寧麗麗 詹 康 霍俊宏 占今舜 彭 程 楊天宇 趙國琦,2,3*

(1.揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇 揚州 225009；3.揚州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009；4.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200)

反芻動物體內(nèi)的碳水化合物主要經(jīng)過瘤胃微生物發(fā)酵后生成短鏈脂肪酸(Short chain fatty acid, SCFA，包含乙酸、丙酸和丁酸等)，再經(jīng)過糖異生途徑轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟潜粰C體吸收利用[1]。糖異生的主要場所是肝臟，肝臟糖異生可產(chǎn)生血液中80%以上的葡萄糖，因此肝臟糖異生對反芻動物十分重要[2]。反芻動物肝臟主要以丙酸、氨基酸(AA)、乳酸和甘油作為糖異生底物合成葡萄糖。丙酸對反芻動物來說更為重要，因為丙酸是反芻動物肝臟糖異生的主要底物，可為糖異生提供60%以上的碳源[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，向每千克體重的山羊瘤胃灌注1.2 g丙酸后，其血液葡萄糖含量顯著升高[4]。奶牛被灌注160.4 g丙酸，可促進犢牛和泌乳中期奶牛肝臟糖異生[5]；體外培養(yǎng)的犢牛肝細胞添加2.50 μmol/L丙酸可促進肝細胞糖異生[6]。在反芻動物圍產(chǎn)期，肝臟糖異生必須持續(xù)快速地運轉(zhuǎn)，一旦不能滿足其增加的能量需要，就會出現(xiàn)低血糖和能量負平衡現(xiàn)象，導(dǎo)致代謝紊亂[2,7]。在人和大鼠中小腸被認為是糖異生的另一重要器官，在其饑餓和胰島素依賴型糖尿病的情況下會出現(xiàn)小腸糖異生現(xiàn)象[8]。小腸糖異生可能在影響血糖調(diào)節(jié)的門脈系統(tǒng)中起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[9]。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15%～50%的SCFA可以進入反芻動物消化吸收系統(tǒng)末端[10]，這表明部分SCFA可以到達小腸。所以丙酸可能被小腸細胞吸收合成葡萄糖滿足對能量的需求。

丙酸可以直接促進牛肝細胞糖異生途徑相關(guān)基因的表達，包括丙酮酸羧化酶(PC)、細胞質(zhì)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1)和線粒體磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK2)[6]。丙酮酸羧化酶負責(zé)將線粒體中的丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，其啟動子是通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)的活化而被轉(zhuǎn)錄激活[11]；PGC-1α可以調(diào)節(jié)關(guān)鍵的線粒體基因，這些基因有助于促進糖異生途徑[12]。細胞質(zhì)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶負責(zé)將草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸，這是細胞質(zhì)糖異生的關(guān)鍵部分。但是草酰乙酸不能直接穿過線粒體進入細胞質(zhì)，因此PCK2在將草酰乙酸轉(zhuǎn)化為線粒體中的磷酸烯醇丙酮酸中發(fā)揮關(guān)鍵作用。丙酸對山羊小腸上皮細胞PCK2mRNA的調(diào)控作用尚未被研究。丙酸通過腸腦軸誘導(dǎo)糖異生關(guān)鍵基因的表達，對糖代謝和小腸能量穩(wěn)態(tài)有積極的促進作用[13-14]。由瘤胃微生物產(chǎn)生的SCFA 50%～85%直接通過網(wǎng)胃壁吸收，15%～50%的SCFA不通過網(wǎng)胃吸收，而直接進入牛的小腸吸收系統(tǒng)[10]。由此，推測丙酸可激活山羊小腸糖異生基因的表達，因為已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)山羊小腸上皮細胞可以運輸和吸收丙酸[15]，并且丙酸對維持小腸細胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)有促進作用[14]。而Zhan等[16]研究表明小腸上皮細胞可以吸收和運輸丙酸，并且丙酸可以誘導(dǎo)奶牛小腸上皮細胞糖異生途徑關(guān)鍵基因的表達。

