張楚楚 白 穎 李福軍 金燦輝

口腔鱗狀細(xì)胞癌是常見(jiàn)的口腔頜面部腫瘤，其惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)，患者5 年生存率不超過(guò)50%，存活下來(lái)的患者也常常因手術(shù)致殘而嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1]，同時(shí)其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[2]，嚴(yán)重威脅著人類的健康安全。因此，找到影響口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因素就成為提高患者生存率并改善預(yù)后的重要途徑。近年許多研究指出，轉(zhuǎn)錄因子SNAI2(zinc-finger transcription factor-2)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，但其在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的生物學(xué)效應(yīng)尚不明確。本研究擬在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中檢測(cè)SNAI2 的表達(dá)水平，探究SNAI2 對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖侵襲能力的影響，為SNAI2 對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的臨床診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療提供研究基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)使用的臨床樣本組織取自我院口腔外科2015 年7 月至2017 年3 月收治的53 例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者，其中男29 例，女24例，年齡60～74 歲，平均年齡65.6±5.2，其中發(fā)生于舌根27 例、軟腭22 例、腭扁桃體6 例。手術(shù)切除的癌變組織及癌旁組織(距原發(fā)灶邊緣距離大于5cm)均采用液氮保存。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：超凈工作臺(tái)(Thermo Scientific Heraguard ECO1.8)，生化培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 3111)，冷凍離心機(jī)(Sigma 2-16KL)，超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)，熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems 9700)，電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra)，化學(xué)發(fā)光儀(Bio-Rad ChemiDocEQ)，光學(xué)顯微鏡(Olympus DSX100)，切片機(jī)(德國(guó)徠卡RM2235)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及材料 細(xì)胞來(lái)源：人口腔鱗癌細(xì)胞SCC-090 細(xì)胞購(gòu)自蓋寧生物，產(chǎn)品編號(hào)CMH-269，人腎上皮細(xì)胞293T 購(gòu)自蓋寧生物，產(chǎn)品編號(hào)CMH-010。主要實(shí)驗(yàn)材料：RPMI1640 及高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、嘌呤霉素puromycin、脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Thermo Scientific Hyclone 公司)，病毒包裝質(zhì)粒pLP1-gag/pol、REV 和VSV-G(addgene)，轉(zhuǎn)染促進(jìn)因子polybrene(sigma 公司)，RNA 提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green 核酸熒光染料(Takara公司)。蛋白酶抑制劑、蛋白裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒(sigma 公司)。MTT 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)試劑盒(Promega)。Matrigel 膠(BD Biosciences)。二甲苯、甲醇、無(wú)水乙醇及過(guò)氧化氫(H2O2)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，GTVisionTM Ⅲ抗鼠/ 兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(上?；蚩萍脊煞萦邢薰?等?？贵w包括β-Actin(abcam，ab5694)，SNAI2(abcam，ab51772)，金屬基質(zhì)蛋白酶-2(matrix-metalloproteinase-2，MMP-2)(abcam，ab37150)，金屬基質(zhì)蛋白酶-9(matrix-metalloproteinase-9，MMP-9)(abcam，ab38898)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2 恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SCC-090 使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，293T 使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè)組織及細(xì)胞中SNAI2 mRNA 的表達(dá)水平 RNA 抽提：①組織RNA 抽提：將組織從液氮中取出，低溫?zé)o合酶的條件下研磨器研磨組織，取約30mg 組織加入1ml Trizol，冰上裂解5min，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提。②收集6cm 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，細(xì)胞融合度約80%，0.4ml胰蛋白酶消化細(xì)胞后1ml 培養(yǎng)基終止消化，500g離心5min，PBS 沖洗3 次，去上清，加入1ml Trizol，冰上裂解5min，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提。Nanodrop2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度，取1μg 行逆轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，得到20μl PCR cDNA 產(chǎn)物后，無(wú)核酶水稀釋至500μl。在熒光定量96 孔板中上樣，上樣體系為：10μl SYBR Green 核酸熒光染料，5μl cDNA 及5μl 引物，設(shè)置5 個(gè)重復(fù)孔，反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃4min；擴(kuò)增條件94℃30 s，60℃1min，總共40 個(gè)循環(huán)。β-actin 片段大小186bp，SNAI2 片段大小249bp。

