王 佳，艾中中，周 菁

1.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710000；

2.西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710000；

3.陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內科，陜西 西安 710061

腎細胞癌作為常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其中80%的組織學亞型為腎透明細胞癌［1］。雖然腎透明細胞癌可以通過手術治療進行切除，但約有30%的患者在確診初期已發(fā)生轉移，即便手術切除，后期也有將近40%的患者會出現(xiàn)轉移［2］。因此，探究腎透明細胞癌的發(fā)生、發(fā)展機制具有重要意義。

溶質載體家族6成員3（solute carrier family 6 member 3，SLC6A3），也被稱為DAT1，是一種多巴胺轉運蛋白，在多項研究［3-4］中已被證實在腎透明細胞癌患者中表達上調，可以作為生物標志物用于診斷腎透明細胞癌，但SLC6A3對腎透明細胞癌具體的調控機制尚不清楚。本研究探討SLC6A3對腎透明細胞癌細胞增殖、遷移的影響，并對可能涉及到的分子機制進行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎皮質上皮細胞HK-2及腎透明細胞癌細胞SNU-349購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司。RNA提取試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白測定試劑盒及細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自上海碧云天生物技術有限公司。SLC6A3、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）及磷酸化抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；shSLC6A3（5’-CACCGGGCAAGAAGATCGACTTTCTTTC AAGAGAAGAAAGTCGATCTTCTTGCCC-3’）和shNC（5’-CACCGCTTCACGGTCATCCTCAT CTCGAAAGATGAGGATGACCGTGAAGC-3’）質粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒購自北京欣博盛生物科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 組織樣本收集

收集2017年1月—2018年1月在陜西省腫瘤醫(yī)院收治確診的腎透明細胞癌患者56例，取其手術切除的腎透明細胞癌標本及相應的癌旁組織，置于-80 ℃保存待用。本實驗經(jīng)陜西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.3 免疫組織化學法檢測SLC6A3蛋白水平

采用10%甲醛溶液固定樣本組織，石蠟包埋、切片。然后二甲苯脫蠟、枸緣酸鈉修復液修復抗原。冷卻后用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌，3%過氧化氫室溫封閉30 min。SLC6A3抗體4 ℃溫育過夜。PBS沖洗后，二抗37 ℃溫育1 h。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復染，結果由兩名經(jīng)驗豐富的醫(yī)師進行判斷［5］，根據(jù)細胞染色強度及染色陽性率進行打分。細胞染色強度評分：棕褐色（3分），棕黃色（2分），淡黃色（1分），無色（0分）。染色陽性率評分：無陽性細胞（0分），陽性細胞率≤1 0%（1 分），1 0%＜陽性細胞率≤5 0%（2分），50%＜陽性細胞率≤75%（3分），陽性細胞率＞75%（4分）。按細胞染色強度和染色陽性率綜合判斷，兩者之積≤平均值為低表達組，＞平均值為高表達組。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉染

HK-2、SNU-349細胞分別接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)。將細胞隨機分為2組，分別為shNC組和shSLC6A3組，培養(yǎng)24 h后，采用LipofectamineTM3000將構建的shNC和shSLC6A3質粒轉染至SNU-349細胞中。轉染48 h后，收集細胞進行后續(xù)相關實驗。

1.5 RTFQ-PCR檢測SLC6A3的mRNA表達

采用RNAprep Pure動物組織總RNA提取試劑盒提取腎透明細胞癌組織中的總RNA；采用RNAprep Pure培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA。采用分光光度計分析評估RNA的濃度和純度。按照說明書，采用FastKing一步法RTFQ-PCR檢測SLC6A3 mRNA水平，以GAPDH作為內參。SLC6A3上游引物：5’-CACTCCCGGATGCACTCAAC-3’；下游引物：5’-GATTCCAATCTACGGACGAGC-3’。GAPDH上游引物：5’-CTGACTTCAACAGC GACACC-3’；下游引物：5’-TGCTGTAGCC AAATTCGTTG-3’。采用2-△△Ct計算SLC6A3mRNA的相對表達量，其中△Ct=C tSLC6A3-CtGAPDH。每組設置3個復孔。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測SLC6A3、PI3K、Akt蛋白水平

采用RIPA裂解液冰上裂解細胞。12 000 r/min離心20 min收集上清液，獲得細胞總蛋白。取50 μg蛋白上樣于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）垂直電泳用于分離，運行完畢后采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上。室溫封閉1 h，SLC6A3和GAPDH抗體4 ℃溫育過夜，PBST洗滌，二抗室溫下溫育1 h。曝光、顯影。使用Image J進行定量分析，其中以GAPDH作為內參計算目的蛋白的相對表達水平。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖能力