之前的研究均集中在反芻動物肝細胞的糖異生途徑，而丙酸對山羊小腸上皮細胞(GIEC)糖異生相關(guān)限速酶基因表達的影響目前尚不清楚。因此本研究旨在探究丙酸對GIEC中關(guān)鍵糖異生基因mRNA表達的影響，包括線粒體的PCK2、PC、果糖1，6二磷酸酶1(FBP1)和PGC1A，為進一步探究丙酸對小腸上皮細胞糖異生途徑的影響提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、非必需氨基酸(NEAA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和胰蛋白酶(Gibco，美國)；丙酸、青霉素、鏈霉素、兩性霉素、L-谷氨酰胺溶液和乙二胺四乙酸(EDTA)(Sigma,美國)；PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa，中國)；熒光定量96孔板和8連管(Bio-rad，美國)；總RNA提取試劑盒(Tiangen，中國)。試驗所用的山羊小腸上皮細胞GIEC[15]由揚州大學(xué)動物培養(yǎng)物保藏與應(yīng)用研究所(IACCA)提供。

1.2 試驗方法

1.2.1不同濃度丙酸對GIEC糖異生途徑相關(guān)基因表達的影響

將GIEC(每孔2×105個細胞)接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后進行不同濃度丙酸對GIEC糖異生途徑相關(guān)基因表達影響的試驗。試驗分為4個處理組，每個處理3個重復(fù)。每個處理組分別添加0、0.75、1.50、和3.00 mmol/L丙酸。放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。孵育6 h后，消化并收集細胞進行RNA提取。

1.2.2丙酸在不同時間點對GIEC糖異生途徑相關(guān)基因表達的影響

將GIEC(每孔2×105個細胞)接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后進行丙酸在不同時間點對GIEC糖異生途徑相關(guān)基因表達影響的試驗。試驗分為2個處理組，每個處理12個重復(fù)。每個處理組分別添加0和3.00 mmol/L丙酸。放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。在培養(yǎng)3、6、12和24 h時，每個處理消化并收集3個重復(fù)的細胞進行RNA提取。

1.2.3總RNA提取

按照總RNA提取試劑盒(Tiangen，中國)提取總RNA。1%凝膠電泳檢測RNA完整性。最后，取 1 μL 提取的樣品進行總RNA濃度和純度的測定。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄成cDNA

按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行，整個過程在冰上操作。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min 和85 ℃ 5 s。

1.2.5Real-time PCR

熒光定量PCR反應(yīng)配置總體系為20 μL，其中SYBR?Premix Ex TaqTMⅡKit 10 μL；10 μmol/L的PCR Forward primer和PCR Reverse Primer各0.8 μL；Water PCR grade 6.4 μL；cDNA 2 μL。引物詳情見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品都有3個重復(fù)。計算方法按照2-ΔΔCt。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

結(jié)果采用“平均數(shù)±標準差”表示。運用SPSS 16. 0統(tǒng)計軟件中的One-Way ANOVA模塊進行單因素方差分析，顯著性檢驗應(yīng)用LSD法。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度丙酸對GIEC中糖異生途徑關(guān)鍵基因mRNA表達的影響

采用qRT-PCR分別檢測GIEC在不同處理中PCK2、PC、FBP1和PGC1AmRNA的表達變化(表2)。與未添加丙酸相比，添加3.00 mmol/L丙酸可顯著提高PCK2和PGC1A的mRNA表達量(P<0.05)；不同濃度的丙酸對PC和FBP1的mRNA表達量沒有顯著影響(P>0.05)，但是添加3.00 mmol/L丙酸對其表達量有上調(diào)的趨勢，并且表達量最高。