表1 熒光定量引物表

1.2.3 IHC 檢測(cè)組織中SNAI2 蛋白的表達(dá)水平 新鮮組織用固定液處理24h，石蠟切片浸于二甲苯后10min，取出切片稍晾干后置于無(wú)水乙醇、90%、85%、80%、75%及70%各級(jí)酒精中各5min。0.3%H2O2處理切片10min，用蒸餾水沖洗3 次，切片放入抗原修復(fù)液中，放入高壓鍋中加熱至沸騰，蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)4min。修復(fù)完成后待切片自然冷卻，蒸餾水沖洗5min。37℃條件下干燥后，滴加3%過(guò)氧化氫于組織上，避光孵育15min。蒸餾水沖洗5min。滴加1∶1000 SNAI2的一抗于組織上，總體積100μl。室溫孵育1h，蒸餾水沖洗5min，擦干組織周?chē)恼麴s水。滴加100μl 免疫組化試劑盒中的A 液于組織上，室溫孵育30min，蒸餾水沖洗3 次，每次5min，擦干組織周?chē)恼麴s水。滴加100μl 顯色劑DAB 溶液于組織上，室溫孵育10min，蒸餾水沖洗終止顯色。依次置于70%、75%、80%、85%、90%及無(wú)水乙醇中脫水，各3min，脫水后浸于二甲苯中15min，中性樹(shù)膠封片。IHC 染色切片采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，每張切片選取10 個(gè)高倍視野，每個(gè)視野觀察100 個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算其中平均陽(yáng)性的細(xì)胞比例。以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞＜10%的為陰性(-)，≥10%的為陽(yáng)性(+)。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定干擾SNAI2 細(xì)胞系 干擾質(zhì)粒靶序列為shSNAI2 1# ：TGAGGCGGGACCCTCAGGCC，shSNAI2 2# ：TTCACAGCTGTCCCAGAGGG，陰性對(duì)照序列shcontrol：GCTGTTTTTTGAGATTTCAG。載體構(gòu)建方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4]，①包裝病毒：在六孔板中接種293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到融合度80%左右，每孔加入包裝質(zhì)粒pLP1-gag/ pol 0.75μg、REV 0.3μg和VSV-G 0.45μg 及1.5μg 目的質(zhì)粒，與10μL Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑充分混合，室溫放置20min，PBS 沖洗2 次293T 細(xì)胞，加入1ml 無(wú)血清DMEM，20min 后將混合好的質(zhì)粒逐滴加入孔中，輕輕搖動(dòng)混勻后37℃，5%CO2培養(yǎng)8h，更換DMEM＋10%FBS 培養(yǎng)，收集24h 及48h 后的病毒懸液，0.45μm 濾器過(guò)濾，收集于新的離心管中，-80℃保存。②慢病毒感染：在六孔板中接種SCC-090 細(xì)胞，保證細(xì)胞融合度40%左右時(shí)RPMI1640＋10%FBS 培養(yǎng)基與病毒懸液2∶1 加入相應(yīng)孔中，總體積3ml，3μL Polybrene，重復(fù)感染2d 后，使用puromycin 篩選穩(wěn)定細(xì)胞系，篩選濃度2μg/ ml，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好后完成建系。

1.2.5 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 將細(xì)胞系shcontrol、shSNAI2 1#、shSNAI2 2# 以2000 個(gè)每孔接種至96 孔板中，設(shè)置5 個(gè)重復(fù)孔，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待12h 細(xì)胞貼壁后，在0h，24h，48h 以及72h 時(shí)間點(diǎn)將MTT 溶液與培基以1:9 的比例混合均勻，棄去上清液，每孔加入100μl MTT 混合液，37℃培養(yǎng)箱中孵育1h 后，多孔板酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm 處吸光度。

