皮鐮刀菌（F.solani）和富士鐮刀菌（F.fujikuroi）.本研究得到的3種鐮刀菌均可以作為病原菌侵染植物，引起不同植物發(fā)病. 此次分離得到的3種鐮刀菌屬于土壤絲孢真菌，對開發(fā)新的功能菌株和維護(hù)土壤生態(tài)平衡起著積極的作用，也對探究鐮刀菌對小麥的致病性強(qiáng)弱以及找到寄生性和腐生性鐮刀菌的聯(lián)系具有一定的意義.