1.福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室，福建 福州 350014；

2.福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，福建 福州 350014

較早使用具有抑制人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）功能的曲妥珠單抗，對多種HER2高表達的腫瘤有抗癌效應，聯(lián)合化療藥物一同使用可以使患者無進展生存期得到顯著延長［1-2］。然而，20多年的臨床研究［1］表明，曲妥珠單抗有效率僅為12%～34%，中位緩解期約9個月，而且許多患者在接受曲妥珠單抗治療的12個月內出現(xiàn)疾病進展，快速產生的耐藥性嚴重妨礙了曲妥珠單抗的抗癌療效及應用。

腫瘤上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與耐藥發(fā)生的關系是一個新的研究方向。特別是近期有若干研究［3-4］顯示，曲妥珠單抗耐藥發(fā)生過程中細胞出現(xiàn)EMT現(xiàn)象，且HER2陽性細胞發(fā)生EMT與其對曲妥珠單抗耐藥性的關系的機制研究處于起步階段。我們課題組在前期的研究［5］中發(fā)現(xiàn)，miR-375在曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌細胞株中明顯下調，并且可通過靶向胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R）逆轉乳腺癌細胞株對曲妥珠單抗的耐藥性。然而，miRNA通常是在腫瘤發(fā)生的過程中通過多靶點、多信號通路發(fā)揮其作用的，miR-375是否會靶向影響EMT信號通路上的分子而發(fā)揮作用尚不清楚。因此，本研究將通過預測miR-375與EMT相關分子Yes相關蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）的相互作用，分析兩者的靶向關系，初步探討miR-375通過調控EMT相關基因在乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的耐藥性中發(fā)揮的作用及分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞系、組織標本及主要試劑

HER2陽性乳腺癌細胞系SK-BR-3、人胚腎293T細胞（HEK-293T）均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，人乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株SK-BR-3R為空軍軍醫(yī)大學白文棟博士誘導并贈送［6］，誘導方法為HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR-3用含5 μg/mL的曲妥珠單抗及10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液壓力篩選6個月，所存活細胞即認定為耐藥細胞株。

選取2017年1—6月在福建省腫瘤醫(yī)院乳腺外科手術切除的25例乳腺癌患者腫瘤組織標本，凍存于液氮罐中。組織標本術后經病理學檢查確診為乳腺癌。所有患者均簽署知情同意書，本方案經福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、重組載體、miR-375 mimic及其對照均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自德國Qiagen有限公司，MTT試劑盒購自上海江林生物科技公司，蛋白抗體一抗［YAP1、波形蛋白（vimentin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）］均購自美國CST公司，二抗（辣根過氧化物酶標記）購自武漢艾美捷科技有限公司。注射用曲妥珠單抗（440 mg/瓶）購自美國Roche公司（批號N3742），配制方法：無菌稱取曲妥珠單抗5 mg，溶解于1 mL稀釋液中，配制成5 mg/mL的母液待用，使用時用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至5 μg/mL的工作濃度即可。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

乳腺癌耐藥細胞株SK-BR-3R由含曲妥珠單抗（5 μg/mL）和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，SK-BR-3及HEK-293T細胞系由10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。當細胞貼壁60%時，更換為無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，加入5 μL LipofectamineTM2000和20 nmol/L的miR-375 mimic（或NC mimic或pcDNA3.1-YAP1-MUT）。轉染6 h后更換含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)實驗。

1.3 MTT實驗檢測細胞增殖能力

取各組細胞，制成細胞懸液（密度為8×104個/mL）后，接種于96孔板（200 μL/孔）上，再加入含曲妥珠單抗?jié)舛确謩e為0、1、2、3、4、5 μg/mL的細胞培養(yǎng)液各100 μL，每個質量濃度設4個復孔。分別培養(yǎng)1、2、3 d后，加入0.5%MTT 4 h后，上酶標儀檢測，根據(jù)測得的吸光度（D）值繪制生長曲線。

