李中賢， 宋 躍， 趙燦方， 劉小培， 王俊偉， 余學(xué)軍

（1.河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心，鄭州 450002； 2.鄭州鐵路疾病預(yù)防控制所，鄭州 450015）

甲醛俗稱蟻醛，是無色、具有強烈氣味的刺激性氣體，易溶于水. 它是細胞原漿毒物，對人體細胞功能損害較大. 食品中甲醛進入人體后對腸道黏膜有刺激作用，可引起肺水腫，肝、腎充血及血管周圍水腫，甚至可能致癌. 在我國，食品中禁止使用甲醛作添加劑，《食品安全國家標準發(fā)酵酒及其配制酒》（GB 2758—2012）也規(guī)定了甲醛在啤酒類樣品中的最大殘留限量為2.0 mg/L［1］. 但一些廠家為了增加啤酒的感觀，在制作過程中仍加入少量甲醛，可能導(dǎo)致甲醛殘留超標. 因此，對啤酒中甲醛含量的測定一直是啤酒行業(yè)乃至社會都關(guān)注的問題，尤為重要.

目前，啤酒中甲醛含量的測定方法主要有分光光度法［2-6］、液相色譜法［7-9］和氣相色譜法［10-12］. 國家標準中采用紫外可見分光光度法測定啤酒中甲醛含量，其方法操作繁瑣，易受干擾，準確度較差，靈敏度低. 液相色譜法［13-15］因甲醛極性太大，與溶劑峰同時流出，在紫外無吸收而無法檢測. 直接氣相色譜法［16-18］由于甲醛分子太小，直接進行分析時出峰太快，且在FID 檢測器無響應(yīng). 衍生化-氣相色譜法也有報道［19-20］，而目前沒有對衍生化的條件進行優(yōu)化，分析檢測時會產(chǎn)生誤差. 因此，本研究以2，4-二硝基苯肼作衍生劑，在鹽酸溶液中衍生啤酒樣品中的甲醛，然后用直接超聲法提取所生成的衍生物，通過正交試驗設(shè)計對啤酒中甲醛含量測定的衍生化條件進行優(yōu)化，建立氣相色譜法準確測定啤酒中甲醛含量測定的最佳前處理方法，為相關(guān)部門對啤酒中甲醛含量的檢測提供一定的參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津GC-2010Plus氣相色譜儀，配電子捕獲檢測器（ECD）及GC solution工作站（日本島津公司）；Milli-Q高純水發(fā)生器（美國Millipore 公司）；AS 3120A 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）. 甲醛標準溶液：2 mg/L（環(huán)境保護部標準樣品研究所）；正己烷：色譜純；2，4-二硝基苯肼（DNPH）：分析純；鹽酸：分析純.

1.2 氣相色譜條件

色譜柱：OV-17 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm，中科院蘭州化學(xué)物理研究所），柱溫：220 ℃；進樣口溫度：220 ℃；電子捕獲檢測器溫度：280 ℃；載氣為高純氮氣（純度>99.999%），流量：40 mL/min；氫氣流量：40 mL/min；空氣流量：400 mL/min；尾吹氣流量：10 mL/min；分流比：30∶1；進樣量：1.0 μL.

1.3 溶液的制備

DNPH溶液：稱取100 mg DNPH溶解于24 mL濃鹽酸中，加水定容至100 mL，置于棕色瓶中.

甲醛標準系列工作液：分別吸取甲醛標準溶液0、0.25、0.50、2.50、5.00、10.00 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，依次配制成甲醛含量為0.00、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mg/L系列標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.4 標準曲線及樣品的測定

分別取2.00 mL 甲醛標準系列工作液、啤酒試樣于棕色具塞比色管中，各加入2.0 mL DNPH溶液（1 g/L），混勻后置65 ℃水浴中避光衍生30 min，然后在流水中快速冷卻，加入2.0 mL正己烷，超聲萃取10 min，取正己烷層待測.

將待測液注入氣相色譜儀中，以保留時間定性，同時記錄甲醛的色譜峰峰面積，由峰面積從標準曲線上求得試液中甲醛的含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生條件的優(yōu)化

利用醛類物質(zhì)在酸性介質(zhì)中能與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成穩(wěn)定的希夫堿［21］進行衍生化，反應(yīng)式如下：

實驗步驟：分別取2.00 mL 甲醛標準系列工作液于棕色具塞比色管中，各加入2.0 mL DNPH溶液（1 g/L），混勻后置于水浴中避光衍生一定時間，然后在流水中快速冷卻，加入2.0 mL正己烷，超聲萃取10 min，取正己烷層待測.

