樊 麗

（國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心，廣東 廣州 510000）

三葉青（Tetrastigmatis hemsleyaniDiels et Gilg），又叫蛇附子、金線吊葫蘆，為葡萄科崖爬藤屬植物，全草均可入藥，是我國特有的珍稀藥用植物，具有清熱解毒、活血祛風、清除體內(nèi)自由基、雙向提高人體免疫力的功效，有非常高的藥用價值和經(jīng)濟價值[1]；但三葉青對生長環(huán)境要求苛刻，不易人工種植，資源有限。本文旨在通過對目前國內(nèi)三葉青栽培技術(shù)的相關(guān)文獻進行綜述，梳理三葉青人工栽培技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)，以期對我國三葉青人工栽培技術(shù)的發(fā)展方向和專利保護提供參考。

1 三葉青人工栽培技術(shù)的專利申請情況

圖1示出了三葉青人工栽培技術(shù)相關(guān)專利在2002-2021年間的申請數(shù)量，三葉青人工栽培技術(shù)專利申請在2014年之前數(shù)量較少，發(fā)展緩慢，從2014年開始專利申請數(shù)量激增，并基本保持穩(wěn)定，而2021年專利申請數(shù)量較少則與部分申請文件尚未公開有關(guān)；總體來看，三葉青的人工栽培技術(shù)研究尚處于初期，仍具有廣闊的研究開發(fā)前景。

圖1 三葉青人工栽培技術(shù)相關(guān)專利申請量趨勢（圖源：incoPat）

另外，通過對申請人類型統(tǒng)計分析可知，大專院校和科研單位作為申請人的專利申請量占相關(guān)專利申請總量的45.7%，企業(yè)次之，占40.86%。由此可見，國內(nèi)科研院所和相關(guān)企業(yè)仍為三葉青人工栽培技術(shù)的主要研發(fā)單位，也進一步從側(cè)面說明了三葉青的人工栽培技術(shù)研究還處于起步階段。

三葉青人工栽培專利技術(shù)排名前十位的申請人主要集中于浙江地區(qū)；申請量排名第一的申請人為上饒師范學院，其申請時間主要為2018年和2021年，技術(shù)方向主要為三葉青組培技術(shù)，涉及組培苗脫毒方法、試管苗離體保存方法、組培苗移栽馴化容器、接種工具的改進等；而申請量次之的杭州中墾生物科技有限公司的專利申請則集中于2017年，技術(shù)方向為三葉青人工栽培相關(guān)設(shè)備如營養(yǎng)缽、支架、大棚、灌溉設(shè)備、施肥裝置等的改進；而浙江農(nóng)林大學則在2015-2020年持續(xù)進行專利申請，主要涉及三葉青的人工快繁技術(shù)研究，包括扦插育苗、立體栽培、組培培養(yǎng)基的改良等。

2 三葉青人工栽培技術(shù)發(fā)展脈絡(luò)

三葉青的藥用價值高，含有多種活性物質(zhì)，國內(nèi)早期對三葉青的研究主要集中于對其藥效的探索、生藥學鑒定以及化學成分分析等方面，對其人工栽培技術(shù)研究甚少，文章從專利和非專利兩個方面對三葉青人工栽培技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)進行梳理。

2.1 專利技術(shù)發(fā)展

國內(nèi)最早關(guān)于三葉青人工栽培技術(shù)的專利申請為2005年浙江省農(nóng)業(yè)科學院徐剛等[2]人提出的一種金絲吊葫蘆的人工快速繁殖方法，該方法采用金絲吊葫蘆的藤條作為外植體進行組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)組培苗生根，并利用組培苗作為母本再通過扦插方式大量繁殖金絲吊葫蘆種苗，其充分利用植物組織培養(yǎng)、扦插快繁技術(shù)優(yōu)勢，在短期內(nèi)快速大量繁殖金絲吊葫蘆種苗，可實行規(guī)?；a(chǎn)，為金絲吊葫蘆的產(chǎn)品深度系列開發(fā)提供種苗基礎(chǔ)。