1.4 H-E染色細胞形態(tài)學觀察

細胞爬片后，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗3次。加入95%乙醇溶液，固定20 min，PBS洗3次。加入蘇木精染液，染色2～3 min，放在自來水下，進行沖洗。使用伊紅進行浸染，1 min后，放在自來水下，進行沖洗。自然晾曬，至風干后，加入中性樹膠進行封片。顯微鏡下拍照。

1.5 平板克隆形成實驗

將各組細胞接種于6孔板（500個/孔組和2 000個/孔組）上，將以上細胞置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至肉眼可見的克隆為止，加入甲醇，固定15 min，用吉姆薩染色20 min，自來水沖洗并拍照。

1.6 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測miR-375及EMT相關基因的表達水平

各組細胞或組織提取RNA，紫外分光光度計檢測其純度、濃度和完整性，用反轉錄試劑盒合成cDNA，進行RTFQ-PCR檢測。miR-375正義鏈為5’-TTTGTTCG TTCGGCTCGCGTGA-3’，反義鏈為通用引物（由美國Invitrogen公司反轉錄試劑盒提供）；E-cadherin正義鏈為5’-AGTCACTGACA CCAACGATAAT-3’，反義鏈為5’-ATCGTTG TTCACTGGATTTGTG-3’；Vimentin正義鏈為5’-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3’，反義鏈為5’-CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3’；YAP1正義鏈為5’-TAGCCCTGCGTAGCCAGT TA-3’，反義鏈為5’-TCATGCTTAGTCCACT GTCTGT-3’；反應條件95 ℃ 5 min；95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共38個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA的相對表達量。

1.7 蛋白質印跡法（Western blot）

取各組細胞，提取細胞總蛋白，取蛋白每孔上樣100 μg，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）1 h，將分離獲得的蛋白條帶電轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%的脫脂奶粉封閉，分別加入鼠抗人vimentin、E-cadherin、GAPDH和YAP1的一抗（體積稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃過夜。洗膜后加入羊抗鼠二抗（體積稀釋比例為1∶10 000），加入電化學發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）發(fā)光劑顯影，用凝膠成像儀保存圖像并分析各條帶的灰度值，以GAPDH作內參計算相對表達量。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

應用生物信息學軟件TargetScan、miRDB對miR-375的靶基因進行預測，對靶基因YAP1進行分析。將miR-375 mimic和pGL3-YAP1重組載體共轉染HEK-293T細胞，分別為：miR-375 mimic與YAP1-WT、NC與YAP1-WT以及miR-375 mimic與YAP1-MUT、NC與YAP1-MUT。培養(yǎng)48 h后，加入PBS裂解，離心后取上清液加入白色不透明的96孔板上，避光應用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)計算相對熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學處理。每組實驗重復3次，計量資料以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關性采用Person相關系數(shù)描述。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-375在乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株中低表達

MTT實驗檢測顯示，在曲妥珠單抗藥物的存在下，與親本的SK-BR-3細胞系相比，耐藥株SK-BR-3R具有良好的生長特征，D值在兩種細胞株中差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；并且平板克隆形成實驗顯示，耐藥株SK-BR-3R具有更強的克隆形成能力（P＜0.01）。以上結果提示，SKBR-3R對曲妥珠單抗具有穩(wěn)定的耐藥性，并且具有更強的增殖能力。RTFQ-PCR檢測結果顯示，與親本SK-BR-3細胞系相比，miR-375的表達水平顯著降低（P＜0.001，圖1）。

圖1 SK-BR-3R細胞株對曲妥珠單抗的藥物敏感性的變化及miR-375的低表達Fig.1 Change of trastuzumab sensitivity in SK-BR-3R cells and low-expression of miR-375

2.2 乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株發(fā)生EMT

Western blot與RTFQ-PCR實驗結果顯示，與親本SK-BR-3細胞系相比，耐藥株SK-BR-3R中EMT標志蛋白vimentin在蛋白水平和mRNA水平上的表達量均上調（P＜0.01），而E-cadherin在蛋白水平和mRNA水平上的表達量均下調（P＜0.01，圖2A、B）。而對兩種細胞株的H-E染色結果顯示，與親本細胞系相比，耐藥細胞株SK-BR-3R在細胞形態(tài)學上發(fā)生了明顯改變（圖2C）。以上結果提示，與親本細胞系相比，乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株SK-BR-3R具備了EMT的特征。