通過三因素三水平的正交實驗，研究了衍生試劑用量、衍生溫度和衍生時間對甲醛衍生物色譜峰分離效果的影響. 正交試驗因素水平見表1，正交試驗設(shè)計方案及統(tǒng)計分析結(jié)果見表2.

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 The orthogonal test factor level table

表2 正交試驗設(shè)計方案及統(tǒng)計分析結(jié)果Tab.2 The design scheme and statistical analysis results of orthogonal test

實驗結(jié)果顯示，衍生溫度對檢測結(jié)果的影響比較大，其次是衍生時間和衍生劑用量. 甲醛衍生物隨著衍生溫度的提高呈遞增趨勢，但溫度超過65 ℃后，增幅不大. 衍生溶液在65 ℃水浴中衍生10 min后，衍生物含量基本達到平衡. 在衍生溫度、衍生時間固定的情況下，衍生產(chǎn)物隨著衍生劑用量的增加而增多，但衍生劑用量過多會吸附于色譜柱上，使峰面積略有下降；用量過小將導(dǎo)致甲醛衍生不完全.

由表2 可知，第8 組甲醛衍生物色譜峰峰面積最大，最優(yōu)條件組合為A3B2C1. 所以，實驗采用該最佳組合，即衍生劑用量2.0 mL、衍生溫度65 ℃和衍生時間30 min，對啤酒中的甲醛含量進行測定.

2.2 超聲提取時間的選擇

為進一步優(yōu)化測試方法，在正交試驗選擇的最佳組合條件下，對超聲提取時間進行了優(yōu)化，結(jié)果圖1.

由圖1 可見，甲醛衍生物的色譜峰峰面積隨著超聲提取時間的增加而增大，超過10 min后衍生物含量基本趨于穩(wěn)定，因此，實驗確定超聲提取時間為10 min.

圖1 超聲提取時間的影響Fig.1 Effect of the ultrasonic extraction time

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇 在前人研究的基礎(chǔ)上，保持其他色譜條件不變，分別使用極性、中等極性和弱極性的色譜柱對甲醛衍生物進行分析測定，結(jié)果表明，中等極性O(shè)V-17 柱的分離效果最好.甲醛標準溶液的氣相色譜圖見圖2.

2.3.2 進樣口、檢測器及色譜柱溫度的選擇 在其他條件不變的情況下，分別改變進樣口、檢測器、色譜柱的溫度，發(fā)現(xiàn)進樣口、色譜柱溫度對甲醛衍生物色譜峰分離效果影響不大，檢測器溫度對其分離效果影響顯著. 通過優(yōu)化，實驗選擇進樣口溫度220 ℃，電子捕獲檢測器溫度280 ℃，色譜柱溫度220 ℃.

2.4 方法的相關(guān)性

在優(yōu)化的實驗條件下，對甲醛標準系列衍生萃取液進行測定，每個濃度測定峰面積3 次，計算平均值，以甲醛標準系列工作液的濃度為橫坐標，以甲醛衍生物色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=59 668x+1 259.5，r=0.999 5. 由此可見，甲醛在0～2 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系.

2.5 方法的回收率及精密度試驗

在上述實驗條件下，于不含甲醛的樣品本底中，分別添加低、中、高三個濃度水平的標樣，進行加標回收率試驗；每個濃度平行做三份，每份重復(fù)測定6次，求均值，測定回收率及精密度. 結(jié)果顯示，啤酒的平均加標回收率為87.3%～99.7%，相對標準偏差（RSD）為1.34%～2.24%. 結(jié)果見表3.

圖2 甲醛衍生物色譜圖Fig.2 Chromatogram of formaldehyde derivation

表3 方法回收率、精密度測定結(jié)果（n=6）Tab.3 The precision and accuracy of method（n=6）

2.6 實際樣品的測定

在優(yōu)化的實驗條件下，對實際啤酒樣品中的甲醛含量進行測定（圖3）. 結(jié)果顯示，所有檢測樣品中甲醛含量均很低，大大低于我國《發(fā)酵酒及其配制酒衛(wèi)生標準的分析方法》（GB/T 5009.49—2008）中規(guī)定的甲醛限量要求［2］.

圖3 某啤酒樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of wine sample

3 結(jié)論

本文以2，4-二硝基苯肼作衍生劑，通過正交實驗選擇了最佳的衍生劑用量、衍生溫度和衍生時間，在鹽酸溶液中對啤酒樣品中的甲醛進行了衍生、超聲提取，建立了氣相色譜-電子捕獲檢測器（ECD）法測定啤酒中的甲醛含量. 該方法具有操作簡單，分離度好，準確度高，重現(xiàn)性好等特點，滿足相關(guān)檢測規(guī)范要求，適用于啤酒中甲醛含量的檢測.