袁新程，蔣飛，施永海，徐嘉波，劉永士，鄧平平

（上海市水產(chǎn)研究所/上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海200433）

溫度作為影響魚類正常生長、代謝、發(fā)育和繁殖過程中的重要外界因子，大多數(shù)魚類總是選擇在最適宜的溫度環(huán)境中生存、攝食與生長。酶作為機體催化生物反應(yīng)的一種特殊蛋白質(zhì)，在魚體內(nèi)起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[1]。當(dāng)外界水環(huán)境發(fā)生變化時，魚體將產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，主要表現(xiàn)為機體內(nèi)各種酶活性的變化[2]。諸多研究結(jié)果均顯示，溫度變化可對魚類的抗氧化能力產(chǎn)生直接影響[2-4]。溫度過高會導(dǎo)致魚體抗氧化性酶活性下降以及抗氧化物質(zhì)含量降低，從而削弱其清除有害自由基的能力，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物如丙二醛含量增多，對魚體造成直接傷害[5]。溫度也是影響魚類非特異性免疫能力的外界因子之一：當(dāng)外界水溫低于魚體最適溫度時，魚體的免疫反應(yīng)通常會降低；而外界溫度過高則會導(dǎo)致魚體中參與免疫反應(yīng)的相關(guān)酶活性的喪失，影響魚類正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)[6-7]。因此，研究魚類在急性高溫脅迫條件下的抗氧化和非特異性免疫酶活性指標(biāo)變化具有重要意義。

美洲鰣（Alosa sapidissima），又稱美洲西鯡，隸屬于鯡形總目（Clupeomorpha）鯡形目（Clupeiformes）鯡科（Clupeidae）西鯡屬（Alosa），為典型的溯河產(chǎn)卵魚類，主要生活于大西洋西海岸（從加拿大魁北克省到美國佛羅里達州）和太平洋海岸（從美國加利福尼亞州圣迭戈市到阿拉斯加州）的海洋和河流中，是北美地區(qū)重要的經(jīng)濟魚類之一[8-9]。美洲鰣以其肉質(zhì)細嫩、豐腴肥美而著稱[9-10]，被世界各國廣泛引種。由于我國長江鰣（Tenualosa reevesii）資源日益枯竭，而美洲鰣的形態(tài)特征與長江鰣相似，因此，自20 世紀(jì)90 年代以來，上海市水產(chǎn)研究所率先將美洲鰣引入我國進行人工繁養(yǎng)；目前，美洲鰣在我國的繁育及養(yǎng)殖技術(shù)逐漸成熟[11-12]，養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，現(xiàn)已成為長江鰣的替代品，并成為國內(nèi)外喜愛的名貴淡水養(yǎng)殖魚類之一。近年來，國內(nèi)關(guān)于美洲鰣的研究主要集中在繁殖技術(shù)[10]、苗種培育[13]、生長特性[11,14]、養(yǎng)殖運輸[8,15]等方面，而國外對美洲鰣的研究主要集中在捕撈、遷徙及遺傳多樣性等方面[16-18]，但至今尚未有關(guān)于美洲鰣對環(huán)境溫度應(yīng)激性變化的相關(guān)研究報道。為此，本研究通過對1＋齡美洲鰣進行96 h的溫度脅迫實驗，測定其肝和血清中抗氧化及非特異性免疫相關(guān)酶指標(biāo)的變化，以期為美洲鰣的健康養(yǎng)殖和其對環(huán)境變化適應(yīng)能力的評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚和用水

實驗用魚為上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地于2017年5月經(jīng)人工繁育養(yǎng)殖的1＋齡美洲鰣魚種，平均體質(zhì)量（152.07±25.24）g，平均體長（21.89±1.28）cm。實驗在上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地進行，選取同一批次卵孵化養(yǎng)成的大小均勻、體質(zhì)健壯、活力較強的個體進行實驗。實驗用水均是經(jīng)過60目篩絹網(wǎng)過濾、沉淀和充分曝氣后的當(dāng)?shù)睾涌谒}度為2～3），實驗期間水中溶解氧水平均高于5 mg/L，pH 為7.62±0.21，氨氮和亞硝酸鹽質(zhì)量濃度均低于0.01 mg/L。