2007年，浙江大學的姜維梅等[3]提出的一種三葉青的組培快速繁殖方法，選擇完整的三葉青腋芽為培養(yǎng)材料，通過組培快繁技術(shù)培育三葉青種苗，在組培過程中進行脫毒處理，提高了三葉青的品質(zhì)，并獲得了較高的大田存活率；且該快繁方法使得三葉青的生產(chǎn)可以在人為控制條件下進行，同時提高了增殖速度，縮短生產(chǎn)周期，便于工廠化生產(chǎn)，解決了三葉青快速繁殖和穩(wěn)定生根的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，達到技術(shù)穩(wěn)定、繁殖系數(shù)高的要求。在接下來的十幾年間，浙江大學、浙江農(nóng)林大學、杭州中澤生物科技有限公司、杭州木木生物科技有限公司、上饒師范學院等申請人均對三葉青組織培養(yǎng)快速繁殖的方法進行了優(yōu)化，包括培養(yǎng)基配方的調(diào)整、外植體的選擇、組培容器的改進等，其主要目的在于縮短種苗繁育周期，利于大面積生產(chǎn)和保護野生三葉青種質(zhì)資源。

2010年，浙江省中醫(yī)藥研究院浦錦寶等[4]人提出了一種三葉青的人工栽培方法，利用三葉青是草質(zhì)藤本，地上部分生物量較大，且節(jié)上生有多數(shù)不定根的特點，采用扦插法栽培三葉青，該方法操作簡便，栽培后的三葉青成活率高，適應(yīng)性強，成長周期短，產(chǎn)量高。近十年來，不同申請人對三葉青扦插繁殖的枝條選擇、激素處理、基質(zhì)選擇、環(huán)境等條件進行優(yōu)化調(diào)整，旨在提高扦插育苗的成活率、生根率、結(jié)塊速度和結(jié)塊率等。

2012年，麗水市蓮都區(qū)綠谷三葉青珍稀植物研究所的吉慶勇等人[5]采用三葉青地下藥用塊莖繁殖法，利用三葉青地下藥用部分，通過低溫沙藏解除休眠和大棚催芽、大田移栽技術(shù)，具有繁殖快、成本低、成苗率高、腐爛率低等優(yōu)點，突破了三葉青原有繁殖技術(shù)僅僅局限在地上部分藤扦插，易出現(xiàn)退化、品種特性不穩(wěn)定，組織培養(yǎng)投資大、需專業(yè)人員等的技術(shù)缺陷問題。

2014年，福建農(nóng)林大學潘大仁等人[6]提出了一種中藥材三葉青的林下栽培方法，其選擇喬木混交林地間栽培三葉青，充分利用林地空間資源，增加林地覆蓋率，提高土地使用率和產(chǎn)量效益，通過在自然環(huán)境下栽培三葉青，增強三葉青的抗逆性，在較短時間內(nèi)獲得高品質(zhì)、高產(chǎn)量的三葉青塊根，實現(xiàn)降低栽培成本，提高經(jīng)濟效益的目的。在接下來的七年間，多名申請人對三葉青的仿野生林下栽培技術(shù)進行探索研究，包括選擇不同的樹林種植，優(yōu)化林下種植條件，將林下栽培與扦插育苗、袋式栽培、基質(zhì)、光溫控制等結(jié)合，以達到提高三葉青塊根產(chǎn)量、有效成分（黃酮）的含量等效果。

由于三葉青種子產(chǎn)量較少，且是多年生植物，有性繁殖慢，因此，關(guān)于三葉青有性繁殖的研究并不多。2015年，浙江醫(yī)藥高等專科學校的彭昕等人[7]利用三葉青的地下塊莖及周圍生境促進其種子萌發(fā)的特性，在基質(zhì)中添加由三葉青母本地下塊莖制成的促萌芽物質(zhì)，進行催芽，提高了種子萌芽率，為三葉青雜交育種、品種選育、種苗繁育等方面的研究奠定基礎(chǔ)；同年，廣西壯族自治區(qū)藥用植物園的韋榮昌[8]將溫水浸種、恒溫培養(yǎng)、光照和黑暗交替處理種子與浸種劑浸泡相結(jié)合，采用多種手段聯(lián)合處理三葉青種子，有效打破種子休眠，提高發(fā)芽率。