2.3 轉染miR-375 mimic對乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株藥物敏感性的影響

對耐藥株分別轉染miR-375 mimic和NC后，分別檢測其mRNA的表達量，以及對曲妥珠單抗的耐藥性和平板克隆形成能力。與NC組比較，RTFQ-PCR檢測結果顯示，miR-375 mimic組在SK-BR-3R細胞中miR-375表達顯著升高（P＜0.001，圖3A）；MTT實驗檢測結果顯示，轉染了miR-375 mimic的耐藥細胞株在曲妥珠單抗存在的情況下，其增殖能力顯著下降（P＜0.01，圖3B）；而平板克隆形成實驗顯示，其克隆形成能力也顯著下降（P＜0.01，圖3C）。以上結果提示，與NC組相比，上調miR-375的表達量可以增加耐藥細胞株對曲妥珠單抗的藥物敏感性，并且其增殖能力受到顯著抑制。

2.4 轉染miR-375 mimic可逆轉乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞株的EMT

圖2 SK-BR-3R細胞株具有EMT特征Fig.2 EMT characteristics of SK-BR-3R cells

圖3 轉染miR-375對SK-BR-3R細胞曲妥珠單抗藥物敏感性的影響Fig.3 Effect of miR-375 on trastuzumab sensitivity in SK-BR-3R cells

進一步采用Western blot對EMT標志蛋白進行檢測，與NC組比較，miR-375 mimic組的vimentin表達量明顯下調（P＜0.05），同時E-cadherin表達量明顯上調（P＜0.05，圖4A）。RTFQ-PCR實驗檢測結果顯示，在mRNA水平上，vimentin表達量明顯下調（P＜0.01），同時E-cadherin表達量明顯上調（P＜0.01，圖4B）。以上結果提示，上調miR-375的表達量可以逆轉曲妥珠單抗耐藥細胞的EMT特性。

圖4 轉染miR-375對SK-BR-3R細胞EMT 特征的影響Fig.4 Effect of miR-375 on EMT in SK-BR-3R cells

2.5 YAP1與miR-375的靶向關系

通過生物信息學軟件TargetScan、miRDB預測miR-375的靶基因，發(fā)現(xiàn)其與EMT相關基因YAP1的3’-UTR存在結合位點（圖5A）。熒光素酶報告基因實驗顯示，miR-375 mimic與YAP1-WT共轉染組的細胞熒光信號顯著低于NC組（P＜0.01），而miR-375 mimic與YAP1-MUT共轉染組的細胞熒光信號與NC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖5B）。以上結果提示，miR-375能夠特異性地與YAP1的3’-UTR發(fā)生靶向結合。

對25例乳腺癌患者組織標本通過RTFQ-PCR進行了miR-375和YAP1表達量的檢測，Person相關分析顯示，乳腺癌組織中miR-375和YAP1在mRNA水平上呈負相關（r=-0.586 8，P=0.002 6，圖5C）。

2.6 miR-375靶向YAP1對細胞藥物敏感性以及EMT特性的影響

對耐藥株進行miR-375 mimic和pcDNA3.1-YAP1-MUT共轉染，通過Western blot檢測，與miR-375 mimic組相比，在共轉染的耐藥株中，EMT標志蛋白vimentin和E-cadherin的表達均得到了恢復（P＜0.05，圖6A），并且其對曲妥珠單抗的藥物敏感性（P＜0.01，圖6B）和平板克隆形成能力也得到了恢復（P＜0.05，圖6C）。以上結果提示，miR-375是靶向YAP1來發(fā)揮作用的。