1.2 實驗設(shè)計

設(shè)24 ℃（對照組）、28 ℃和30 ℃3個溫度水平處理組（在預(yù)實驗中，由于在32 ℃的溫度水平下，美洲鰣在網(wǎng)箱中狂躁不安，不斷死亡，12 h 后無存活，故確定最高溫度為30 ℃），每一水平設(shè)3個平行，每一平行25尾魚，組間個體無顯著差異（P＜0.05）。實驗在網(wǎng)箱（1.0 m×0.6 m×0.4 m）中進行，在每個水泥池（2.5 m×7.5 m×1.5 m）中放置3個相同的網(wǎng)箱作為重復(fù)組。實驗開始前，將水溫升至24 ℃，作為實驗初始溫度，實驗魚先暫養(yǎng)于水泥池中（此時水溫均為24 ℃），穩(wěn)定1周后，移入對應(yīng)的實驗網(wǎng)箱中，再穩(wěn)定3 d后開始實驗，通過熱水循環(huán)（CWNS0.85-90/70-Y型全自動燃油熱水機）進行水溫調(diào)控（±0.2 ℃），并在1 h 內(nèi)從初始溫度（24 ℃）升至28 ℃和30 ℃。當(dāng)溫度達到各設(shè)定水平后，立即對各組進行取樣（表示調(diào)節(jié)溫度前的情況），記為0 h，然后，分別在3、6、12、24、48、96 h時取樣，從每個溫度水平的3個重復(fù)中各隨機取3尾，整個實驗過程中共取樣189尾魚。實驗前一天及實驗期間，各溫度處理下均不投食。

1.3 樣品采集與酶活性測定

1.3.1 樣品采集

分別對0、3、6、12、24、48、96 h 采集的189 尾實驗魚取血清和肝樣品。首先，利用0.5 mg/L 間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）對實驗魚進行麻醉，然后進行尾靜脈取血，將取出的血液移入1.5 mL離心管中，在4 ℃冰箱中靜置2 h后，于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱中；接著，將實驗魚放于冰盤上，解剖取肝，用事先準(zhǔn)備好的生理鹽水（4 ℃，0.86%）對肝進行沖洗后，按照質(zhì)量濃度比1∶9的比例加入事先預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴下使用事先準(zhǔn)備好的玻璃勻漿器進行勻漿，制成10%勻漿液，并于4 ℃、3 500 r/min 條件下離心10 min，取上清液，保存在-80 ℃冰箱中。將制備的上清液用于抗氧化酶、非特異性免疫酶活性及總蛋白含量的測定。

1.3.2 酶活性和總蛋白含量測定

分別采用南京建成生物工程研究所提供的A001-1 總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase, T-SOD）檢測盒（羥胺法）、A007-2 過氧化氫酶（catalase, CAT）檢測盒（可見光比色法）、A003-1 丙二醛（malondialdehyde,MDA）檢測盒（硫代巴比妥酸法）、A005 谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）測定盒（可見光比色法）、A059-1 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）測定盒（可見光比色法）、A060-1 酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）測試盒（可見光比色法）、C009-1 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）測試盒（賴氏法）以及C010-1 谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）測試盒（比色法）對所取實驗魚肝和血清樣品中抗氧化酶和非特異性免疫酶活性進行測定；使用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007 整理實驗數(shù)據(jù)，所得結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；利用SPSS 17.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和鄧肯多重比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對美洲鰣肝和血清中抗氧化相關(guān)酶指標(biāo)的影響

肝中SOD 活性大小變化如圖1A 所示：對照組（24 ℃）的活性大小基本穩(wěn)定，變化范圍為182.438～244.819 U/mg，而28 ℃和30 ℃組的SOD 活性呈現(xiàn)隨時間增長逐漸增大的趨勢，在48 和96 h 時，SOD活性均明顯大于24 ℃組（P＜0.05）；此外，除3 h 的28 ℃組明顯小于24 ℃組外，其他時間的高溫組與24 ℃組均無明顯差異（P＞0.05）。血清中SOD活性大小變化如圖1B所示：24 ℃和28 ℃組活性大小均基本穩(wěn)定，并且兩者之間無明顯差異（P＞0.05），而30 ℃組隨時間增長呈逐漸增大趨勢，并在12、48和96 h時顯著大于對照組（P＜0.05）?？傊诟邷孛{迫下，美洲鰣肝和血清中SOD活性隨時間增長逐漸增大，并從48 h開始明顯增大。

