倪弦之，柏浩東，韓進(jìn)財(cái)，羅丁峰，李祖任，胡一鴻，金晨鐘

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，雜草生物學(xué)及安全防控生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

絲 氨 酸 羥 甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶（Serine hydroxymethyl transferase，SHMT）是高等植物的一碳化合物代謝和光呼吸過(guò)程的關(guān)鍵酶，屬于磷酸毗哆醛依賴(lài)酶。該酶可以催化甘氨酸和N5，N10-亞甲基四氫葉酸生成絲氨酸和四氫葉酸（THF），且該過(guò)程可逆[1]，反應(yīng)式如下。

SHMT 廣泛存在于原核生物和真核生物中，其在原核生物中是由單基因編碼并以二聚體形式存在；而在動(dòng)物和真菌中，SHMT 則是由不同的核基因編碼的具有2 種異構(gòu)型的四聚體[2]。近年來(lái)由于SHMT 可用于體外催化生產(chǎn)絲氨酸而備受關(guān)注，同時(shí)該物質(zhì)對(duì)植物多種生理功能具有調(diào)節(jié)作用，因此關(guān)于植物SHMT的相關(guān)研究越來(lái)越多，也越來(lái)越深入。筆者主要對(duì)不同植物體內(nèi)SHMT 的多種構(gòu)型、克隆、逆境表達(dá)及其在植物保護(hù)上的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為植物SHMT 基因家族的功能及其相關(guān)應(yīng)用研究提供參考。

1 植物SHMT 基因家族

SHMT 基因在植物界是非常廣泛且重要的存在。植物界SHMT 基因家族同時(shí)也是一個(gè)神秘而龐大的家族。目前的研究顯示，在擬南芥中，已經(jīng)鑒定出7 個(gè)SHMT 基因[3]；在水稻中，OsSHMT 家族有5 個(gè)成員[4]；在大豆中，GmSHMT 大豆基因組包含大量的SHMT基因，約有18 個(gè)成員[5]。

植物的光合作用分為光反應(yīng)和暗反應(yīng)2 個(gè)過(guò)程。光反應(yīng)發(fā)生在葉綠體類(lèi)囊體膜上，光合色素吸收光能后進(jìn)行電子傳遞，形成光合作用所需的能量和還原力（ATP 和NADPH）；而暗反應(yīng)在葉綠體基質(zhì)中進(jìn)行，是光合作用碳同化過(guò)程[1]。已有研究表明，植物體中存在3 種形式的SHMT，即細(xì)胞質(zhì)cSHMT、線(xiàn)粒體mSHMT 和葉綠體亞型SHMT[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，不同植物的基因組中都存在著可能編碼質(zhì)體SHMTs 的基因，同時(shí)在典型雙子葉植物豌豆（Pisum sativum）和典型單子葉植物大麥（Hordeum vulgare）的葉綠體中也檢測(cè)到SHMT 活性，說(shuō)明cSHMT 存在于所有開(kāi)花植物中[7]。當(dāng)前，研究較多的是mSHMT 在植物光呼吸過(guò)程的作用機(jī)理。在植物的線(xiàn)粒體內(nèi)，參與光呼吸過(guò)程中的關(guān)鍵酶是SHMT。當(dāng)來(lái)自于光呼吸的甘氨酸（Gly）進(jìn)入線(xiàn)粒體中，SHMT 利用線(xiàn)粒體中四氫葉酸的碳將該Gly 轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸（L-Ser），同時(shí)與甘氨酸脫羧酶（GDC）配合將2 分子Gly 轉(zhuǎn)變?yōu)? 分子L-Ser、1 分子氨（NH3）和1 分子CO2。該反應(yīng)過(guò)程中GDC 和SHMT 緊密協(xié)同，促使葉酸及THF 在線(xiàn)粒體中合成，使整個(gè)光呼吸過(guò)程持續(xù)進(jìn)行（圖1）[8-10]。