1.2.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力50μg/ ml Matrigel 膠稀釋液包被Transwell 小室底的上室面，4℃下風(fēng)干。50μl 1%BSA 無(wú)血清培養(yǎng)液加入基底膜，生化培養(yǎng)箱中37℃放置30min。shcontrol、shSNAI2 1#、shSNAI2 2# 3 種建系細(xì)胞胰酶消化，終止消化后轉(zhuǎn)移至1.5ml 離心管，去上清后PBS 洗3 次，更換1%BSA 無(wú)血清培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×105/ 孔的細(xì)胞加入Transwell上小室，下室加入500μl 的RPMI1640＋10%FBS培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，注意盡量減少晃動(dòng)。48h 后甲醇固定10min，結(jié)晶紫染色15min，光鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法為200×光鏡下觀察膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)，五點(diǎn)取樣法觀察孔中央及四周各5 個(gè)視野，重復(fù)取樣3 次，求平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.7 Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞SNAI2、MMP-2及MMP-9 蛋白的表達(dá)水平 ①蛋白收集及準(zhǔn)備工作：SCC-090 shcontrol、SCC-090 shSNAI2 1#、SCC-090 shSNAI2 2# 3 種建系細(xì)胞在10cm 培養(yǎng)皿中細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)，0.4ml 胰酶消化后1ml RPMI1640＋10%FBS 培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml 離心管，800rpm，5min，4℃離心，去上清后PBS 洗3 次，配置1ml 蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑的混合溶液，每種細(xì)胞加入300μl，充分混合后冰上裂解2h，期間不斷混勻，16000rpm，15min，4℃離心，收集上清液。使用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析，配平體系，上樣量50μg。②Western Blot 實(shí)驗(yàn)：配置10%丙烯酰胺膠，上樣(兩個(gè)重復(fù)孔)后80V 穩(wěn)壓跑出積層膠，調(diào)整電壓至110V 穩(wěn)壓跑至膠底，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜穩(wěn)流250mA，10%脫脂奶粉封閉2h，一抗SNAI2、MMP-2 及MMP-9 于4℃孵育12h，濃度分別為SNAI2(1∶1000)、MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1 ∶1000)及β-actin(1 ∶2000)，二抗于37℃孵育1.5h，β-actin、MMP-2、MMP-9 及SNAI2 均為鼠二抗(1∶2000)，發(fā)光液曝光顯影，ImageLab 4.1 行灰度掃描，待測(cè)蛋白樣品灰度比值為樣品DPI 值(dots per inch 值)與內(nèi)參基因β-actin 的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS17.0軟件。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，方差分析比較計(jì)量資料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SNK 法進(jìn)行多組資料間的兩兩比較，χ2檢驗(yàn)比較計(jì)數(shù)資料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α 均取0.05。

2.結(jié)果

2.1 口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床樣本組織SNAI2 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平 RT-PCR 結(jié)果示口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中SNAI2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為0.171±0.010 顯著高于癌旁組織0.106±0.007，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，見(jiàn)圖1。IHC 結(jié)果示患者口腔鱗狀細(xì)胞癌組織SNAI2 的陽(yáng)性率為58.49%(31/ 53)顯著高于癌旁組織SNAI2 的陽(yáng)性率26.45%(14/ 53)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，見(jiàn)圖2。

2.2 SCC-090 穩(wěn)定干擾SNAI2 細(xì)胞系的構(gòu)建RT-PCR 結(jié)果示SCC-090shSNAI21# 及shSNAI2 2# 細(xì)胞系SNAI2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著低于shcontrol 細(xì)胞系(F=40.71，P＜0.0001)，見(jiàn)圖3 及表2。Western Blot 半定量的結(jié)果也與一致，進(jìn)一步證實(shí)了干擾SNAI2 細(xì)胞系的成功構(gòu)建，見(jiàn)圖4。

圖1 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁組織SNAI2 mRNA表達(dá)的比較

圖2 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁組織SNAI2 免疫組化結(jié)果的比較

表2 SCC-090 穩(wěn)定干擾SNAI2 細(xì)胞系SNAI2 表達(dá)量比較

圖3 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系mRNA 水平的驗(yàn)證

圖4 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系蛋白水平的驗(yàn)證

2.3 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系增殖能力的變化 MTT 的結(jié)果顯示SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系增殖能力在48h 及72h 顯著低于對(duì)照組SCC-090 shcontrol 細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5 及表3。