肝中CAT 活性大小變化如圖2A 所示：24 ℃組CAT活性在實驗期間基本保持穩(wěn)定，大小為4.712～6.292 U/mg，而高溫組美洲鰣CAT 活性受溫度影響明顯，28 ℃和30 ℃組CAT活性在脅迫48和96 h時均明顯大于24 ℃組（P＜0.05）。血清中CAT活性大小變化如圖2B所示：24 ℃組CAT活性變化不大，基本維持穩(wěn)定；28 ℃組CAT活性隨時間增長呈現(xiàn)逐漸增大的變化趨勢，但與對照組相比，總體增大不明顯（P＞0.05）；而30 ℃組CAT 活性隨時間增長逐漸減小，并從24 h 時開始明顯小于24 ℃和28 ℃組（P＜0.05），說明高溫脅迫顯著抑制了血清中CAT活性。

如圖3 所示：高溫脅迫期間，24 ℃組的肝和血清中GSH-Px 活性隨時間增長基本保持穩(wěn)定，分別為0.968～1.153和1.603～2.273 U/mg。28 ℃和30 ℃組的肝中GSH-Px 活性總體上隨時間增長逐漸增大，其中：在脅迫48 h時，28 ℃組的GSH-Px活性顯著大于24 ℃組（P＜0.05），與30 ℃組間無顯著差異（P＞0.05）；在脅迫96 h 時，28 ℃組的GSH-Px 活性與24 ℃組間無顯著差異（P＞0.05），而30 ℃組顯著大于24 ℃（P＜0.05）（圖3A）。28 ℃組的血清中GSH-Px活性也隨時間增長呈增大趨勢，而30 ℃組隨時間增長呈減小趨勢，并從24 h開始均顯著小于24 ℃和28 ℃組（P＜0.05）（圖3B）。

圖2 高溫脅迫對美洲鰣肝和血清中CAT活性的影響Fig.2 Effects of high temperature stress on CAT activities in liver and serum of A.sapidissima

如圖4A所示：24 ℃組肝中MDA含量基本保持穩(wěn)定，為0.357～0.545 nmol/mg，而28 ℃和30 ℃組隨時間增長均呈先升高后降低的變化，其中在12 h時達到最大后開始降低。從6 h開始，30 ℃組MDA含量隨時間增長均明顯大于24 ℃組（P＜0.05）；28 ℃組在12 h 時明顯大于24 ℃組，而之后的其他時間點雖大于24 ℃組，但均不顯著（P＞0.05）。如圖4B所示：血清中24 ℃組的MDA含量基本保持穩(wěn)定，為0.098～0.139 nmol/mg，而28 ℃和30 ℃組隨時間增長均呈先升后降再升的變化趨勢，并均從24 h開始MDA含量明顯大于24 ℃組（P＜0.05）。

2.2 高溫脅迫對美洲鰣肝中AKP 和ACP 活性的影響

從圖5中可看出，實驗期間24 ℃組美洲鰣肝中AKP活性變化基本穩(wěn)定，大小為18.448～21.090 U/g。28 ℃和30 ℃組AKP活性隨時間增長具有較明顯的下降趨勢，從3 h時開始，除12 h外高溫脅迫顯著降低AKP活性，28 ℃和30 ℃組AKP活性均明顯小于24 ℃組（P＜0.05），但除48 h 外，28 ℃和30 ℃組間差異均不顯著（P＞0.05）。圖6中顯示：對照組24 ℃的ACP活性大小在48和96 h時略有升高，但變化不大，基本保持穩(wěn)定，大小為28.186～33.293 U/g。在0～24 h范圍內(nèi)，28 ℃和30 ℃組的ACP活性隨時間增長基本保持穩(wěn)定，與24 ℃組間均無顯著差異（P＞0.05），但隨時間繼續(xù)增長，在48 和96 h 時28 ℃和30 ℃組的ACP 活性均顯著低于24 ℃組（P＜0.05），而這2組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 高溫脅迫對美洲鰣肝中轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

實驗期間，24 ℃組AST 活性基本保持穩(wěn)定，于12和24 h時略有升高，但變化不大，大小為76.591～94.589 U/g。而28 ℃和30 ℃組AST 活性隨時間增長呈逐漸增大趨勢，在96 h時，28 ℃和30 ℃組AST活性均顯著大于24 ℃組（P＜0.05），表明高溫可明顯提高AST活性（P＜0.05），但28 ℃和30 ℃組間差異不明顯（P＞0.05）；脅迫6 h時，30 ℃組AST活性顯著小于24 ℃和28 ℃組（圖7）。從圖8中可以看出，ALT 活性受高溫脅迫影響較明顯，其中：24 ℃組的ALT 活性基本保持穩(wěn)定，大小為3.730～4.354 U/g；28 ℃組ALT 活性隨時間增長呈先升后降的變化趨勢，在6 和24 h 時明顯大于24 ℃組（P＜0.05），而在48 和96 h 時明顯降低，但與24 ℃組無顯著差異（P＞0.05）；30 ℃組的ALT活性隨時間增長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，受高溫脅迫影響較明顯，其中在48 h時ALT活性顯著大于24 ℃和28 ℃組，在96 h時其活性顯著大于28 ℃組（P＜0.05）。

