樊 麗

（國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心，廣東 廣州 510000）

三葉青（Tetrastigmatis hemsleyaniDiels et Gilg），又叫蛇附子、金線吊葫蘆，為葡萄科崖爬藤屬植物，全草均可入藥，是我國(guó)特有的珍稀藥用植物，具有清熱解毒、活血祛風(fēng)、清除體內(nèi)自由基、雙向提高人體免疫力的功效，有非常高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]；但三葉青對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，不易人工種植，資源有限。本文旨在通過(guò)對(duì)目前國(guó)內(nèi)三葉青栽培技術(shù)的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，梳理三葉青人工栽培技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)，以期對(duì)我國(guó)三葉青人工栽培技術(shù)的發(fā)展方向和專利保護(hù)提供參考。

1 三葉青人工栽培技術(shù)的專利申請(qǐng)情況

圖1示出了三葉青人工栽培技術(shù)相關(guān)專利在2002-2021年間的申請(qǐng)數(shù)量，三葉青人工栽培技術(shù)專利申請(qǐng)?jiān)?014年之前數(shù)量較少，發(fā)展緩慢，從2014年開始專利申請(qǐng)數(shù)量激增，并基本保持穩(wěn)定，而2021年專利申請(qǐng)數(shù)量較少則與部分申請(qǐng)文件尚未公開有關(guān)；總體來(lái)看，三葉青的人工栽培技術(shù)研究尚處于初期，仍具有廣闊的研究開發(fā)前景。

圖1 三葉青人工栽培技術(shù)相關(guān)專利申請(qǐng)量趨勢(shì)（圖源：incoPat）

另外，通過(guò)對(duì)申請(qǐng)人類型統(tǒng)計(jì)分析可知，大專院校和科研單位作為申請(qǐng)人的專利申請(qǐng)量占相關(guān)專利申請(qǐng)總量的45.7%，企業(yè)次之，占40.86%。由此可見，國(guó)內(nèi)科研院所和相關(guān)企業(yè)仍為三葉青人工栽培技術(shù)的主要研發(fā)單位，也進(jìn)一步從側(cè)面說(shuō)明了三葉青的人工栽培技術(shù)研究還處于起步階段。

三葉青人工栽培專利技術(shù)排名前十位的申請(qǐng)人主要集中于浙江地區(qū)；申請(qǐng)量排名第一的申請(qǐng)人為上饒師范學(xué)院，其申請(qǐng)時(shí)間主要為2018年和2021年，技術(shù)方向主要為三葉青組培技術(shù)，涉及組培苗脫毒方法、試管苗離體保存方法、組培苗移栽馴化容器、接種工具的改進(jìn)等；而申請(qǐng)量次之的杭州中墾生物科技有限公司的專利申請(qǐng)則集中于2017年，技術(shù)方向?yàn)槿~青人工栽培相關(guān)設(shè)備如營(yíng)養(yǎng)缽、支架、大棚、灌溉設(shè)備、施肥裝置等的改進(jìn)；而浙江農(nóng)林大學(xué)則在2015-2020年持續(xù)進(jìn)行專利申請(qǐng)，主要涉及三葉青的人工快繁技術(shù)研究，包括扦插育苗、立體栽培、組培培養(yǎng)基的改良等。

2 三葉青人工栽培技術(shù)發(fā)展脈絡(luò)

三葉青的藥用價(jià)值高，含有多種活性物質(zhì)，國(guó)內(nèi)早期對(duì)三葉青的研究主要集中于對(duì)其藥效的探索、生藥學(xué)鑒定以及化學(xué)成分分析等方面，對(duì)其人工栽培技術(shù)研究甚少，文章從專利和非專利兩個(gè)方面對(duì)三葉青人工栽培技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)進(jìn)行梳理。

2.1 專利技術(shù)發(fā)展

國(guó)內(nèi)最早關(guān)于三葉青人工栽培技術(shù)的專利申請(qǐng)為2005年浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院徐剛等[2]人提出的一種金絲吊葫蘆的人工快速繁殖方法，該方法采用金絲吊葫蘆的藤條作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)組培苗生根，并利用組培苗作為母本再通過(guò)扦插方式大量繁殖金絲吊葫蘆種苗，其充分利用植物組織培養(yǎng)、扦插快繁技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在短期內(nèi)快速大量繁殖金絲吊葫蘆種苗，可實(shí)行規(guī)?；a(chǎn)，為金絲吊葫蘆的產(chǎn)品深度系列開發(fā)提供種苗基礎(chǔ)。

