尤新新，王晟，都林娜

（溫州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 溫州325006）

養(yǎng)殖場畜禽廢棄物（主要包括畜禽在養(yǎng)殖過程中排放的污水、糞渣），已成為農(nóng)村和農(nóng)業(yè)面臨的主要環(huán)境問題[1]。我國是養(yǎng)豬大國，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，生豬飼養(yǎng)模式逐漸轉(zhuǎn)型為集約化養(yǎng)殖，在該養(yǎng)殖模式下，大量集中的糞便污水排放所引起的環(huán)境污染問題也越來越嚴(yán)重[2]。面對(duì)高有機(jī)質(zhì)、高氨氮含量的豬場污水，國內(nèi)現(xiàn)今處理方式的理論體系和經(jīng)驗(yàn)積累依然不足，處理設(shè)施和流程設(shè)計(jì)也不成熟，致使國內(nèi)大多數(shù)養(yǎng)豬場污水沒有得到有效處理。

在眾多已報(bào)道的豬場糞污水處理方法中，利用復(fù)合微生物制劑進(jìn)行污水凈化處理，是一個(gè)很有發(fā)展前景的領(lǐng)域，也是目前的研究熱點(diǎn)[3-4]。復(fù)合微生物制劑是微生態(tài)制劑的一種，是由多種菌按合適比例復(fù)合配制而成的，以充分發(fā)揮微生物群落成員之間的協(xié)同作用，從而獲得最佳應(yīng)用效果[4]。

微生物原位修復(fù)技術(shù)是指在基本不破壞土體和水體自然環(huán)境條件下，對(duì)受污染對(duì)象不作搬運(yùn)，而在原場利用土著微生物的功能，對(duì)污染物進(jìn)行吸收、轉(zhuǎn)化或降解，從而實(shí)現(xiàn)減緩或最終消除污染的技術(shù)[5]。該修復(fù)技術(shù)是一種從根本上解決環(huán)境污染問題的經(jīng)濟(jì)、健康的發(fā)展方法[6]。我國目前主要側(cè)重于研究復(fù)合菌劑的應(yīng)用效果[7-8]，但由于菌劑的地域適應(yīng)性較弱，穩(wěn)定性不夠，群體結(jié)構(gòu)易受到環(huán)境影響，從而導(dǎo)致菌劑的群體優(yōu)勢被改變[9]。同時(shí)，由于豬場污水的流動(dòng)性及周圍不利的環(huán)境條件易造成菌體在流態(tài)水體中缺少載體、易流失、菌體密度降低等問題，使得微生物凈化作用受到限制[10]。而固定化微生物技術(shù)可降低功能微生物受外界不利因素的影響程度，微生物活性強(qiáng)、密度高，且可縮短反應(yīng)時(shí)間和實(shí)現(xiàn)微生物快速高效分離，具有良好的應(yīng)用前景[11]。小麥麩皮作為小麥生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，來源廣泛，價(jià)格低廉，但由于麩皮的口感粗糙、難以使用等問題，使得麩皮的綜合利用率不高[12]。而小麥麩皮還具有高持水性、持油性及吸附性等特點(diǎn)，麩皮等生物基質(zhì)可以與微生物相互吸附，保護(hù)并提高微生物活性[13]。