圖3 高溫脅迫對美洲鰣肝和血清中GSH-Px活性的影響Fig.3 Effects of high temperature stress on GSH-Px activities in liver and serum of A.sapidissima

3 討論

3.1 高溫脅迫對美洲鰣抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

溫度作為隨時間、空間而改變的外界因子，不僅對水體中諸多理化因子產(chǎn)生影響，而且對魚體的正常生理活動也產(chǎn)生重要影響[19]。SOD、CAT和GSHPx作為生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，在生物體的自我防護系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，是抗氧化防御過程中的關(guān)鍵酶[20]。有研究表明，水溫高低可直接對魚類機體的抗氧化能力產(chǎn)生影響[21-22]：當(dāng)魚體受到外界高溫脅迫時，由于呼吸爆發(fā)和其他免疫過程而產(chǎn)生過多有害的活性氧自由基，因而機體通過產(chǎn)生更多的抗氧化酶來清除這些活性氧自由基，從而維持細胞和機體的正常生理活動。本實驗中，28 ℃和30 ℃組肝及血清中SOD均出現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢，這與謝明媚等[23]研究急性溫度脅迫對銀鯧（Pampus argenteus）幼魚抗氧化和免疫指標(biāo)影響的結(jié)果相一致。這表明高溫脅迫使美洲鰣產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，迫使細胞和組織中自由基迅速增加，以致?lián)p傷細胞和組織，機體通過產(chǎn)生大量SOD來應(yīng)對過量的自由基，所以美洲鰣體內(nèi)SOD 活性升高。CAT、GSH-Px 活性在肝中均隨時間增長逐漸升高，而在血清中表現(xiàn)出先升后降的趨勢。帶來這種變化的原因主要是高溫脅迫對肝造成了一定損傷，肝中過量自由基未被清除而導(dǎo)致CAT 和GSH-Px 活性逐漸升高，而血液中過量的自由基逐漸被清除，所以CAT和GSH-Px活性表現(xiàn)出先升后降的變化。相似的研究結(jié)果還出現(xiàn)在中華鱘（Acipenser sinensis）[19]和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[24]中。

圖4 高溫脅迫對美洲鰣肝和血清中MDA含量的影響Fig.4 Effects of high temperature stress on MDA contents in liver and serum of A.sapidissima

圖5 高溫脅迫對美洲鰣肝中AKP活性的影響Fig.5 Effects of high temperature stress on AKP activity in liver of A.sapidissima

圖6 高溫脅迫對美洲鰣肝中ACP活性的影響Fig.6 Effects of high temperature stress on ACP activity in liver of A.sapidissima

圖7 高溫脅迫對美洲鰣肝中AST活性的影響Fig.7 Effects of high temperature stress on AST activity in liver of A.sapidissima

生物體中MDA作為不飽和脂肪酸被氧化后的最終產(chǎn)物，已被作為一種細胞膜氧化損傷的指示物，它的產(chǎn)生加劇了膜的損傷[25]。因此，MDA 水平高低間接反映了組織細胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，也代表生物機體抗氧化能力水平的高低[26]。本研究中，28 ℃和30 ℃組肝中MDA含量在高溫脅迫96 h 內(nèi)均隨時間增長表現(xiàn)出先升高后降低的變化，而肝中SOD、CAT 和GSH-Px 均隨時間增長顯著升高，這表明高溫脅迫對美洲鰣肝造成了氧化損傷，導(dǎo)致抗氧化酶大量生成以抵抗過量的自由基。該變化趨勢與謝明媚等[23]的研究結(jié)果相似，而與王偉等[25]對太平洋鱈（Gadus macrocephalus）仔稚魚在急性溫度脅迫下MDA的變化趨勢不同。這可能是由實驗魚種、應(yīng)激時間及實驗溫度等不同而造成的。在美洲鰣血清中，2個高溫組MDA含量隨時間增長均呈先升后降再升的變化趨勢，但30 ℃組在96 h時顯著大于其他2 組，這與范耘碩等[27]研究溫度脅迫對大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）抗氧化與非特異性免疫指標(biāo)影響的結(jié)果相似。這主要是因為在30 ℃的高溫脅迫下，美洲鰣血清中CAT 和GSH-Px 均隨時間增長顯著降低，抗氧化酶活性受到顯著抑制，抗氧化能力減弱，所以導(dǎo)致MDA 在30 ℃高溫脅迫后期迅速升高。

