劉希鵬 張美芳 唐 雯 趙安達 孫 娟 張海峰

隨著人類壽命的延長，中國正逐步進入老年社會，與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease, AD)及其他形式癡呆癥的發(fā)生率正逐漸增長，給社會帶來沉重的醫(yī)療和經(jīng)濟負擔(dān)。有研究表明，高脂飲食可能是AD或者其他神經(jīng)退行性疾病的危險因素[1～3]。研究發(fā)現(xiàn)在高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的大腦組織中，甘油三酯、膽固醇和神經(jīng)酰胺等脂質(zhì)的含量明顯增加，而這些脂質(zhì)代謝紊亂被證明參與了肥胖條件下神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病[3]。

近年來，一種來源于海藻中的硫酸多糖，即巖藻多糖(fucoidan)改善高脂血癥及相關(guān)代謝性疾病的作用受到越來越多的重視[4,5]。有研究顯示，攝入巖藻多糖后可以顯著降低高脂飲食組小鼠血清膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇的水平，并可減少血管動脈粥樣斑塊的形成[6,7]。巖藻多糖也被發(fā)現(xiàn)在AD模型小鼠中能發(fā)揮神經(jīng)保護作用[8]。

神經(jīng)前體細胞(neural precursor cells，NPCs)是一類可以自我更新、并具有多向分化潛能的細胞，在胚胎神經(jīng)發(fā)生和成人大腦的損傷修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用[9]。NPCs的增殖分化活性自發(fā)現(xiàn)以來便備受關(guān)注，有望成為治療神經(jīng)退行性疾病的種子細胞[10～12]。在HFD引起神經(jīng)退行性疾病的過程中，NPCs的分裂增殖和分化活性受到明顯抑制，導(dǎo)致NPCs衰老從而加速神經(jīng)退行性相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展[13,14]。因此，抑制NPCs的衰老，可以保持神經(jīng)系統(tǒng)的再生修復(fù)能力，降低神經(jīng)退行性相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展。

本研究探索了巖藻多糖在高脂飲食誘導(dǎo)NPCs衰老過程中的保護作用以及相關(guān)的分子機制，以期為巖藻多糖防治神經(jīng)退行性疾病發(fā)生、發(fā)展的作用提供依據(jù)。

材料與方法

1.實驗材料與試劑：C17.2細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫；抗p21、p53、SIRT1抗體購自美國Santa Cruz公司,抗LaminB、α-tublin、Nrf2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,所有二抗購自美國Sigma-Aldrich公司,活性氧檢測試劑盒和衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自中國Beyotime公司,SIRT1抑制劑煙酰胺(NAM)、Nrf2抑制劑葫蘆巴堿(trigonelline)購自美國MedChem Express公司,DMEM培養(yǎng)基購自美國 Gibco公司，胎牛血清購自美國FBS公司。其他實驗所需的試劑均購自美國Sigma-Aldrich 公司。

2.C17.2細胞的培養(yǎng)：C17.2細胞在DMEM中培養(yǎng)，輔以10%(v/v)胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺, 100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素。在每次實驗前制備PA-白蛋白復(fù)合物，將棕櫚酸(palmitic acid，PA)在70℃條件下溶于100%乙醇中，再與無脂肪和低內(nèi)毒素的牛血清白蛋白以10∶1(PA∶白蛋白)的比例，在50℃條件下的無血清DMEM培養(yǎng)基中混合6h，PA的最終濃度為100μmol/L，乙醇溶液的最終濃度小于0.5%。巖藻多糖溶解于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，用0.45μm孔濾器滅菌，并在4℃條件下儲存。實驗分為對照組、PA組、PA+巖藻多糖(10μg/ml)組、PA+巖藻多糖+NAM組、PA+巖藻多糖+Trigonelline組，每次實驗細胞刺激時間為72h。

3.衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性的測量：將刺激后的C17.2細胞按照說明書方法進行處理。C17.2細胞置于24孔板內(nèi)進行培養(yǎng)，利用試劑盒附帶的清洗緩沖液進行沖洗，再用固定緩沖液固定細胞5min;利用β-半乳糖苷酶染色液染色16h。將處理完成的C17.2細胞利用倒置顯微鏡觀察細胞衰老情況，細胞被染成藍色說明細胞發(fā)生衰老。相差顯微鏡下計數(shù)陽性細胞數(shù)目，染色陽性細胞數(shù)占500個細胞數(shù)比值表示衰老情況。