2007年，浙江大學(xué)的姜維梅等[3]提出的一種三葉青的組培快速繁殖方法，選擇完整的三葉青腋芽為培養(yǎng)材料，通過(guò)組培快繁技術(shù)培育三葉青種苗，在組培過(guò)程中進(jìn)行脫毒處理，提高了三葉青的品質(zhì)，并獲得了較高的大田存活率；且該快繁方法使得三葉青的生產(chǎn)可以在人為控制條件下進(jìn)行，同時(shí)提高了增殖速度，縮短生產(chǎn)周期，便于工廠化生產(chǎn)，解決了三葉青快速繁殖和穩(wěn)定生根的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，達(dá)到技術(shù)穩(wěn)定、繁殖系數(shù)高的要求。在接下來(lái)的十幾年間，浙江大學(xué)、浙江農(nóng)林大學(xué)、杭州中澤生物科技有限公司、杭州木木生物科技有限公司、上饒師范學(xué)院等申請(qǐng)人均對(duì)三葉青組織培養(yǎng)快速繁殖的方法進(jìn)行了優(yōu)化，包括培養(yǎng)基配方的調(diào)整、外植體的選擇、組培容器的改進(jìn)等，其主要目的在于縮短種苗繁育周期，利于大面積生產(chǎn)和保護(hù)野生三葉青種質(zhì)資源。

2010年，浙江省中醫(yī)藥研究院浦錦寶等[4]人提出了一種三葉青的人工栽培方法，利用三葉青是草質(zhì)藤本，地上部分生物量較大，且節(jié)上生有多數(shù)不定根的特點(diǎn)，采用扦插法栽培三葉青，該方法操作簡(jiǎn)便，栽培后的三葉青成活率高，適應(yīng)性強(qiáng)，成長(zhǎng)周期短，產(chǎn)量高。近十年來(lái)，不同申請(qǐng)人對(duì)三葉青扦插繁殖的枝條選擇、激素處理、基質(zhì)選擇、環(huán)境等條件進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，旨在提高扦插育苗的成活率、生根率、結(jié)塊速度和結(jié)塊率等。

2012年，麗水市蓮都區(qū)綠谷三葉青珍稀植物研究所的吉慶勇等人[5]采用三葉青地下藥用塊莖繁殖法，利用三葉青地下藥用部分，通過(guò)低溫沙藏解除休眠和大棚催芽、大田移栽技術(shù)，具有繁殖快、成本低、成苗率高、腐爛率低等優(yōu)點(diǎn)，突破了三葉青原有繁殖技術(shù)僅僅局限在地上部分藤扦插，易出現(xiàn)退化、品種特性不穩(wěn)定，組織培養(yǎng)投資大、需專業(yè)人員等的技術(shù)缺陷問題。

2014年，福建農(nóng)林大學(xué)潘大仁等人[6]提出了一種中藥材三葉青的林下栽培方法，其選擇喬木混交林地間栽培三葉青，充分利用林地空間資源，增加林地覆蓋率，提高土地使用率和產(chǎn)量效益，通過(guò)在自然環(huán)境下栽培三葉青，增強(qiáng)三葉青的抗逆性，在較短時(shí)間內(nèi)獲得高品質(zhì)、高產(chǎn)量的三葉青塊根，實(shí)現(xiàn)降低栽培成本，提高經(jīng)濟(jì)效益的目的。在接下來(lái)的七年間，多名申請(qǐng)人對(duì)三葉青的仿野生林下栽培技術(shù)進(jìn)行探索研究，包括選擇不同的樹林種植，優(yōu)化林下種植條件，將林下栽培與扦插育苗、袋式栽培、基質(zhì)、光溫控制等結(jié)合，以達(dá)到提高三葉青塊根產(chǎn)量、有效成分（黃酮）的含量等效果。

由于三葉青種子產(chǎn)量較少，且是多年生植物，有性繁殖慢，因此，關(guān)于三葉青有性繁殖的研究并不多。2015年，浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校的彭昕等人[7]利用三葉青的地下塊莖及周圍生境促進(jìn)其種子萌發(fā)的特性，在基質(zhì)中添加由三葉青母本地下塊莖制成的促萌芽物質(zhì)，進(jìn)行催芽，提高了種子萌芽率，為三葉青雜交育種、品種選育、種苗繁育等方面的研究奠定基礎(chǔ)；同年，廣西壯族自治區(qū)藥用植物園的韋榮昌[8]將溫水浸種、恒溫培養(yǎng)、光照和黑暗交替處理種子與浸種劑浸泡相結(jié)合，采用多種手段聯(lián)合處理三葉青種子，有效打破種子休眠，提高發(fā)芽率。