基于豬場糞污水污染問題及目前處理措施效果不佳等現(xiàn)狀，本研究以規(guī)?；i場糞污水為研究對(duì)象，利用微生物原位修復(fù)技術(shù)，以污水原液為主要營養(yǎng)來源，通過富集培養(yǎng)內(nèi)源性土著微生物得到內(nèi)源性復(fù)合微生物菌劑，并分析監(jiān)測在污水處理過程中其對(duì)化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand,COD）和氨氮的削減效果，從而篩選出高效去除豬場糞污水的復(fù)合微生物菌劑；進(jìn)一步通過高通量測序，明確該菌劑的主要微生物種類并預(yù)測其功能結(jié)構(gòu)。此外，本研究還比較了高效復(fù)合微生物菌劑和經(jīng)小麥麩皮固定化處理的復(fù)合微生物菌劑的除污效果，旨在為全國畜禽養(yǎng)殖污水科學(xué)合理排放提供科學(xué)依據(jù)，也為養(yǎng)殖企業(yè)對(duì)糞污綜合治理技術(shù)的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬場糞污水樣分別采自浙江省溫州市鹿城區(qū)規(guī)模養(yǎng)殖場（溫州市展宏畜牧有限公司）（標(biāo)記為ZW）及浙江省溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院科技園實(shí)驗(yàn)豬場（標(biāo)記為ZR）。將采集到的糞污水樣裝至采樣瓶內(nèi)，送至實(shí)驗(yàn)室后于室溫下保存，待測。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合微生物菌劑的富集制備

將豬場糞污水置于5 ℃低溫培養(yǎng)箱中，以150 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d，再將振蕩后的糞污水與原液以體積比1∶10的比例混合，繼續(xù)置于相同環(huán)境中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)（以原液作為主要的營養(yǎng)來源），重復(fù)上述步驟，共傳代5 次；然后，將振蕩培養(yǎng)后的糞污水與原液糞污水以體積比1∶10的比例混合，并置于25 ℃常溫培養(yǎng)箱中，以150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，重復(fù)上述步驟，共傳代4次，富集培養(yǎng)得到內(nèi)源性復(fù)合微生物菌劑（標(biāo)記為WKM）。將最終獲得的富集物（含10%甘油）置于-40 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 復(fù)合微生物菌劑的固定化

小麥麩皮經(jīng)超微粉碎機(jī)處理后制成細(xì)麩皮，將細(xì)麩皮和復(fù)合微生物菌劑（WKM）分別以質(zhì)量體積比為0.5∶50、1∶50、2∶50、3∶50、4∶50 和5∶50 進(jìn)行混合，然后分別置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，使細(xì)麩皮和菌劑充分混合均勻，最后通過靜置或離心分離其中的固體成分（包含微生物和麩皮），制得固定化復(fù)合微生物菌劑。同時(shí)，將無添加（CK）、只添加麩皮、只添加WKM作為對(duì)照組，并重復(fù)上述固定化處理步驟。

1.2.3 固定化復(fù)合微生物菌劑的部分除污特性測定

將麩皮固定化復(fù)合微生物菌劑按質(zhì)量體積比為1∶200 的比例投加到豬場糞污水中，并置于通氣條件下孵育，定時(shí)取樣，測定COD和氨氮水質(zhì)指標(biāo)。其中：COD 含量的測定采用重鉻酸鉀法；氨氮含量的測定采用納氏試劑比色法。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

將復(fù)合微生物菌劑送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行高通量測序，并采用Excel 2010和Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，采用SPSS 23.0中的t檢驗(yàn)和單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，并采用GraPhlAn、PICRUSt 和R 軟件對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類及功能預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合微生物菌劑的富集及除污特征

按照1.2.1節(jié)的方法對(duì)豬場糞污水（ZW）中的微生物在常溫下傳代4 次，富集培養(yǎng)得到復(fù)合微生物菌劑（WKM）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在原液COD 質(zhì)量濃度為8 757 mg/L、氨氮質(zhì)量濃度為462.13 mg/L的豬場糞污水（ZW）中加入WKM 處理3 d 后，該復(fù)合微生物菌劑對(duì)豬場糞污水中COD 和氨氮去除率分別達(dá)94.8%和61.8%。