圖5 miR-375靶向下調YAP1的表達Fig.5 miR-375 down-regulated the expression of YAP1

圖6 miR-375靶向YAP1對SK-BR-3R 細胞藥物敏感性及EMT特征的影響Fig.6 Effect of miR-375 targeting YAP1 on trastuzumab sensitivity and EMT characteristics in SK-BR-3R cells

3 討 論

抗體藥物已被廣泛用于各種腫瘤治療。臨床發(fā)現(xiàn)，不少初始治療有效的單抗很快就會因發(fā)生耐藥而失效，導致抗癌療效不持續(xù)，復發(fā)轉移頻發(fā)，患者的5年生存率未得到改善，研究抗體藥物的耐受機制及如何使其逆轉是當前抗癌領域的重點。本研究從miRNA角度出發(fā)，探討miR-375通過靶向調控YAP1基因，促進細胞EMT特性的逆轉，進而參與調控乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的藥物敏感性。

miR-375作為一種腫瘤抑制miRNA，已被證實在多種腫瘤中表達下調，并且通過靶向許多重要癌基因如AEG-1、IGF1R和PDK1來發(fā)揮其核心抑癌特性［7-9］。在腫瘤中，miR-375的改變是由多種機制引發(fā)的，包括轉錄因子失調、啟動子異常甲基化等［10-11］，其在組織中的低表達或低循環(huán)可能提示許多惡性腫瘤較差的預后。miR-375因其在體內外抑制腫瘤生長的特性進一步為發(fā)展中的靶向治療提供了方向。本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌曲妥珠耐藥細胞株中，miR-375發(fā)生了明顯的下調，這與前期的miR-375與腫瘤相關的報道［7-9］一致。

EMT已知在腫瘤的發(fā)展、轉移和藥物耐受中扮演著重要角色。盡管EMT和腫瘤轉移中的因果關系存在爭議，EMT在腫瘤耐藥方面已被不斷認知，包含了在腫瘤細胞藥物耐受過程中許多EMT相關通路。發(fā)生EMT的細胞同時被證明具有腫瘤干細胞樣特征，如藥物外排和抗凋亡影響［12-14］。因此，靶向EMT已經被認為是攻克藥物耐受的一個新途徑。Wu等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在HER2陽性腫瘤耐藥細胞株中伴隨有EMT樣改變并與Wnt/β-catenin信號通路激活相關，提示在曲妥珠單抗耐藥的過程中，EMT可能發(fā)揮作用。本研究結果顯示，與親本敏感細胞系相比，耐藥細胞株的間質標志蛋白vimentin水平上調，而上皮標志蛋白E-cadherin水平下調，提示乳腺癌細胞對曲妥珠單抗耐藥的同時具有EMT特性，與Wu等［4］的研究結果相一致。

YAP1作為在Hippo通路中扮演重要角色的轉錄共激活因子，已被證實是一個促腫瘤靶點［15］。作為一個致癌基因，YAP1基因的mRNA在許多腫瘤細胞內均高表達，并與腫瘤的形成有較強的相關性［16］。越來越多的研究證明，YAP1可以在體外誘導許多細胞株發(fā)生EMT［17-20］，并且成為乳腺癌轉移有力的推動者［21］。miR-375和YAP1的靶向關系在多種腫瘤中已經被報道［22-23］。本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者腫瘤組織中兩者呈負相關，且熒光素酶報告基因實驗顯示，miR-375 mimic和YAP1-WT共轉染組細胞熒光信號顯著低于其他組，提示YAP1和miR-375存在靶向調控關系。在乳腺癌耐藥細胞株中分析miR-375靶向YAP1的生物學功能發(fā)現(xiàn)，miR-375通過靶向調控YAP1而參與曲妥珠單抗耐藥細胞株的EMT和藥物敏感性的變化。

綜上所述，miR-375作為一種腫瘤抑制因子，可通過靶向YAP1的表達對曲妥珠單抗耐藥細胞株的EMT進行調控，從而逆轉其EMT特性和藥物敏感性。從EMT角度來探討HER2陽性乳腺癌細胞耐藥的發(fā)生，有望為臨床解決曲妥珠單抗的耐藥提供新的途徑和治療靶點。