2.2 非專利技術(shù)發(fā)展

2007年鐘毓倩[9]最早提出了三葉青組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究，其通過對三葉青不同部位的外植體進行誘導(dǎo)，并獲得了最佳誘導(dǎo)外植體、最佳初代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，其試驗結(jié)果表明6-BA在三葉青的繼代培養(yǎng)中的作用可以忽略不計；之后的十幾年間，也有不少學者致力于三葉青的組培研究，主要包括三葉青愈傷組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化，不同光溫條件下三葉青組培苗的酶活性、有效成分含量的變化、高效快繁技術(shù)體系建立、規(guī)模化育苗等。

1999年，江云岫[10]提出可以剪取藤莖扦插繁殖三葉青，但其并未對扦插繁殖的具體細節(jié)進行深入研究；2011年，吉慶勇等人[11]采用扦插方法繁殖三葉青，其研究了生根劑、插穗年齡和基質(zhì)對插穗生根的影響，結(jié)果表明，生根劑和插穗年齡對插穗生根的影響明顯，基質(zhì)對插生根的影響不明顯，2年生老枝采用1000mg/L的IBA浸漬10s后扦插于黃土中生根效果最佳。另外，扦插繁殖具有材料來源廣泛、操作簡單的特點，因此，不同學者將扦插繁殖的方式應(yīng)用于研究不同種源三葉青的特性、引種馴化栽培以及林下仿野生栽培中，達到種苗繁育的目的。

林下仿野生栽培，將中藥材三葉青種植在近似于野生條件的林下，可利用林地天然的遮陰優(yōu)勢和環(huán)境條件，提高地塊利用率和經(jīng)濟效益。程良綏[12]在2014年提出了一種三葉青林下栽培技術(shù)，其采用扦插育苗技術(shù)，將三葉青種苗定植在林下，種植三年后，三葉青進入成熟期；2014-2021年間，三葉青的林下栽培技術(shù)發(fā)展迅速，部分研究人員還對三葉青的果藥套種、竹林套種等進行了研究，以探索最佳的林下種植模式，提高林業(yè)經(jīng)濟和生態(tài)效益。

而除了仿野生栽培，隨著溫室大棚技術(shù)的發(fā)展，通過設(shè)施栽培來精確控制栽培作物的生長環(huán)境條件，以實現(xiàn)人工集約化栽培也是目前作物栽培的發(fā)展方向之一。葉子飄等[13]2018年對設(shè)施栽培條件下三葉青葉片適宜光強進行研究，結(jié)論表明三葉青為典型的陰生植物，設(shè)施大棚中種植，其最適宜光強在400μmol/m2·s左右，其為三葉青的設(shè)施大棚種植提供了理論依據(jù)。但由于設(shè)施栽培對成本、人力以及環(huán)境控制要求較高，目前針對三葉青設(shè)施栽培的研究并不多，仍處于探索階段。

3 結(jié)束語

目前三葉青的人工栽培技術(shù)研究主要致力于種苗繁育和大田栽培；種苗繁育的主要方式為扦插繁殖和組織培養(yǎng)，雖然組織培養(yǎng)繁殖的研究較早，但近年來，三葉青扦插繁殖的方法逐漸增多，已超過組織培養(yǎng)快繁，這是由于扦插繁殖對種苗培養(yǎng)的條件要求更低，操作更簡便，普及性更強；另外，林下仿野生栽培和扦插繁殖等種苗繁育技術(shù)相結(jié)合，也是目前三葉青人工栽培較常用的方法，該栽培方式顯著提高了土地資源利用率和經(jīng)濟效益；設(shè)施栽培雖有少量研究，但仍然處于探索階段。

今后對于三葉青人工栽培技術(shù)的研究，可從擴大種苗生產(chǎn)、提高塊根產(chǎn)量和品質(zhì)，增加有效成分（如黃酮）含量等方面出發(fā)，對栽培地點、栽培材料、環(huán)境條件、栽培基質(zhì)和栽培容器等影響三葉青生長的因素進行優(yōu)化；另外，在人工擴大栽培時，應(yīng)注意最大限度地保留其藥性；另外，可以充分利用設(shè)施栽培能夠精準控制環(huán)境條件，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模人工集約化栽培的特點，加大對三葉青設(shè)施栽培的研究力度，并對研究成果及時進行專利保護，提升專利轉(zhuǎn)化能力。