由于菌體在流態(tài)水體中易流失，造成除污效果不穩(wěn)定。因此，本研究對(duì)WKM 進(jìn)行麩皮固定化處理，并將麩皮固定化復(fù)合微生物菌劑（質(zhì)量體積為1∶50）、WKM、麩皮分別以質(zhì)量體積比為1∶200的比例分別投加到浙江省溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院科技園實(shí)驗(yàn)豬場糞污水（ZR）中，原污水的COD 質(zhì)量濃度為2 242 mg/L，各處理去除效果如圖1 所示。與無添加（CK）組相比，只添加WKM 對(duì)污水ZR 中COD 的去除效果有明顯的提高，與投加到污水ZW中的去除效果一致；經(jīng)麩皮固定化后的復(fù)合微生物菌劑對(duì)COD 的去除率進(jìn)一步提高，高達(dá)89.4%，極顯著高于無添加組（P＜0.01）和顯著高于WKM 組（P＜0.05）。說明經(jīng)過麩皮固定化的復(fù)合微生物菌劑，其功能微生物受外界因素沖擊影響較低且活性強(qiáng)、密度高，因此，在污染水體中COD的處理效果相較于WKM 更加穩(wěn)定和高效。此外，經(jīng)麩皮固定化后的復(fù)合微生物菌劑對(duì)氨氮的去除率為32.5%，與無添加組和WKM組相比，去除率稍有下降。

2.2 復(fù)合微生物菌劑的菌種類型及豐度

分別對(duì)復(fù)合微生物菌劑的3 個(gè)平行樣（WKM-1、WKM-2、WKM-3）的16S rRNA 基因進(jìn)行高通量測序，以明確其中的微生物種類及群落結(jié)構(gòu)。圖2為用GraPhlAn 軟件繪制的3 個(gè)平行樣的微生物分類和系統(tǒng)發(fā)育信息可視化圖。根據(jù)樣本的分類學(xué)比對(duì)結(jié)果可知，復(fù)合微生物菌劑的優(yōu)勢微生物主要分布在變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）中。

圖1 固定化復(fù)合微生物菌劑對(duì)豬場糞污水中COD 和氨氮的去除效果Fig.1 Removal efficiencies of COD and ammonia nitrogen in wastewater from pig feedlots treated by the endogenous compound microbial inoculant immobilized with wheat bran

由圖3 可知，在16S rRNA 基因數(shù)據(jù)庫中，在屬水平上，除未分類（unclassified）的序列（36.47%）和其他（other）序列（23.86%）外，檢測到的16S rRNA基因序列主要對(duì)應(yīng)的微生物種類屬于白色桿菌屬（Leucobacter）（4.59%）、卡 斯 特 蘭 尼 菌 屬（Castellaniella）（4.58%）、Camelimonas 屬（4.08%）、Moheibacter 屬（4.14%）、亞 硝 化 單 胞 菌 屬（Nitrosomonas）（3.01%）、Cloacibacillus 屬（3.02%）和尼古丁降解菌屬（Pusillimonas）（2.17%），豐度比例約為2∶2∶2∶2∶1.5∶1.5∶1。

基于16S rRNA基因測序獲得的物種構(gòu)成，利用PICRUSt 軟件推測樣本中的功能基因，從而觀測樣品在更高層級(jí)水平上的功能結(jié)構(gòu)，其中基于直系同源蛋白簇（clusters of orthologous groups of proteins,COG）的功能分布結(jié)果如圖4 所示。在預(yù)測的樣品微生物功能結(jié)構(gòu)中，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（[E]）、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化（[C]）、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（[G]）、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（[P]）、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（[H]）的功能豐度相對(duì)較高。