取適量處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板上，每組設置3個復孔。第2天向每孔加入10 μL的CCK-8試劑，37 ℃避光溫育2 h。然后采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（D）值。選取的時間點為0、12、24、48 h。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞周期分布

收集適量處于對數(shù)生長期的細胞消化離心收集細胞沉淀，制備細胞懸浮液。細胞凋亡：將細胞與Annexin Ⅴ結合液混合均勻，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液，室溫避光溫育15 min后，采用流式細胞術檢測細胞凋亡。細胞周期：70%乙醇溶液固定細胞30 min，PBS洗滌，收集細胞，加入PI染色液，室溫避光溫育20 min，PBS洗滌后在流式細胞儀488 nm波長下進行測定。

1.9 Transwell檢測細胞遷移能力

收集適量處于對數(shù)生長期的細胞，無血清培養(yǎng)基重懸細胞計數(shù)，將100 μL 2×104個細胞置于transwell小室上層，下層為500 μL含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基。37 ℃溫育24 h后，用棉棒刮下膜表面細胞，用0.1%的結晶紫染色液染色20 min。顯微鏡下觀察細胞遷移數(shù)目。

1.10 統(tǒng)計學處理

采用Graphpad Prism7.0分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料用%表示，比較采用χ2檢驗；計量資料用x±s表示，兩兩比較采用獨立t或Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SLC6A3在腎透明細胞癌及細胞中高表達

采用免疫組織化學法分析SLC6A3在腎透明細胞癌及相應癌旁組織中的表達，結果顯示，腎透明細胞癌癌組織中SLC6A3的陽性率（67.86%，38/56）顯著高于癌旁組織（1 2.5 0%，7/5 6），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=35.7，P＜0.05，圖1A）；其中腎透明細胞癌癌組織中SLC6A3呈高表達的占25%（14/56）。隨后檢測SLC6A3在人腎皮質上皮細胞HK-2及腎透明細胞癌細胞SNU-349中的表達，RTFQ-PCR結果顯示，與HK-2比較，SNU-349細胞中SLC6A3表達顯著上調（1.02±0.04vs4.90±0.17，P＜0.05，圖1B）；與此同時，Western blot結果顯示，SNU-349細胞內SLC6A3表達顯著上調（0.27±0.03vs1.20±0.06，P＜0.05，圖1C）。上述結果表明，SLC6A3在腎透明細胞癌組織及細胞中呈高表達。

2.2 下調SLC6A3抑制SNU-349細胞的生長

分別將shNC和shSLC6A3質粒轉染至SNU-349細胞中，采用RTFQ-PCR和Western blot進行分析，結果顯示，與shNC組比較，shSLC6A3組SLC6A3 mRNA表達（1.00±0.05vs0.37±0.09，P＜0.05，圖2A）和蛋白水平（0.83±0.04vs0.12±0.02，P＜0.05，圖2B）均顯著降低，表明shSLC6A3轉染細胞株構建成功。然后采用CCK-8法檢測SLC6A3對細胞增殖的影響，結果顯示，下調SLC6A3后細胞增殖能力顯著降低（48 h：1.50±0.05vs0.94±0.04，P＜0.05，圖2C）。

圖1 SLC6A3在腎透明細胞癌及細胞中的表達情況Fig.1 SLC6A3 expression in renal clear cell carcinoma and its cells

圖2 下調SLC6A3對SNU-349細胞增殖的影響Fig.2 Effects of SLC6A3 downregulation on SNU-349 cell proliferation

2.3 下調SLC6A3促進SNU-349細胞凋亡

采用流式細胞術分析SLC6A3對SNU-349細胞凋亡及周期的影響，結果顯示，下調SLC6A3后，癌細胞凋亡比例顯著提高（1.70±0.26vs5.70±0.32，P＜0.05，圖3A），并將細胞生長阻滯于S期（26.70±0.87vs37.30±0.61，P＜0.05，圖3B）。

2.4 下調SLC6A3抑制SNU-349細胞遷移

采用transwell實驗檢測SLC6A3對SNU-349細胞遷移能力的影響，結果顯示，下調SLC6A3后，細胞遷移能力顯著降低（80.3±6.1vs20.7±3.2，P＜0.05，圖4）。

