呂偉華，馬波，尹家勝，楊建，高雪，徐偉，張穎

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院海洋生物種業(yè)研究院，浙江 寧波 315100）

皮膚不僅是維持魚類體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的物理屏障，還是機(jī)體與外界水環(huán)境的一道重要免疫屏障，參與完成免疫防御、體液調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)感知以及繁殖活動(dòng)諸多生理活動(dòng)[1,2]。與其他脊椎動(dòng)物相似，魚類皮膚主要由不同類型的表皮層和真皮層構(gòu)成。表皮層主要由起源于外胚層的復(fù)扁平上皮細(xì)胞、黏液細(xì)胞、棒狀細(xì)胞和基底細(xì)胞組成，形成機(jī)體最外層的保護(hù)屏障；真皮層位于表皮層之下，主要為起源于中胚層間充質(zhì)的內(nèi)胚層，具有較強(qiáng)的增殖、再生和分化能力，為機(jī)體提供定向分化類型的細(xì)胞，如黏液細(xì)胞、色素細(xì)胞等[3,4]。與脊椎動(dòng)物不同，魚類皮膚表面覆蓋大量由黏液細(xì)胞分泌的黏液，含有的大量免疫因子等多種活性物質(zhì)，構(gòu)成了魚體與外界直接接觸的第一道門戶，在魚類整個(gè)生命過(guò)程中對(duì)機(jī)體的免疫防御起到至關(guān)重要的作用。一直以來(lái)，大多研究集中在黏液的組分和免疫機(jī)制等[5-8]，而對(duì)魚類皮膚組織學(xué)的報(bào)道較少，且主要集中在金魚Carassius auratus、鯉Cyprinus carpio、歐洲鰻鱺Anguill anguilla、大西洋鮭Salmon salar 等[9-15]。研究表明，種類及生境不同與魚類皮膚組織結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。

施氏鱘Acipenser schrenckii（又稱七粒浮子）是起源于億萬(wàn)年前的白堊紀(jì)時(shí)期較古老的魚類種群，具有水中“活化石”之稱[16]。施氏鱘主要分布于黑龍江、烏蘇里江和松花江等水域，是我國(guó)黑龍江流域重要的名貴經(jīng)濟(jì)魚類，其卵制備的鱘魚子醬經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，被譽(yù)為“黑色黃金”。20 世紀(jì)以來(lái)，酷撈濫捕、水利工程及水質(zhì)污染等導(dǎo)致施氏鱘的自然資源量急劇下降，已不能形成捕撈產(chǎn)量，主要分布于黑龍江中下游江段及河口[17-19]。為改善施氏鱘自然資源日益減少的現(xiàn)狀，20 世紀(jì)50 年代，我國(guó)開(kāi)展了施氏鱘全人工繁育的研究和養(yǎng)殖，經(jīng)過(guò)幾十年的不懈努力，實(shí)現(xiàn)了施氏鱘繁育與養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化，解決了施氏鱘人工養(yǎng)殖中的生物學(xué)技術(shù)問(wèn)題，對(duì)施氏鱘野生資源的增殖保護(hù)及養(yǎng)殖業(yè)健康有序發(fā)展提供了技術(shù)支撐[20]。

目前，對(duì)于施氏鱘的研究主要集中在形態(tài)、攝食、產(chǎn)卵洄游、增殖放流、繁殖、營(yíng)養(yǎng)、病害、免疫及與性狀相關(guān)的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等方面[21-26]，為施氏鱘的養(yǎng)護(hù)提供了充足的理論基礎(chǔ)，但關(guān)于其皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)及其在免疫防御中的作用迄今還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用常規(guī)石蠟切片和HE 染色方法，通過(guò)觀察1 齡施氏鱘皮膚各組分的結(jié)構(gòu)，以期為施氏鱘皮膚的生理學(xué)、病理學(xué)、養(yǎng)殖學(xué)等其他領(lǐng)域的科學(xué)研究提供形態(tài)學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1 齡實(shí)驗(yàn)魚5 尾，2019 年采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚繁育技術(shù)工程中心（北京房山），體表健康無(wú)傷，體質(zhì)量50～100 g，全長(zhǎng)28～36 cm。