2.2 非專利技術(shù)發(fā)展

2007年鐘毓倩[9]最早提出了三葉青組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究，其通過(guò)對(duì)三葉青不同部位的外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，并獲得了最佳誘導(dǎo)外植體、最佳初代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，其試驗(yàn)結(jié)果表明6-BA在三葉青的繼代培養(yǎng)中的作用可以忽略不計(jì)；之后的十幾年間，也有不少學(xué)者致力于三葉青的組培研究，主要包括三葉青愈傷組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化，不同光溫條件下三葉青組培苗的酶活性、有效成分含量的變化、高效快繁技術(shù)體系建立、規(guī)?；绲?。

1999年，江云岫[10]提出可以剪取藤莖扦插繁殖三葉青，但其并未對(duì)扦插繁殖的具體細(xì)節(jié)進(jìn)行深入研究；2011年，吉慶勇等人[11]采用扦插方法繁殖三葉青，其研究了生根劑、插穗年齡和基質(zhì)對(duì)插穗生根的影響，結(jié)果表明，生根劑和插穗年齡對(duì)插穗生根的影響明顯，基質(zhì)對(duì)插生根的影響不明顯，2年生老枝采用1000mg/L的IBA浸漬10s后扦插于黃土中生根效果最佳。另外，扦插繁殖具有材料來(lái)源廣泛、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，因此，不同學(xué)者將扦插繁殖的方式應(yīng)用于研究不同種源三葉青的特性、引種馴化栽培以及林下仿野生栽培中，達(dá)到種苗繁育的目的。

林下仿野生栽培，將中藥材三葉青種植在近似于野生條件的林下，可利用林地天然的遮陰優(yōu)勢(shì)和環(huán)境條件，提高地塊利用率和經(jīng)濟(jì)效益。程良綏[12]在2014年提出了一種三葉青林下栽培技術(shù)，其采用扦插育苗技術(shù)，將三葉青種苗定植在林下，種植三年后，三葉青進(jìn)入成熟期；2014-2021年間，三葉青的林下栽培技術(shù)發(fā)展迅速，部分研究人員還對(duì)三葉青的果藥套種、竹林套種等進(jìn)行了研究，以探索最佳的林下種植模式，提高林業(yè)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。

而除了仿野生栽培，隨著溫室大棚技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)設(shè)施栽培來(lái)精確控制栽培作物的生長(zhǎng)環(huán)境條件，以實(shí)現(xiàn)人工集約化栽培也是目前作物栽培的發(fā)展方向之一。葉子飄等[13]2018年對(duì)設(shè)施栽培條件下三葉青葉片適宜光強(qiáng)進(jìn)行研究，結(jié)論表明三葉青為典型的陰生植物，設(shè)施大棚中種植，其最適宜光強(qiáng)在400μmol/m2·s左右，其為三葉青的設(shè)施大棚種植提供了理論依據(jù)。但由于設(shè)施栽培對(duì)成本、人力以及環(huán)境控制要求較高，目前針對(duì)三葉青設(shè)施栽培的研究并不多，仍處于探索階段。

3 結(jié)束語(yǔ)

目前三葉青的人工栽培技術(shù)研究主要致力于種苗繁育和大田栽培；種苗繁育的主要方式為扦插繁殖和組織培養(yǎng)，雖然組織培養(yǎng)繁殖的研究較早，但近年來(lái)，三葉青扦插繁殖的方法逐漸增多，已超過(guò)組織培養(yǎng)快繁，這是由于扦插繁殖對(duì)種苗培養(yǎng)的條件要求更低，操作更簡(jiǎn)便，普及性更強(qiáng)；另外，林下仿野生栽培和扦插繁殖等種苗繁育技術(shù)相結(jié)合，也是目前三葉青人工栽培較常用的方法，該栽培方式顯著提高了土地資源利用率和經(jīng)濟(jì)效益；設(shè)施栽培雖有少量研究，但仍然處于探索階段。

今后對(duì)于三葉青人工栽培技術(shù)的研究，可從擴(kuò)大種苗生產(chǎn)、提高塊根產(chǎn)量和品質(zhì)，增加有效成分（如黃酮）含量等方面出發(fā)，對(duì)栽培地點(diǎn)、栽培材料、環(huán)境條件、栽培基質(zhì)和栽培容器等影響三葉青生長(zhǎng)的因素進(jìn)行優(yōu)化；另外，在人工擴(kuò)大栽培時(shí)，應(yīng)注意最大限度地保留其藥性；另外，可以充分利用設(shè)施栽培能夠精準(zhǔn)控制環(huán)境條件，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模人工集約化栽培的特點(diǎn)，加大對(duì)三葉青設(shè)施栽培的研究力度，并對(duì)研究成果及時(shí)進(jìn)行專利保護(hù)，提升專利轉(zhuǎn)化能力。