圖1 植物細(xì)胞內(nèi)光呼吸途徑示意圖

不同植物中3 種構(gòu)型的SHMT 基因表達(dá)及其含量存在差異，同一植物不同器官中亦是如此。研究發(fā)現(xiàn)，綠色豌豆葉片線(xiàn)粒體中純化得到的SHMT 經(jīng)過(guò)離子交換層析柱后可獲得2 個(gè)不同的峰[11]。擬南芥SHMT 基因最初是用豌豆mSHMT 基因做探針進(jìn)行篩選的。擬南芥中有7 個(gè)SHMT 基因，分別為AtSHM1～AtSHM7。而擬南芥中SHMT 雖然由一個(gè)基因家族進(jìn)行編碼, 但SHM1 與SHM2 蛋白產(chǎn)物可能被定位在線(xiàn)粒體基質(zhì)中，而其他5 個(gè)SHMT 基因編碼缺乏可識(shí)別的定位序列，只能推測(cè)可能存在于細(xì)胞質(zhì)中[12]。擬南芥線(xiàn)粒體中SHMl、SHM2 基因mRNA 能夠在葉片中積累并受光的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而SHM4 的mRNA 在根中積累且不受光的誘導(dǎo)，推測(cè)其在光呼吸中可能不起作用，而是參與根中C1 代謝，SHM4 基因mRNA 在幼苗根中的積累且受生物鐘調(diào)節(jié)[12]。曾廣娟等[13]用酶聯(lián)免疫法（ELISA）和免疫組織化學(xué)法（IHC） 對(duì)五年生蘋(píng)果實(shí)生樹(shù)不同節(jié)位的SHMT變化進(jìn)行檢測(cè)。由此得出結(jié)論，在蘋(píng)果實(shí)生樹(shù)階段的轉(zhuǎn)變過(guò)程中SHMT 表達(dá)存在一定差異，SHMT 有且只存在于蘋(píng)果實(shí)生樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的葉片中，其他生長(zhǎng)階段和部位幾乎檢測(cè)不到其含量。

2 SHMT 基因克隆的進(jìn)展

在基因功能研究中，正向遺傳學(xué)的思路通常為首先通過(guò)突變表型篩選獲得突變體，然后克隆基因，最后研究其功能。盡管目前的突變技術(shù)復(fù)雜多樣，但是常見(jiàn)的突變方法大致有4 種：定向誘變、移碼突變、堿基置換突變和自發(fā)突變。而目前對(duì)于SHMT 基因的研究普遍采取定向誘變，得到所需要的目的DNA 片段，再進(jìn)一步完成之后的一系列基因克隆工程。基因突變技術(shù)日新月異，與之相關(guān)的基因克隆技術(shù)也呈現(xiàn)出多樣化。有的方法周期長(zhǎng)，開(kāi)展難度較大，例如mRNA 差異顯示技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、基因組減法技術(shù)、圖譜克隆技術(shù)及cDNA 文庫(kù)篩選技術(shù)等，因此在目前的試驗(yàn)研究中運(yùn)用較少。有的方法試驗(yàn)材料廉價(jià)、操作步驟簡(jiǎn)單、所需時(shí)間短，因此應(yīng)用較多，例如cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）。該技術(shù)是基于逆轉(zhuǎn)錄PCR 從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA 的5'和3'末端的有效手段。該技術(shù)方法簡(jiǎn)單，適用性廣，是目前運(yùn)用較多的基因克隆技術(shù)之一。圖2 為植物界部分已知SHMT基因家族的蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

國(guó)外開(kāi)展SHMT 基因克隆研究較早，1992 年Turner 等[11]就用豌豆的SHMT 基因探針在數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出2 個(gè)基因（FPGHMT1，F(xiàn)PGHMT2），并用巢式PCR 法擴(kuò)增其序列。Agrawal 等[14]1995 年用限制性?xún)?nèi)切酶Nde1 和BamH1 雙酶切法從pETSH 中釋放出1 452 bp 的羊肝細(xì)胞質(zhì)基因（scSHMT），然后將該基因片段連接到另一個(gè)載體pRSET‘C’上，以檢測(cè)scSHMT 的表達(dá)。

林穎輝等[15]采用普通PCR 技術(shù)克隆得到2 條壇紫菜的SHMT 全長(zhǎng)基因序列，分別將其命名為PhSHMT-1 和PhSHMT-2，在GenBank 中的收錄號(hào)分別為MF687405 和MF687406。通過(guò)多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，確認(rèn)這2 個(gè)基因?qū)儆赟HMT 基因家族。根據(jù)介紹，PhSHMT-1 序列全長(zhǎng)為1 710 bp，包含了一個(gè)有1 491 對(duì)堿基的開(kāi)放閱讀框，其編碼的多肽包含497 個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4.93，分子量為121.443 kDa；PhSHMT-2 序列全長(zhǎng)1 957 bp，其序列也包含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，有1 395 對(duì)堿基，所編碼的多肽包含465 個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4.95，分子量為113.969 kDa。