表2 不同濃度丙酸對GIEC中糖異生途徑關(guān)鍵基因mRNA表達的影響

2.2 丙酸在不同時間點對GIEC中糖異生途徑關(guān)鍵基因mRNA表達的影響

GIEC在不同處理時間的PCK2、PC、FBP1和PGC1AmRNA的表達變化見圖1。在孵育3、12和24 h時，與未處理組相比，3.00 mmol/L丙酸對PCK2和PGC1A的mRNA表達量沒有顯著影響(P>0.05)；在孵育6 h時，丙酸極顯著增加了PCK2和PGC1A的mRNA表達量(P<0.01)，并且表達量最高，且3.00 mmol/L丙酸對PC和FBP1的mRNA表達量無顯著影響(P>0.05)。

數(shù)據(jù)標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

糖異生主要有2種途徑：一種是使用AA、乳酸、丙酮酸和甘油等經(jīng)典途徑，另一種是使用丙酸作為糖異生底物的途徑[2]。在反芻動物中，后者更為重要，因為后者負責(zé)將60%～ 74%的丙酸在肝臟中轉(zhuǎn)化為葡萄糖，而丙酸是迄今為止含量最豐富的生成葡萄糖的酸(占瘤胃釋放有機酸總量的15%～40%)和糖異生的主要底物[17]。有研究已經(jīng)證明，SCFA可以被人體回腸吸收，SCFA是腸腔中的主要陰離子，是一種易于吸收和代謝的胃腸道特殊能量來源[18]。此外，15%～50%的SCFA可以進入反芻動物消化吸收系統(tǒng)末端[10]，這表明部分SCFA可以到達小腸。反芻動物小腸上皮細胞可以運輸和吸收丙酸[15]，并且丙酸可以促進牛小腸上皮細胞中糖異生基因的表達[16]，這表明丙酸可能誘導(dǎo)山羊小腸細胞中關(guān)鍵糖異生基因的表達。以往的研究主要集中在經(jīng)典的糖異生途徑，但丙酸對山羊小腸上皮細胞糖異生基因表達的影響尚不清楚。因此本試驗主要研究丙酸對山羊小腸上皮細胞中糖異生途徑關(guān)鍵基因表達的影響。

FBP1的功能是催化果糖1,6-二磷酸水解為果糖6-磷酸。ATP的缺乏會降低FBP1的活性和果糖6-磷酸的產(chǎn)量，最終降低葡萄糖產(chǎn)量[24]。本研究結(jié)果顯示，與未處理組相比，3.00 mmol/L丙酸處理后FBP1的mRNA表達量提高了23%，并且在 6 h 時表達量最高，這表明丙酸可以誘導(dǎo)山羊小腸上皮細胞產(chǎn)生更多的果糖6-磷酸來合成葡萄糖。本研究還發(fā)現(xiàn)，GIEC中添加丙酸后并沒有檢測到G6PC的mRNA表達，與Zhan等[16]在牛小腸上皮細胞中的研究結(jié)果一致。在牛肝細胞中添加丙酸、cAMP或胰島素也不會改變G6PC的mRNA表達量[6]。PGC1A是一種調(diào)節(jié)與能量代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄輔激活因子[25]。此外，PGC1A還是一種重要的蛋白質(zhì)，可以上調(diào)糖異生相關(guān)基因的表達，還可以改變PCK啟動子的轉(zhuǎn)錄活性以調(diào)控肝臟中的PCK水平[12]。在本研究中，3.00 mmol/L丙酸處理GIEC顯著增加了PGC1A的mRNA表達量，并且依然在6 h時作用效果最好。

4 結(jié) 論

丙酸可以在山羊小腸細胞中誘導(dǎo)糖異生途徑關(guān)鍵基因PCK2、PC、FBP1和PGC1A的mRNA表達，并且PCK2在GIEC糖異生途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為研究丙酸在誘導(dǎo)糖異生關(guān)鍵基因表達方面提供了新思路。