2.3 固定化復(fù)合微生物菌劑對(duì)豬場糞污水處理的優(yōu)化效果

為分析細(xì)麩皮與WKM按不同比例固定后對(duì)豬場糞污水中COD和氨氮去除率的影響，分別以質(zhì)量體積比為0.5∶50、1∶50、2∶50、3∶50、4∶50 和5∶50 的比例將細(xì)麩皮和WKM進(jìn)行混合，使其相互吸附，并比較其對(duì)豬場糞污水（ZR）的處理效果。從圖5 可以看出：質(zhì)量體積比為1∶50的麩皮固定化復(fù)合微生物菌劑對(duì)COD的去除率高達(dá)89.4%，顯著優(yōu)于質(zhì)量體積比為0.5∶50（COD 的去除率為59.0%）和3∶50（COD的去除率為68.3%）的固定化復(fù)合微生物菌劑的去除效果（P＜0.05）。而質(zhì)量體積比為1∶50的麩皮固定化復(fù)合微生物菌劑對(duì)氨氮的去除率為32.5%，與質(zhì)量體積比為0.5∶50（氨氮的去除率為53.7%）和3∶50（氨氮的去除率為53.4%）的麩皮固定化復(fù)合微生物菌劑相比，有明顯的下降（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

復(fù)合微生物菌劑自20 世紀(jì)70 年代出現(xiàn)至今，已被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境污染治理等環(huán)保領(lǐng)域[14-15]。但由于復(fù)合微生物菌劑的地域適應(yīng)性較弱，群體結(jié)構(gòu)易受到水體流動(dòng)性的影響，因而其凈化效果也受到限制。本研究利用原位修復(fù)技術(shù)，通過富集豬場糞污水內(nèi)源性微生物制備復(fù)合微生物菌劑（WKM），利用土著微生物的性能，同時(shí)通過麩皮固定復(fù)合微生物菌劑，穩(wěn)定了微生物密度，提高了微生物活性，極大地強(qiáng)化了其生物處理效果，特別是對(duì)COD的去除效果顯著提高，極顯著高于無添加組（P＜0.01）。固定化配比優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按質(zhì)量體積比1∶50的比例混合麩皮和WKM后，COD去除效果最佳，達(dá)到89.4%。高云超等[16]對(duì)城市污水處理廠和豬場污水處理站的微生物區(qū)系進(jìn)行篩選并用制備的復(fù)合微生物制劑（CMP）曝氣處理豬場污水3 d 后，該復(fù)合微生物制劑對(duì)豬場污水中COD 的去除率為53.0%～66.7%。楊小龍等[17]從魚塘淤泥和豬場廢水混合液中分離篩選出復(fù)合微生物菌劑，并將其投加到富營養(yǎng)化污水中處理72 h后，該復(fù)合微生物菌劑對(duì)富營養(yǎng)化污水中COD 的去除率達(dá)81.36%。對(duì)比目前已報(bào)道的復(fù)合微生物菌劑，本實(shí)驗(yàn)富集培養(yǎng)的復(fù)合微生物菌劑（WKM）對(duì)污水中COD 的去除效果較好。但不同質(zhì)量體積比的麩皮和WKM 混合對(duì)豬場糞污水中氨氮的去除率為32.5%～53.7%，其去除率比現(xiàn)有報(bào)道的復(fù)合微生物菌劑的氨氮去除率低[17]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，溫度是影響固定化微生物菌劑應(yīng)用效果的重要因素[18-19]。在豬場糞污水中，水溫一直在波動(dòng)，這可能減緩了固定化復(fù)合微生物菌劑的除污效果，與陳誠等利用殼聚糖-海藻酸鈉固定化菌小球處理豬場沼液的結(jié)果[20]相似。同時(shí)，固定化微生物菌劑在投加到豬場糞污水的處理過程中，污水底部的缺氧條件不僅會(huì)對(duì)菌劑的除污效果產(chǎn)生影響，也可能會(huì)增加氨氮的產(chǎn)生并釋放到水體中[21]。因此，后續(xù)研究應(yīng)適當(dāng)增加曝氣等操作，在一定程度上調(diào)節(jié)水溫和增加水體中的溶解氧，以增強(qiáng)其除污效果。

圖2 復(fù)合微生物菌劑（WKM-1、WKM-2、WKM-3）的分類和系統(tǒng)發(fā)育信息圖Fig.2 Classification and phylogenetic information map of WKM-1,WKM-2 and WKM-3