1.2 方法

取施氏鱘頭部、上頜、背部和腹部皮膚樣品，切成5 mm×5 mm 的組織塊，于Bouins 液中固定24 h；水洗后，依次進(jìn)行50%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明和石蠟包埋后進(jìn)行組織切片,厚度5μm；經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，中性樹(shù)膠封片；待觀察。

于Leica AM6000 顯微鏡下觀察皮膚組織切片，采用LAS V4.6 軟件拍照；隨機(jī)取施氏鱘各部位皮膚組織切片各30 個(gè)視野樣本，測(cè)量表皮層和真皮層厚度，記錄整理數(shù)據(jù)。

黏液細(xì)胞計(jì)數(shù)：在顯微鏡10×40 視野下，隨機(jī)觀察不同部位各30 個(gè)視野中平切切片的黏液細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出每個(gè)視野面積下的平均黏液細(xì)胞個(gè)數(shù)和單位面積下的黏液細(xì)胞數(shù)（ind./mm2）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 23 統(tǒng)計(jì)軟件利用單因素方差分析（One-way analysis of variance,ANOVA）進(jìn)行分析，用Ducan’s 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為顯著性判別標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 施氏鱘皮膚組織學(xué)觀察

施氏鱘各部位皮膚組織結(jié)構(gòu)相似，主要由表皮層和真皮層組成。表皮層主要由上皮細(xì)胞、黏液細(xì)胞和棒狀細(xì)胞組成，黏液細(xì)胞為球形，數(shù)量因體位而異，頭部皮膚黏液細(xì)胞的數(shù)量較其他部位較少；棒狀細(xì)胞為單層細(xì)胞，整齊規(guī)則緊密地排列在基底層上。頭部和背部的皮膚中含有黑色素細(xì)胞層，形成和分泌大量的黑色素，使這兩個(gè)部位的皮膚呈黑色；下頜和腹部皮膚缺少黑色素細(xì)胞層，其顏色為白色，這與施氏鱘體色的分布一致。真皮層由疏松層和致密層組成，致密層中含有豐富的血管（圖版Ⅰ）。

2.2 施氏鱘皮膚厚度測(cè)量

施氏鱘皮膚表皮層厚約25～70 μm，較真皮層薄，真皮層厚約120～230 μm。下頜表皮層和真皮層最厚，頭部最薄。下頜部表皮層的厚度與其他三個(gè)部位明顯不同（P＜0.05），其他三個(gè)部位間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）；下頜部位真皮層與其他三個(gè)部位具有明顯的差異性（P＜0.05），而頭部和腹部間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 黏液細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)

根據(jù)HE 染色和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，施氏鱘體表皮膚黏液細(xì)胞多為球形。施氏鱘腹部皮膚的黏液細(xì)胞數(shù)目最多，為670 ind./mm2，其次為背部和下頜，分別為570 ind./mm2和469 ind./mm2，頭背部的黏液細(xì)胞數(shù)目最少為436 個(gè)（表1）。

圖版Ⅰ 施氏鱘不同部位皮膚組織顯微結(jié)構(gòu)Plate Ⅰ Histological microscopic structure of the skin in Amur sturgeon

3 討論

皮膚作為機(jī)體最大的免疫器官對(duì)病原體的應(yīng)答和免疫防御中發(fā)揮重要的作用。研究證實(shí)，動(dòng)物的生境和進(jìn)化地位等方面的原因，不同類群的動(dòng)物皮膚的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)存在著異同，皮膚的生理結(jié)構(gòu)差異可能是不同生境動(dòng)物對(duì)生存環(huán)境適應(yīng)性的表現(xiàn)。

