展文豪，周書洪，袁春營，崔青曼

（1.天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；2.天津市濱海新區(qū)塘沽水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津 300450）

凡納濱對蝦（南美白對蝦）Litopenaeus vannamei原產(chǎn)于美洲太平洋沿岸水域，主要分布在秘魯北部至墨西哥灣沿岸，以厄瓜多爾沿岸分布最為集中，是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的蝦類之一，我國大部分地區(qū)均有養(yǎng)殖[1]。鹽度是影響南美白對蝦滲透壓調(diào)節(jié)的重要因素，顯著影響其增長率、成活率和飼料系數(shù)[2]。海水養(yǎng)殖的凡納濱對蝦肝胰腺胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活力普遍高于淡水養(yǎng)殖的凡納濱對蝦[3]。高鹽能顯著抑制南美白對蝦仔蝦的日增重和存活率，對蝦的總超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性隨鹽度升高均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，鹽度50 時(shí)達(dá)到峰值，酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性隨鹽度升高而上升[4]。低鹽度下南美白對蝦的酚氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶和呼吸爆發(fā)活性降低[5]。為了更好地掌握鹽度對凡納濱對蝦免疫功能的影響機(jī)制，本研究探討了鹽度對凡納濱對蝦血細(xì)胞吞噬能力和免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納濱對蝦購自天津市寶坻區(qū)漁翁水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司，體長（7.01±0.86）cm，體質(zhì)量（3.15±1.03）g。鰻弧菌Vibrio anguillarum 由天津市水產(chǎn)研究所贈送。

實(shí)驗(yàn)飼料購自天津凱源飼料有限公司，粒徑為1.0 mm，粗蛋白質(zhì)38.12%、粗脂肪7.03%、粗纖維4.26%、粗灰分9.87%、鈣2.36%、磷1.41%。

TRIzolTM Reagent試劑盒、M-MLV、Random Primer 及Oligo dT 購自Invitrogen Corporation；RNase inhibitor 及dNTPs 購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；氯仿、異丙醇及乙醇購自北京索萊寶科技有限公司。Bioprep-6 生物樣品均質(zhì)儀，杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)；立式蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；PCR 擴(kuò)增儀和Gel Doc EZ Imager 凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司生產(chǎn)；MIKRO 200R 和UNIVERSAL 320R 臺式冷凍離心機(jī)，德國Hettich 科學(xué)儀器公司生產(chǎn)；精密pH 計(jì)，天津市盛邦科學(xué)儀器技術(shù)公司生產(chǎn)；電子分析天平，梅特勒-托利多公司（瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

凡納濱對蝦飼養(yǎng)在730 mm×530 mm×450 mm水族箱中，每箱中30 只對蝦，設(shè)置3 個鹽度梯度（6、18 和30），每組3 個重復(fù)，共計(jì)9 個處理組。

實(shí)驗(yàn)持續(xù)6 周。按對蝦體質(zhì)量的4%～5%、每天6:00、11:00、16:00 和21:00 投喂4 次，每次投喂量占日總投喂量的30%、20%、30%和20%。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫27～29 ℃，pH7.8～8.1，溶解氧＞6 mg/L。

1.2.2 凡納濱對蝦血細(xì)胞吞噬活性測定

（1）按照文獻(xiàn)[6]采集血淋巴細(xì)胞。

（2）熒光標(biāo)記及血細(xì)胞吞噬：1 mL 鰻弧菌菌懸液（106CFU/mL）中加入20 μL FITC（1 mg/mL）進(jìn)行熒光標(biāo)記16 h，后續(xù)步驟按照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。細(xì)胞吞噬活性用吞噬百分率表示：吞噬百分率（%）=（吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

表1 實(shí)驗(yàn)用的引物序列[6,7]Tab.1 Sequences of the primers used in the experiment

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 分析免疫因子基因表達(dá)

血細(xì)胞、肝胰腺和鰓組織總RNA 提取按照Trizol 總RNA 抽提試劑盒說明書進(jìn)行。18S rRNA（內(nèi)參）、酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、過氧化氫酶（CAT）、TLR（Toll 樣受體）、免疫缺陷基因（IMD）的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其序列見表1。

本實(shí)驗(yàn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)程序見文獻(xiàn)[6]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD 表示，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對凡納濱對蝦血細(xì)胞吞噬活性的影響

由圖1～圖4 可知：鹽度30 和18 組凡納濱對蝦血細(xì)胞吞噬活性均顯著高于鹽度6 組對蝦（P＜0.05），鹽度18 組凡納濱對蝦血細(xì)胞吞噬活性明顯高于鹽度30 組，但沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 鹽度對凡納濱對蝦免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響

圖1 鹽度6 組凡納濱對蝦血細(xì)胞的吞噬圖Fig.1 Phagocytosis of blood cells of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei exposed to a salinity of 6

圖2 鹽度18 組凡納濱對蝦血細(xì)胞吞噬圖Fig.2 Blood cell phagocytosis of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in the salinity 18 group

圖3 鹽度30 組凡納濱對蝦血細(xì)胞吞噬圖Fig.3 Blood cell phagocytosis of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in the salinity 30 group

圖4 不同鹽度組凡納濱對蝦血細(xì)胞吞噬活性比較Fig.4 Comparison of blood cell phagocytic activity of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in different salinity groups