圖3 復(fù)合微生物菌劑（WKM-1、WKM-2、WKM-3）物種豐度熱圖Fig.3 Heat map of the species abundance in WKM-1,WKM-2 and WKM-3

復(fù)合微生物菌劑WKM的優(yōu)勢微生物主要屬于變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。在多數(shù)污水處理工藝的活性污泥中均檢測到變形菌門和擬桿菌門這2類菌群。變形菌門（Proteobacteria）菌群有著多種代謝方式，其中的大多數(shù)細(xì)菌兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活，在豬場糞污水中適應(yīng)性強(qiáng)；擬桿菌門（Bacteroidetes）菌群是化能有機(jī)營養(yǎng)的專性厭氧桿菌，能代謝碳水化合物，可將復(fù)雜的有機(jī)物（如纖維素、淀粉等）水解并降解為乳糖、乙酸、甲酸等[22]，除了去除一般水環(huán)境污染指標(biāo)（COD、氨氮）外，還可能對(duì)豬場糞污水中難降解的有機(jī)物起到一定的削減作用。因此，這2 類菌群能適應(yīng)微生物在載體掛膜后內(nèi)部形成的缺氧甚至厭氧環(huán)境而進(jìn)行生長繁殖[23]。放線菌的主要作用是促使土壤中的動(dòng)植物遺骸腐爛，在自然界的氮循環(huán)中也起著一定的作用[24]。豬場糞污水中糞便較多，氨氮濃度較高，適合放線菌的生存，因此，放線菌也是該菌劑的優(yōu)勢菌群。在屬水平上，亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）細(xì)菌是廢水處理系統(tǒng)中典型的氨氧化菌，與廢水生物脫氮過程密切相關(guān)，在復(fù)合微生物菌劑WKM-1、WKM-2、WKM-3 中均檢測到亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）細(xì)菌，且質(zhì)量占比較大，進(jìn)一步證實(shí)了WKM 具有良好的除污特性。此外，在該復(fù)合微生物菌劑中，白色桿菌屬（Leucobacter）、卡斯特蘭尼菌屬（Castellaniella）、Camelimonas 屬、Moheibacter屬、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、Cloacibacillus屬和尼古丁降解菌屬（Pusillimonas）微生物的豐度比為2∶2∶2∶2∶1.5∶1.5∶1，可為后續(xù)探討多個(gè)單一微生物菌種按比例配制形成的復(fù)合微生物菌劑的除污效果提供依據(jù)，也便于后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)而提高該復(fù)合微生物菌劑的實(shí)用性。同時(shí)，基于COG預(yù)測復(fù)合微生物菌劑的功能結(jié)構(gòu)表明：該復(fù)合微生物菌劑中的微生物對(duì)氨基酸、碳水化合物、無機(jī)離子等具有的轉(zhuǎn)化和代謝功能，對(duì)含高濃度的氨氮和有機(jī)污染物的豬場糞污水中蛋白質(zhì)及脂類等有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換起到至關(guān)重要的作用，能促進(jìn)污水環(huán)境中碳、氮循環(huán)[25]，進(jìn)而加速對(duì)豬場糞污水的除污效果，具有潛在的應(yīng)用和實(shí)踐價(jià)值。

圖4 復(fù)合微生物菌劑（WKM-1、WKM-2、WKM-3）基于直系同源蛋白簇（COG）的功能豐度熱圖Fig.4 Heat map of functional abundance in WKM-1, WKM-2 and WKM-3 based on clusters of orthologous groups of proteins(COG)

圖5 不同比例麩皮與復(fù)合微生物菌劑固定對(duì)豬場糞污水COD和氨氮的去除效果Fig.5 Removal efficiencies of COD and ammonia nitrogen in wastewater from pig feedlots treated by the endogenous compound microbial inoculant immobilized with wheat bran of different ratios