本研究中，施氏鱘不同部位的皮膚與其他魚類的皮膚組織結(jié)構(gòu)基本相似，均由表皮層、真皮疏松層和真皮致密層組成，但其皮膚的表皮細(xì)胞層數(shù)較少，且真皮層中含有豐富的血管，這種結(jié)構(gòu)有利于皮膚與外界進(jìn)行氣體交換。施氏鱘不同部位皮膚的組成成分在結(jié)構(gòu)和厚度上存在明顯差異，充分體現(xiàn)了組織特點(diǎn)和行使功能密切相關(guān)的特性。施氏鱘頭部皮膚厚度最薄，主要原因是頭部皮膚下面有較硬的頭骨保護(hù)腦組織。施氏鱘作為典型的底棲魚類，雖然其頜部和腹部長(zhǎng)期接觸水底，但皮膚厚度差異較大，這與蔣鑫等[27]對(duì)松江鱸Trachidermus fasciatus 的研究結(jié)果不完全一致，可能是施氏鱘作為大型底棲魚類，較其他中小型底棲魚類的活動(dòng)能力弱，腹部皮膚與水底的摩擦力相對(duì)較少有關(guān)。研究表明，包括施氏鱘在內(nèi)的鱘科魚類吻部腹面兩側(cè)存在大量的壺腹器官，而本次取樣位置為頜正下方，因此沒(méi)有觀察到該結(jié)構(gòu)[28,29]。

黏液細(xì)胞位于皮膚的表皮層，外形多樣，如球狀、杯狀、棒狀及長(zhǎng)頸瓶狀等。不同種類魚的黏液細(xì)胞形狀不同，施氏鱘皮膚中僅觀察到球形的黏液細(xì)胞，其他魚類皮膚中往往多種形狀的黏液細(xì)胞并存，如斑鱧Channa maculatus 的皮膚有三種不同形態(tài)的黏液細(xì)胞，歐洲鰻鱺和鯉以Ⅳ型細(xì)胞為主[15,30,31]。魚黏液細(xì)胞能向體表分泌大量黏液，其含有多種活性物質(zhì)，如粘多糖、糖蛋白、免疫球蛋白和各種水解性酶類，為保護(hù)魚體、抵御外界病原微生物入侵的第一道屏障，對(duì)魚體進(jìn)行保護(hù)防御，使其具有一定的免疫功能。施氏鱘頭部皮膚的黏液細(xì)胞數(shù)量最少，每單位面積436 個(gè)，腹部皮膚最多可達(dá)670 個(gè)，而松江鱸腹部最多為209 個(gè)，黃顙魚Pelteobagrus Fulvidraco、葛氏鱸塘鱧Perccottus glenii、泥鰍Misgurnus anguillicaudatus 各部位皮膚的黏液細(xì)胞數(shù)量均不足100 個(gè)[27,32]，由此看來(lái)，黏液細(xì)胞的種類和數(shù)量與魚的種類及分布部位都有一定的關(guān)系。施氏鱘表皮層的基底細(xì)胞層之上為長(zhǎng)柱狀的棒狀細(xì)胞層，細(xì)胞排列緊密規(guī)則，棒狀細(xì)胞既能促進(jìn)黏液形成，又能分泌一種警戒物質(zhì)，行使防范和警戒作用[11]。眾所周知，鱘具有抗病能力強(qiáng)的特性，鱘疾病主要發(fā)生在稚魚開(kāi)口期和幼魚轉(zhuǎn)食期，細(xì)菌性疾病為主[33,34]。鱘鰉魚受病害影響的報(bào)道比較少，可能原因?yàn)槭┦削\皮膚表皮層含有大量的黏液細(xì)胞和棒狀細(xì)胞，能夠分泌大量的黏液至體表，形成魚機(jī)體保護(hù)第一道屏障，對(duì)其整個(gè)生理過(guò)程起著至關(guān)重要的作用。