郭玉朋等[1]對(duì)水稻光呼吸突變體mSHMT 基因進(jìn)行了克隆試驗(yàn)，經(jīng)互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)水稻線(xiàn)粒體絲氨酸經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶基因（osmSHMT）突變，產(chǎn)生了葉綠素缺失表型。試驗(yàn)采用PCR-walking 技術(shù)分離了突變體基因組T-DNA 插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)T-DNA 插入水稻線(xiàn)粒體絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因（osmSHMT），經(jīng)PCR 共分離驗(yàn)證，確定了被標(biāo)記基因與突變表型共分離，從而初步確定了突變表型可能與T-DNA 插入有關(guān)。

3 植物SHMT 家族基因在逆境下的表達(dá)研究

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中通常需要抵御各種復(fù)雜的非生物和生物脅迫，如營(yíng)養(yǎng)脅迫、重金屬脅迫、溫濕度脅迫、鹽堿脅迫和蟲(chóng)害、病害等。這些脅迫往往同時(shí)或接連發(fā)生，甚至存在一定的相互作用，直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、分布狀況和基因表達(dá)等。為了抵御這些脅迫，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中建立了復(fù)雜且精細(xì)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。一般在遇到脅迫效應(yīng)時(shí)，植物自身的防御機(jī)制會(huì)被激活，激活的快慢與脅迫程度有較大關(guān)系，但不一定是正相關(guān)，激活后的防御機(jī)制通常伴隨著植物激素和部分重要的功能蛋白的參與，例如轉(zhuǎn)錄因子、病程相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。而光合作用又是植物最為重要的生理活動(dòng)之一。因此，研究各種脅迫下植物捕光蛋白基因表達(dá)的變化，有重大的研究意義[16]。

圖2 部分已克隆SHMT 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

研究表明，中嗜熱鏈球菌中g(shù)lyA 基因表達(dá)出的SHMT 酶活性大約是大腸桿菌的2 倍，不同的外部條件下，不同生物體中SHMT 基因表達(dá)產(chǎn)生的SHMT活性存在較大差異[17]。林穎輝等[15]通過(guò)克隆壇紫菜SHMT 基因研究高溫脅迫下的SHMT 表達(dá)機(jī)理，結(jié)果顯示31℃高溫脅迫處理不同時(shí)長(zhǎng)，PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因的表達(dá)模式幾乎一致，當(dāng)31℃高溫脅迫處理12 h 時(shí)，PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P ＜0.05）；而當(dāng)31℃高溫脅迫處理超過(guò)12 h 后，表達(dá)水平恢復(fù)到正常值，極有可能是PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因已經(jīng)適應(yīng)了高溫的刺激；當(dāng)31℃高溫脅迫處理超過(guò)4 d 時(shí)，PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因的表達(dá)水平又顯著上調(diào)（P ＜0.05）。這表明高溫脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，藻體需要更多的谷胱甘肽以清除活性氧，因此再次激活了植物的防御調(diào)控機(jī)制。Igamberdiev 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸（L-Ser）轉(zhuǎn)化為甲酸的途徑與形成過(guò)程中的磷酸化有關(guān)，植物連續(xù)的代謝對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原和能量水平及pH 值的調(diào)節(jié)有重要影響，尤其是在應(yīng)激條件下，幾種酶的表達(dá)參與了生物化學(xué)適應(yīng)環(huán)境壓力的過(guò)程。SHMT 通過(guò)甘油酸和磷酸化絲氨酸途徑參與調(diào)節(jié)應(yīng)激植物細(xì)胞的氧化還原平衡，這些途徑是連接碳氮代謝和維持細(xì)胞氧化還原和能量水平的重要過(guò)程。Li 等[19]研究認(rèn)為，在擬南芥中，GDC/SHMT 和C1-THF/SHMT 途徑通常是獨(dú)立運(yùn)行的，但當(dāng)植株受到逆境影響，初級(jí)GDC/SHMT 途徑受損時(shí)，替代的C1-THF/SHMT 途徑可以部分彌補(bǔ)絲氨酸合成的不足。Rojas 等[20]在植物與病原菌的相互作用對(duì)光呼吸和其他與植物生長(zhǎng)所必需的初級(jí)代謝影響機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)，光呼吸等初級(jí)代謝途徑參與了植物的防御反應(yīng)，并認(rèn)為初級(jí)代謝在調(diào)節(jié)植物防御病原體方面具有較強(qiáng)的相關(guān)性。高鹽度條件下，鹽藻和集胞藻Pcc6803 細(xì)胞SHMT 活性的升高提示著SHMT 活性在耐鹽過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，表明SHMT 的過(guò)度表達(dá)增加了藍(lán)藻的耐鹽性[21]。以上發(fā)現(xiàn)均具有相同結(jié)論，即SHMT 基因可能間接參與了植物逆境調(diào)節(jié)過(guò)程或代謝途徑彌補(bǔ)過(guò)程，其對(duì)于植物的逆境生理調(diào)節(jié)具有重要作用。