表3 SCC-090 穩(wěn)定干擾SNAI2 細(xì)胞系增殖能力的比較

圖5 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系增殖能力的變化

2.4 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系侵襲能力的變化Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SCC-090 shSNAI2 1# 及shSNAI2 2# 在48h 后穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于shcontrol 細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6、7 及表4。

表4 SCC-090 穩(wěn)定干擾SNAI2 細(xì)胞系侵襲能力的比較

圖6 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系侵襲能力的變化

圖7 SCC-090shSNAI2 細(xì)胞系穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)量的比較

2.5 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系MMP-2 及MMP-9 的變化 Western Blot 結(jié)果顯示，shcontrol細(xì)胞的MMP-2 及MMP-9 相對(duì)灰度值均顯著高于shSNAI2 1# 及shSNAI2 2# 的灰度值，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖8、圖9 及表5。

表5 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系MMP-2 及MMP-9 蛋白表達(dá)的比較

圖8 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系MMP-2 及MMP-9表達(dá)的變化

圖9 SCC-090 shSNAI2 細(xì)胞系MMP-2 及MMP-9相對(duì)灰度值的比較

3.討論

SNAI2 位于染色體8q11.21 上，是重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，在正常機(jī)體內(nèi)參與早期的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[5]，近年來(lái)許多研究指出，SNAI2 在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，且一致的認(rèn)為其表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在乳腺癌中，SNAI2 高表達(dá)于惡性程度較高的基底細(xì)胞樣癌，且其表達(dá)與患者TNM分期呈正相關(guān)[6]，SNAI2 還可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)過(guò)程的發(fā)生及癌細(xì)胞干性的維持，促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵襲能力[7]，并介導(dǎo)細(xì)胞化療藥物抵抗的形成[8]。在胃癌中，SNAI2 高表達(dá)于胃癌組織，且與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[9]，體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SNAI2可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖侵襲能力[10]。在非小細(xì)胞肺癌中，SNAI2 的高表達(dá)不利于患者的預(yù)后[11]，體外干擾SNAI2 的表達(dá)后，A549 肺癌細(xì)胞的增殖侵襲能力均降低，并可促進(jìn)細(xì)胞EMT 過(guò)程的發(fā)生[12]，同時(shí)有研究指出SNAI2 可通過(guò)促進(jìn)EMT 過(guò)程進(jìn)而介導(dǎo)癌細(xì)胞放化療抵抗[13]。

本研究我們應(yīng)用RT-PCR 及IHC 技術(shù)在臨床水平發(fā)現(xiàn)，SNAI2 在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，提示SNAI2 可能在口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。我們進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中探究了SNAI2 與口腔鱗癌細(xì)胞SCC-090 增殖侵襲能力的關(guān)系，慢病毒穩(wěn)定干擾SNAI2 的表達(dá)后，MTT結(jié)果顯示SCC-090 細(xì)胞的增殖能力顯著下降，提示SNAI2 在口腔鱗癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中起著促進(jìn)作用，Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SCC-090 細(xì)胞的侵襲能力顯著下降，提示SNAI2 可能對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的局部侵襲、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MMP-2 及MMP-9 是與多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)的兩種分子，其可降解細(xì)胞間質(zhì)，在癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力中發(fā)揮著重要作用[14-16]。本研究在穩(wěn)定干擾SNAI2 的SCC-090細(xì)胞中檢測(cè)了MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)干擾SNAI2 表達(dá)后，MMP-2 和MMP-9 表達(dá)也顯著降低，由此我們推測(cè)SNAI2 可能通過(guò)促進(jìn)其下游靶基因MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)。

我們將在接下來(lái)的臨床研究中對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，繪制生存曲線，從流行病學(xué)的角度探究SNAI2 與患者預(yù)后的關(guān)系，并補(bǔ)充體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)SNAI2 對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響，對(duì)SNAI2 與MMP-2 及MMP-9 的相互作用深入研究，進(jìn)行免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其相互作用，并對(duì)相互作用的位點(diǎn)進(jìn)行分析，為揭示SNAI2 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的確切作用提供線索，為SNAI2 的分子靶向治療及患者預(yù)后的評(píng)估提供新的依據(jù)。