劉 濤，王 瑞

(信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽 464000)

0 引言

茶皂素屬于皂素類，是由茶葉籽提取出來較復(fù)雜的糖式化合物，同時也是一種良好的表面活性劑。茶皂素的應(yīng)用開發(fā)非常廣泛，在日用化工、醫(yī)藥、養(yǎng)殖上均有應(yīng)用。研究將茶皂素配制成不同濃度試劑，研究其對豫南地區(qū)分離到的豬源大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌及沙門氏菌的抑菌效果，為開發(fā)茶皂素抑菌試劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌種由信陽農(nóng)林學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存；茶皂素(60%)購自山東優(yōu)索化工科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、葡萄球菌選擇性瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂購自青島海博生物有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺(SW-CJ-2F， 蘇州凈化有限公司)、恒溫生化培養(yǎng)箱(250B，常州市華普達教學(xué)儀器有限公司)。

1.3 茶皂素抑菌效果測定

1.3.1 菌種的活化

將實驗室保存的大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌菌種接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基上，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。

1.3.2 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

將活化好的大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌進行革蘭氏染色，鏡檢。

1.3.3 藥敏片制備

取雙圈定性濾紙用打孔器打成6 mm直徑的紙片備用。每10片放置于潔凈青霉素瓶中，然后用干凈紗布封口，經(jīng)121℃高壓20 min滅菌，再放入37℃恒溫生化培養(yǎng)箱烘干直至干燥。稱取0.5 g、0.6 g、0.7 g、0.8 g、0.9 g、1 g、1.5 g茶皂素，分別加1 mL滅菌蒸餾水進行溶解，將溶解后的茶皂素溶液緩慢倒入裝有藥敏片的瓶中。

1.3.4 菌懸液制備與含菌培養(yǎng)基制備

菌懸液的制備：將大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌用滅菌接種環(huán)挑取單個菌落，分別選取3支試管對細(xì)菌進行倍比稀釋。

含菌培養(yǎng)基的制備：把高壓滅菌好的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，放置在超凈臺冷卻。然后把稀釋倍數(shù)為10-3的菌液用移液槍抽取30 μL傾注培養(yǎng)基中，并用滅菌涂菌棒將菌液涂布均勻，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果，備用。

1.3.5 藥敏試驗

將不同濃度(0.5～0.9 g/mL)的含茶皂素藥敏片，用滅菌鑷子取出，呈十字形貼布，濃度為1 g/mL、1.5 g/mL的含茶皂素藥敏片呈一字形貼布，每種細(xì)菌對應(yīng)2個營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)蘇菌種革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

復(fù)蘇菌種革蘭氏染色鏡檢結(jié)果，如圖1所示。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

從抑菌圈直徑測定結(jié)果可知，60%茶皂素對大腸桿菌和葡萄球菌具有抑菌效果，而沙門氏菌、鏈球菌具有較強的耐藥性，藥敏結(jié)果，如圖2、表1所示。

圖1 復(fù)蘇菌種革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

圖2 藥敏試驗結(jié)果

表1 60%茶皂素對細(xì)菌敏感性

3 討論

通過本次茶皂素藥敏試驗結(jié)果可知，60%茶皂素配制成1 g/mL、1.5 g/mL濃度時，對大腸桿菌有明顯抑菌效果，但配制各濃度的茶皂素制劑，對葡萄球菌、沙門氏菌和鏈球菌均無抑菌效果。而2013年游瑞云[1]等茶皂素的抑菌性能研究，結(jié)果顯示，大腸桿菌和葡萄球菌在57%的茶皂素中濃度為10 mg/mL，大腸桿菌抑菌圈直徑為10 mm，對葡萄球菌無抑菌效果，而在98%茶皂素中(濃度為10 mg/mL)葡萄球菌出現(xiàn)最低抑菌效果(10 mm)。而2014年馬戎[2]茶籽餅茶皂素提取及抑菌效果的研究，結(jié)果顯示，茶皂素對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制作用，但對金黃色葡萄球菌抑制作用較小。而2019年郭海陽[3]等茶皂素的美白功效及其抑菌和抗氧化活性研究，結(jié)果顯示，茶皂素溶液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，對黑曲霉的抑菌效果較弱，對沙門氏菌無抑制作用。

通過本試驗結(jié)果和前期相關(guān)研究結(jié)論表明，茶皂素對豫南地區(qū)豬場分離到的部分常見病原菌，抑菌效果表現(xiàn)均不相同，抑制效果對濃度表現(xiàn)出較明顯依賴性，對大腸桿菌的抑菌效果最為明顯，而其他菌種的抑菌效果較弱。李金洪[4]推測茶皂素表面活性作用改變了細(xì)胞膜的通透性，進而萜類物質(zhì)破壞細(xì)胞內(nèi)構(gòu)造和酶系統(tǒng)，同時，茶皂素水解后產(chǎn)生的有機酸使細(xì)胞內(nèi)液酸化，破壞各細(xì)胞器的正常功能與代謝。相對于革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁具有較厚而致密的肽聚糖層，這個可能也是茶皂素在革蘭氏陰性菌的抑菌性上優(yōu)于革蘭氏陽性菌的原因之一。

根據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)：截至2019年我國油茶籽產(chǎn)量285萬t，油茶籽中含有12%～18%的茶皂素，因此每年可生產(chǎn)34.2萬～ 51.3萬t茶皂素。目前茶皂素主要用于輕工、化工、農(nóng)藥、飼料、養(yǎng)殖、紡織、采油、采礦、建材與高速公路建設(shè)等方面。2020年7月1起，飼料生產(chǎn)企業(yè)禁止在飼料中添加藥物性飼料添加劑，中國正式進入飼料禁抗時代，尋找可部分替代抗生素的產(chǎn)品是大勢所趨。歐洲是世界上最早提出飼料無抗的地區(qū)。通過總結(jié)他們在無抗飼料方面的經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，禁抗后第一年料肉比升高、治療用藥量增加，尤其是關(guān)節(jié)炎和腹瀉治療用藥增加明顯，這一現(xiàn)象大約會持續(xù)1年。茶皂素本身是一種優(yōu)良的天然表面活性劑，如果能夠?qū)⒉柙硭亻_發(fā)成綠色抑菌制劑，用于產(chǎn)房環(huán)境消毒和母豬產(chǎn)前體表護理劑，大大減少目前各種化學(xué)消毒劑的使用，有利于環(huán)境生態(tài)安全，同時可提高油茶加工企業(yè)產(chǎn)品附加值。