3.2 高溫脅迫對美洲鰣非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

圖8 高溫脅迫對美洲鰣肝中ALT活性的影響Fig.8 Effects of high temperature stress on ALT activity in liver of A.sapidissima

AKP是一種磷酸單酯水解酶，在機體正常情況下特異性低，而受到外部刺激或出現(xiàn)病變時活性會增強，主要起到解毒劑的作用，是魚類等生物健康的重要標(biāo)志[28]。有研究表明，溫度脅迫會對魚體中的AKP 產(chǎn)生明顯影響，如：強俊等[29]對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）幼魚研究發(fā)現(xiàn)，溫度脅迫下實驗魚的AKP活性呈先上升后下降的變化趨勢；管標(biāo)等[30]研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下虹鱒（O. mykiss）的AKP活性較對照組明顯降低，表明高溫脅迫對AKP活性有抑制作用。本研究中，高溫脅迫對美洲鰣的AKP活性也產(chǎn)生明顯影響，AKP活性隨時間增長而降低，并在各時間點（除12 h 外）時高溫組（28 ℃和30 ℃）均顯著小于對照組（24 ℃）。這說明高溫抑制了美洲鰣的AKP活性，減弱了魚體非特異性免疫能力。ACP作為生物體內(nèi)重要的代謝酶，不僅參與磷酸酯和細胞消化代謝，還與參加自溶過程和免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)[31]。本實驗中，ACP 活性在24 h 內(nèi)均無明顯變化，高溫組與對照組均無顯著差異；而24 h后，高溫組ACP活性均明顯降低，并均小于24 ℃對照組。這與大菱鲆[Scophthalmus maximus (L.)]體內(nèi)酸性磷酸酶活性變化趨勢[32]相似。表明美洲鰣可承受短時間內(nèi)的高溫壓力，當(dāng)超過一定時間后，ACP活性就會受到抑制而顯著減小。因此，可認為本實驗條件下的高溫脅迫對美洲鰣肝造成了一定程度的損傷。AST 與ALT 是生物體中2 種重要的轉(zhuǎn)氨酶，正常情況下AST和ALT存在于肝、心、腎、血液等許多器官或組織中，尤其以肝中含量最高[33]。當(dāng)生物機體受到外界脅迫或發(fā)生病變時，肝中AST和ALT活性會顯著升高，糖異生途徑加強，通過產(chǎn)生葡萄糖來對抗不利環(huán)境[34]；因此，測定肝中AST 和ALT 活性水平的高低，可以反映細胞膜通透性的變化，并判斷肝等組織是否受到損傷[30]。本研究中，高溫組AST活性隨時間增長逐漸升高，前48 h內(nèi)總體上無顯著差異，而在96 h 時均顯著大于對照組；此結(jié)果與范耘碩等[27]對大鱗副泥鰍（P. dabryanus）中AST與ALT 隨溫度變化的研究結(jié)果相似。這可能是因為美洲鰣受到高溫脅迫后，肝中AST 活性開始升高，在短時間內(nèi)有一定的調(diào)節(jié)作用，但當(dāng)長時間處于高溫環(huán)境下可能對肝造成一定的損傷，而導(dǎo)致AST 活性顯著升高。ALT 在30 ℃組中活性逐漸升高，而在28 ℃組表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，且在48 h 時，30 ℃組的ALT 活性顯著大于28 ℃組和24 ℃對照組，在96 h 時，其活性顯著大于28 ℃組。相似結(jié)果也出現(xiàn)在對虹鱒（O.mykiss）[30]的研究中。這主要是因為在28 ℃條件下，ALT活性通過機體的調(diào)節(jié)可以恢復(fù)到正常水平，未對肝細胞造成破壞，而30 ℃可能對肝產(chǎn)生了顯著影響，致使ALT活性顯著升高。因此，在30 ℃高溫脅迫下美洲鰣肝細胞可能受到了一定程度的損傷，但未造成永久性破壞。

4 結(jié)論

在本實驗條件下，連續(xù)96 h的高溫脅迫會顯著抑制美洲鰣抗氧化能力與非特異性免疫能力，尤其是高溫條件（30 ℃）下對其非特異性免疫相關(guān)酶活性會造成抑制作用，可能對肝造成一定程度的損傷。由于美洲鰣對高溫條件的耐受能力較弱，因此，在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)避免高溫，建議養(yǎng)殖溫度控制在28 ℃以下。