由表2、3、4 可知，鹽度30 組凡納濱對蝦肝胰腺組織中TLR、IMD、PO、CAT 及LZM 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度18 組凡納濱對蝦肝胰腺組織中TLR、IMD、PO、CAT、LZM 及SOD基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度30組對蝦肝胰腺組織中的TLR、IMD、PO 基因表達(dá)水平顯著低于鹽度18 組（P＜0.05）；鹽度30 組凡納濱對蝦血細(xì)胞中TLR、SOD 及LZM 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度18 組凡納濱對蝦血細(xì)胞中TLR、IMD、PO、SOD 及LZM 基因表達(dá)顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度30 組對蝦的TLR 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度18 組（P＜0.05），而鹽度30 組對蝦的PO 基因表達(dá)水平顯著低于鹽度18 組（P＜0.05）；鹽度30 組凡納濱對蝦鰓組織中TLR 和CAT 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組對蝦（P＜0.05）；鹽度18 組凡納濱對蝦鰓組織中CAT 和LZM 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度30 組對蝦鰓組織中的TLR 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度18 組（P＜0.05），而鹽度30 組對蝦的CAT 基因表達(dá)水平顯著低于鹽度18 組（P＜0.05）；其他因子基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。

3 討論

3.1 鹽度對凡納濱對蝦血細(xì)胞吞噬活性的影響

對蝦免疫系統(tǒng)主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫，細(xì)胞免疫主要指凋亡、封裝、吞噬和結(jié)節(jié)的形成[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同鹽度下，南美白對蝦血細(xì)胞對鰻弧菌的吞噬率明顯不同，鹽度18 組對蝦血細(xì)胞的吞噬率最大，鹽度6 組最小。

3.2 鹽度對南美白對蝦免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響

鹽度是影響甲殼動物非特異性免疫的重要生態(tài)因子。長期低鹽脅迫時(shí)，凡納濱對蝦肝胰腺差異表達(dá)cDNA 文庫中62.5%的免疫相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)[8]；高鹽顯著影響凡納濱對蝦的免疫相關(guān)酶活力，對不同組織中免疫酶活力的影響存在一定的組織特異性，50 以上的高鹽脅迫對對蝦免疫相關(guān)酶活力的影響尤為顯著[9]。

Toll 和IMD 信號傳導(dǎo)途徑是蝦體中調(diào)節(jié)先天免疫的重要免疫信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[10]。Toll 通路由Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）及其下游效應(yīng)因子如MyD88、TRIF、TRAM 和TRAF 等組成，機(jī)體內(nèi)的過氧化可以產(chǎn)生TLR 的內(nèi)源性配體，激活TLR[11,12]。IMD（免疫缺陷基因）途徑是對蝦的另一個重要免疫識別信號傳導(dǎo)通路，Toll 途徑響應(yīng)革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌的刺激，IMD 途徑則響應(yīng)革蘭氏陰性細(xì)菌的入侵[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，對蝦Toll 樣受體（TLR）基因和IMD 基因表達(dá)存在組織特異性。TLR 基因在對蝦肝胰腺和血細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)，在鰓中較弱，且受鹽度影響較大。鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺和血細(xì)胞中的TLR 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組，鹽度30組對蝦鰓中的TLR 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6組；IMD 基因在對蝦肝胰腺中表達(dá)較強(qiáng)，在鰓和血細(xì)胞中較弱，且鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺中的IMD 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組。

表2 鹽度對凡納濱對蝦肝胰腺免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響Tab.2 Effects of salinity on expression levels of immune-associated factor genes in hepatopancreas of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

表3 鹽度對凡納濱對蝦血細(xì)胞免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響Tab.3 Effects of salinity on expression levels of immune-associated factor genes in blood cells of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

表4 鹽度對凡納濱對蝦鰓免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響Tab.4 Effects of salinity on expression levels of immune-associated factor genes in gills of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

酚氧化酶以酶原形式存在于甲殼動物血細(xì)胞中，血細(xì)胞受刺激后將該酶原釋放到血淋巴中，并被激活。它與血細(xì)胞的吞噬、包囊以及血淋巴的抗菌活性和外源物質(zhì)的識別有關(guān)[13]。對蝦的酚氧化酶主要存在于大顆粒血細(xì)胞中，約占75%，小顆粒血細(xì)胞中僅有25%。透明細(xì)胞主要具有吞噬功能[14]。鹽度20 組凡納濱對蝦血細(xì)胞總數(shù)和血清酚氧化酶活力顯著高于鹽度5 組[15]。本研究中的酚氧化酶基因表達(dá)水平以對蝦肝胰腺最高，且鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺中的PO 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6組。

超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，二者相互作用可以清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過量氧自由基，對機(jī)體具有重要保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，不同組織中SOD 和CAT 基因表達(dá)差異較大，SOD 基因表達(dá)以對蝦血細(xì)胞最強(qiáng)，CAT基因表達(dá)以對蝦鰓組織最強(qiáng)，肝胰腺次之，血細(xì)胞最弱。鹽度對SOD 和CAT 基因的表達(dá)影響較大，鹽度30 和18 組對蝦血細(xì)胞中的SOD 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組，鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺和血細(xì)胞中的CAT 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組。

溶菌酶（LZM）是一種堿性蛋白，廣泛存在于體內(nèi)多種組織和體液中，是非特異性免疫系統(tǒng)的主要成分，在甲殼動物的免疫中起重要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺和血細(xì)胞中的LZM基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組，鹽度18 組對蝦鰓組織中的LZM 基因表達(dá)水平顯著高于鹽度6 組。

綜上，環(huán)境鹽度變化可能通過影響凡納濱對蝦各組織的抗氧化能力、溶菌活性、識別能力和血細(xì)胞吞噬活性等，調(diào)控凡納濱對蝦細(xì)胞免疫和體液免疫。