4.細胞內(nèi)ROS水平的測定：使用活性氧檢測試劑盒測量C17.2細胞內(nèi)的ROS水平。10μmol/L Rosup刺激C17.2細胞30min作為陽性對照。將C17.2細胞置于24孔板進行培養(yǎng)。細胞受刺激后，利用不含血清的DMEM晃動洗滌24孔板內(nèi)的貼壁細胞3次，然后與熒光探針2′,7′-二氯二氫熒光素(dichlorodihydrofluorescein,DCFH)在37℃、黑暗環(huán)境下孵育20min；DCHF可通過細胞膜，被細胞內(nèi)ROS氧化為高熒光強度的2′,7′-二氯熒光素(dichlorofluorescein,DCF)，可在熒光顯微鏡下進行觀察。利用Hoechst-33258進行細胞核染色，并利用流式細胞儀在488nm激發(fā)波長下測定DCF的熒光強度，以定量細胞內(nèi)的ROS水平。

5.核質(zhì)分離：將C17.2細胞置于100mm細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，PA和巖藻多糖刺激后，用4℃PBS洗滌，懸浮于100μl的低滲緩沖液中[10mmol/L HEPES(pH7.9)、10mmol/L KCl、0.1mmol/L EDTA, 0.1mmol/L EGTA, 10% NP-40, 1mmol/L二硫代蘇糖醇, 1mmol/L甲基苯基甲基磺酰L氟化物和蛋白酶抑制劑]。將細胞在冰上孵育10min使其溶脹，細胞懸液利用渦旋機攪拌10s。然后在14000×g離心2min(4℃)。得到的上清液為細胞質(zhì)提取物，沉淀物為細胞核。將上清液移至新的EP管，沉淀物在50μl高滲裂解液[20mmol/L HEPES(pH 7.9)、400mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、1mmol/L二硫代蘇糖醇、0.5mmol/L甲基苯基甲基磺酰基氟和蛋白酶抑制劑]中再懸浮，并在冰上孵育1h，期間在漩渦機上間歇性攪拌。最后，將混合物以14000×g離心10min，得到的上清液為細胞核部分。

6.蛋白的相對表達強度測定：將細胞用4℃ PBS洗滌2次，然后在4℃ RiPA裂解緩沖液中裂解30min。將該溶液在4℃、12000×g下離心20min，從上清液中提取總蛋白。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)(每樣品20μg)，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%無脂牛奶封閉，并在4℃孵育一抗。在用Tris 緩沖鹽溶液洗滌4次后，在室溫下將膜與結(jié)合辣根過氧化物酶的二級抗體孵育2h。利用增強化學(xué)發(fā)光體系進行檢測，利用Image J軟件測定蛋白的相對表達強度。

結(jié) 果

1.對HFD誘導(dǎo)的NPCs衰老的抑制作用：C17.2細胞衰老特征性染色(β-Gal染色)水平，PA組明顯高于對照組，PA+巖藻多糖組較PA組明顯降低(圖1A)。細胞衰老相關(guān)蛋白p53和p21的表達水平，PA組明顯高于對照組，PA+巖藻多糖組明顯低于PA組(圖1B)。

圖1 巖藻多糖對C17.2細胞β-gal染色及p21、p53蛋白表達的影響

2.對NPCs內(nèi)ROS水平的影響：與對照組比較，PA組C17.2細胞內(nèi)ROS水平明顯增加，PA+巖藻多糖組則顯著降低PA刺激升高的ROS水平(圖2)。

圖2 巖藻多糖對C17.2細胞內(nèi)ROS水平的影響(×200)

3.SIRT1蛋白表達結(jié)果：Western blot法分析顯示，PA組SIRT1蛋白表達明顯低于對照組，而PA+巖藻多糖組可顯著逆轉(zhuǎn)SIRT1的表達降低(圖3A)。為了驗證SIRT1是否在巖藻多糖抑制C17.2細胞衰老過程中發(fā)揮作用，筆者利用一種SIRT1的特異性抑制劑煙酰胺(nicotinamide, NAM)抑制C17.2細胞內(nèi)SIRT1的活性。PA+巖藻多糖+NAM組比PA+巖藻多糖組抗高脂飲食誘導(dǎo)C17.2細胞衰老的作用明顯減弱，表現(xiàn)為衰老細胞的百分比和p53、p21蛋白的表達水平明顯高于PA+巖藻多糖組(圖3B、C)。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)抑制SIRT1之后，C17.2細胞內(nèi)的ROS水平明顯增加(圖3D)。

圖3 SIRT1在巖藻多糖抑制C17.2細胞衰老過程中的作用

4.Nrf2和Nqo1的蛋白表達結(jié)果：Nrf2是細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)控因子，可以調(diào)節(jié)下游抗氧化酶的表達。刺激后Nrf2和Nqo1的蛋白表達明顯上升，并且Nrf2的入核水平也顯著增加(圖4A、B)。當(dāng)加入SIRT1的抑制劑NAM后，Nrf2的入核水平顯著降低，Nqo1的表達顯著降低(圖4B)。利用Nrf2的特異性抑制劑葫蘆巴堿(trigonelline)刺激C17.2細胞后巖藻多糖抑制C17.2細胞衰老的作用被明顯逆轉(zhuǎn)(圖4C)。結(jié)果表明巖藻多糖激活SIRT1抑制C17.2細胞內(nèi)氧化應(yīng)激可能是通過促進Nrf2的表達和入核發(fā)揮作用。