4 SHMT 基因家族在植物保護(hù)上的應(yīng)用

當(dāng)前，人們對(duì)糧食和農(nóng)副產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量的要求日益提高，我國(guó)農(nóng)業(yè)正處于量變帶動(dòng)質(zhì)變的新階段。每年因?yàn)橹仓曜陨砘蛘咄饨缫蛩囟鴮?dǎo)致的糧食損失巨大。不管是從保護(hù)糧食解決世界人口溫飽的角度，還是從保護(hù)生態(tài)圈平衡的角度，研究并實(shí)現(xiàn)多手段的植保技術(shù)是需要長(zhǎng)期關(guān)注的課題。以SHMT 基因?yàn)槔渥饔玫陌袠?biāo)在植物體內(nèi)是極其關(guān)鍵的。有研究指出，SHMT 嚴(yán)重減少的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片中Gly 的水平比野生型高100 倍，光合作用速率降低，因此光合作用速率與Gly 水平呈負(fù)相關(guān)，與SHMT 活性呈正相關(guān)。在高光照條件下SHMT 活性降低對(duì)植物生長(zhǎng)的負(fù)面影響十分顯著。有研究認(rèn)為，當(dāng)缺乏SHMT 時(shí)，植物會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)延遲和葉片萎黃，因而SHMT 可以作為除草劑作用的新對(duì)象，通過(guò)降低SHMT 含量達(dá)到除草的目的[6]。通常認(rèn)為植株加強(qiáng)能量是通過(guò)光呼吸促進(jìn)卡爾文循環(huán)，以避免光合電子傳遞鏈被過(guò)度還原，而光呼吸功能的減弱會(huì)導(dǎo)致電子在PSI 端被氧分子融合產(chǎn)生超氧陰離子，還伴隨著過(guò)氧化氫的生成，這些活性氧如不能被及時(shí)清除，將產(chǎn)生光氧化，進(jìn)而影響植株生長(zhǎng)[22]。

SHMT 功能的變化也會(huì)通過(guò)影響光呼吸作用而影響植物生理過(guò)程。例如光呼吸能調(diào)控多種信號(hào)傳遞途徑，其中激素響應(yīng)途徑是控制植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵，而這一途徑需要依賴(lài)SHMT 的參與。除細(xì)胞氧化還原狀態(tài)會(huì)影響激素信號(hào)傳遞途徑外，在已發(fā)現(xiàn)的植物激素中，赤霉素、脫落酸等合成的部分反應(yīng)在葉綠體內(nèi)進(jìn)行，而SHMT 在葉綠體中參與的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的氧氣和磷類(lèi)物質(zhì)可能是影響這些植物激素合成的因素[23-24]。目前，利用植物SHMT 靶標(biāo)及其生理機(jī)能進(jìn)行植物保護(hù)的實(shí)際應(yīng)用研究較少。

5 結(jié)論與展望

目前，關(guān)于植物SHMT 基因家族的研究已經(jīng)有較多進(jìn)展。例如SHMT 基因的命名與分類(lèi)、SHMT 基因家族的主要結(jié)構(gòu)與演變和進(jìn)化、SHMT 基因的主要功能?？墒窃谥参颯HMT 基因克隆及逆境表達(dá)方面的研究涉及的植物種類(lèi)較少，應(yīng)用于植物栽培及抗逆、抗病蟲(chóng)害等方面的研究也缺乏，但隨著植物SHMT 性質(zhì)的進(jìn)一步被研究闡明，利用SHMT 的某一特殊生理功能促進(jìn)植物栽培種植及保護(hù)的技術(shù)必將與高效的基因工程技術(shù)一樣廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。