2.5 SLC6A3通過調控PI3K/Akt信號通路影響SNU-349細胞的生長

采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，下調SLC6A3后細胞內PI3K（0.73±0.04vs0.21±0.03，P＜0.05）及Akt磷酸化（1.10±0.09vs0.14±0.02，P＜0.05）水平顯著降低（圖5A）。進一步采用CCK-8法檢測，結果顯示，與shSLC6A3組比較，shSLC6A3+740 Y-P（PI3K激動劑）組細胞活力顯著升高（48 h：0.95±0.04vs1.40±0.02，P＜0.05，圖5B）。上述結果表明，SLC6A3通過調控PI3K/Akt信號通路影響SNU-349細胞的生長。

圖3 下調SLC6A3對SNU-349細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of SLC6A3 downregulation on SNU-349 cell apoptosis

圖4 下調SLC6A3對SNU-349細胞遷移能力的影響Fig.4 Effects of SLC6A3 downregulation on SNU-349 cell migration ability

圖5 SLC6A3通過調控PI3K/Akt信號通路影響SNU-349細胞的生長Fig.5 SLC6A3 affected the growth of SNU-349 cells by regulating the PI3K/Akt signaling pathway

3 討 論

腎透明細胞癌是最致命的泌尿生殖系統(tǒng)癌癥。據(jù)統(tǒng)計全球每年大約新增40萬確診病例及14萬死亡病例，手術切除是目前主要的治療方式，但是后期容易發(fā)生癌細胞轉移［6］。因此，探究腎透明細胞癌的增殖、遷移機制具有重要意義。

SLC6A3作為一種轉運蛋白，在機體內負責調節(jié)大腦中多巴胺的濃度，其表達異常與帕金森綜合征、注意力缺陷及多動障礙等疾病相關［7］。最近研究［4］發(fā)現(xiàn)，SLC6A3在腎透明細胞癌中呈高表達，且其高表達預示著患者較短的生存期，表明SLC6A3可能參與調控腎透明細胞癌的進展。事實上，腫瘤細胞利用轉運蛋白來維持其自身生長并不少見，如SLC2A1（編碼缺氧誘導因子）在多種腫瘤細胞中表達上調從而為癌細胞快速增殖提供充足的能量［8-9］，SLC2A3（編碼高親和力葡萄糖轉運蛋白）同樣在乳腺癌、結腸直腸癌和膀胱癌中呈高表達［10-12］。此外，腫瘤通常依賴谷氨酰胺來維持細胞內NADPH水平，因此許多具有轉運谷氨酰胺功能的蛋白在癌細胞中表達上調［13］，表明轉運蛋白的功能與腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展存在著某種聯(lián)系。但是關于SLC6A3如何調控腎透明細胞癌細胞生長的機制并不明確。

本研究首先證實SLC6A3在腎透明細胞癌及細胞中呈高表達，表明SLC6A3可能是腎透明細胞癌診斷的生物標志物，該結果與之前的研究［4，6］一致。進一步構建shSLC6A3細胞株，發(fā)現(xiàn)下調SLC6A3后，細胞增殖、遷移能力顯著降低，而凋亡率顯著增加。VHL基因失活，從而導致細胞內缺氧，缺氧誘導因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）增加，是腎透明細胞癌發(fā)生、發(fā)展過程中的主要特征［2］。有研究［14］發(fā)現(xiàn)，在人惡性膠質瘤中SLC6A3是HIF-1α的下游靶基因，具有促進癌細胞增殖與遷移的作用。所以我們推測在腎透明細胞癌中由于HIF-1α表達水平升高，從而促進了SLC6A3過表達，最終導致癌細胞增殖與遷移。

PI3K/Akt信號通路激活后能調控細胞周期相關蛋白的表達、抑制癌細胞凋亡，促進癌細胞增殖與侵襲、血管生成等，因此PI3K/Akt信號通路激活與多種腫瘤的發(fā)生密切相關［15］。有研究［16］表明，抑制PI3K/Akt信號的激活可以顯著抑制腎透明細胞癌的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，下調SLC6A3后細胞內PI3K及Akt磷酸化水平顯著下降，表明SLC6A3可能通過調控PI3K/Akt信號通路參與腎透明細胞癌的進展。進一步采用PI3K激動劑處理shSLC6A3細胞，發(fā)現(xiàn)與shSLC6A3組比較，細胞增殖能力顯著提高，表明SLC6A3通過調控PI3K/Akt信號通路影響腎透明細胞癌的生長。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)SLC6A3在腎透明細胞癌組織中呈高表達，下調SLC6A3可抑制細胞增殖、侵襲，促進細胞凋亡。SLC6A3可能通過調控PI3K/Akt信號通路影響腎透明細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程。