圖4 Nrf2在激活SIRT1抑制C17.2細胞衰老過程中的作用

討 論

長期高脂飲食可以引起機體代謝紊亂，引發(fā)以胰島素抵抗為主要特征的代謝性疾病。有研究發(fā)現(xiàn)脂代謝紊亂還可以改變大腦皮質(zhì)神經(jīng)突觸，影響神經(jīng)細胞線粒體功能和氧化應(yīng)激反應(yīng)，而這些改變與神經(jīng)系統(tǒng)認知功能下降密切相關(guān)[14]。高脂飲食除了損傷神經(jīng)元細胞外，也可以影響神經(jīng)干細胞的功能。神經(jīng)干細胞主要位于大腦側(cè)腦室軸的前腦室下區(qū)和齒狀回的顆粒下區(qū)。正常情況下，神經(jīng)干細胞可以增殖分化成為神經(jīng)元細胞，并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子以補充和修復(fù)受損的神經(jīng)突觸，維持正常的神經(jīng)功能[11]。但是，神經(jīng)干細胞很容易受到多種有害刺激的影響[15]。Park等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在喂養(yǎng)富含PA的高脂飲食后，大腦海馬組織內(nèi)神經(jīng)發(fā)生功能受到明顯抑制，并且引起NPCs凋亡[16]。Wang等[17]也在體外培養(yǎng)的NPCs實驗中觀察到，PA引起NPCs增殖和分化障礙。本研究結(jié)果顯示，PA刺激72h可引起C17.2細胞衰老，進而影響NPCs的生理功能。

氧化應(yīng)激是指細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生超過其抗氧化能力時的狀態(tài)。氧化應(yīng)激與很多病理生理過程密切相關(guān)，是細胞衰老的一個重要誘因[18]。巖藻多糖具有很強的抗氧化活性。已有研究表明，巖藻多糖可以通過抑制細胞氧化應(yīng)激，降低代謝綜合征小鼠的胰島素抵抗和炎性反應(yīng)[19]。并且?guī)r藻多糖還可以通過減少細胞氧化應(yīng)激抑制海馬神經(jīng)細胞的凋亡[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖降低了C17.2細胞的ROS水平，從而抑制C17.2細胞的衰老。

SIRT1是一種NAD+依賴的去乙酰化酶，參與調(diào)控細胞多種生理過程包括調(diào)節(jié)細胞周期、DNA修復(fù)、細胞凋亡、自噬以及細胞衰老等[21]。SIRT1作為一種長壽蛋白，與細胞壽命延長和其他抗衰老作用密切相關(guān)。在哺乳動物體內(nèi)，SIRT1的表達會隨著年齡增加逐漸降低，而當(dāng)敲除SIRT1之后會加速血管內(nèi)皮細胞衰老的速度[22]。相反，當(dāng)細胞過表達SIRT1之后，可以顯著降低細胞氧化應(yīng)激水平，促進細胞分裂增殖，抑制細胞衰老和凋亡[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖顯著促進了SIRT1的表達，并且當(dāng)利用SIRT1抑制劑NAM抑制SIRT1的活性后，巖藻多糖拮抗C17.2細胞衰老的作用被明顯逆轉(zhuǎn)。SIRT1抑制細胞衰老的作用可能與其抗氧化應(yīng)激活性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引起C17.2細胞ROS水平明顯增加。而巖藻多糖可以顯著降低C17.2細胞內(nèi)的ROS水平。當(dāng)利用SIRT1的抑制劑NAM特異性降低SIRT1的活性后，C17.2細胞內(nèi)的ROS水平明顯增加，并且C17.2細胞的衰老特征性染色和衰老相關(guān)蛋白的表達也明顯增加，說明巖藻多糖可能通過促進SIRT1的表達，降低C17.2細胞氧化應(yīng)激水平，進而抑制C17.2細胞衰老。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖在C17.2細胞內(nèi)顯著促進Nrf2的表達水平，并促進Nrf2進入細胞核。Nrf2是調(diào)控細胞氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，同時也是維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)因子。當(dāng)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激時，可以引起Nrf2進入細胞核，誘導(dǎo)下游抗氧化酶如Nqo1等的表達，發(fā)揮抗氧化作用，以維持細胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可以調(diào)節(jié)Nrf2的表達[24]。本研究利用SIRT1抑制劑煙酰胺預(yù)處理C17.2細胞后，Nrf2的表達及入核水平均明顯降低。推測Nrf2在巖藻多糖激活SIRT1抑制細胞氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，巖藻多糖可以顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的NPCs衰老，并且?guī)r藻多糖抑制NPCs衰老可能是通過激活SIRT1/Nrf2信號通路抑制細胞氧化應(yīng)激來發(fā)揮作用的。