曾瑩瑩 胡蔚萍 左依慧 張靜

摘 要 目的：建立小鼠氣道和肺泡部位原代成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，為研究肺內(nèi)成纖維細(xì)胞的區(qū)域性差異提供技術(shù)平臺(tái)。方法：將小鼠雙肺取出并固定后，在體視顯微鏡視野內(nèi)分別分離氣道和肺泡組織塊，并應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法分別進(jìn)行細(xì)胞的體外原代和傳代培養(yǎng)。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察以及細(xì)胞表面標(biāo)志物的免疫熒光檢測(cè)對(duì)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定。此外，采用阿爾瑪藍(lán)法分別檢測(cè)氣道和肺泡部位成纖維細(xì)胞的增殖情況并進(jìn)行比較。結(jié)果：12 h內(nèi)可見(jiàn)分離的原代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，7 d可進(jìn)行傳代。在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀，胞體豐滿(mǎn)，胞質(zhì)均勻，符合成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)，并且細(xì)胞在5代以?xún)?nèi)可保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)和穩(wěn)定的性狀。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，抗波形蛋白染色和抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白染色呈陽(yáng)性，抗細(xì)胞角蛋白染色、抗血管性假血友病因子染色、抗結(jié)蛋白染色均呈陰性，由此表明該分離培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，且純度高達(dá)99%。此外，氣道部位的成纖維細(xì)胞增殖能力顯著高于肺泡部位。結(jié)論：應(yīng)用顯微解剖加組織塊法可成功分離培養(yǎng)小鼠氣道和肺泡部位成纖維細(xì)胞，并且使細(xì)胞在5代以?xún)?nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，從而為探索小氣道壁和肺泡成纖維細(xì)胞功能差異提供必要的細(xì)胞工具。

關(guān)鍵詞 成纖維細(xì)胞 氣道組織 肺泡 小鼠 顯微分離 原代培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q813.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2021）03-0068-05

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81470231，81670030）

Isolation and culture of primary fibroblasts derived from airway and alveolar tissues*

ZENG Yingying， HU Weiping， ZUO Yihui， ZHANG Jing**

（Department of Pulmonary and Critical Care Medicine， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT Objective： To establish mice fibroblasts of airway and alveolar tissues isolation method for primary culture and research use and to provide the platform for the research of regional differences between fibroblasts from the airway and alveolar tissues. Methods： The 6-8 month old mice were sacrificed and the lung were got totally together with trachea. Then the airway tissues and the alveolar tissues were isolated under the stereomicroscope respectively. Primary fibroblasts were cultured by tissue block culture method and were identified by cell morphology and immunofluorescence staining. The proliferative ability of fibroblasts derived from airway and alveolar tissues was analyzed by Alamar blue assay. Results： The fibroblasts derived from airway and alveolar tissues were generally elongated and spindle shaped and were in line with the classic fibroblasts form. Moreover， the primary fibroblasts maintained the steady growing condition within the 5 passages. Further analysis using immunofluorescence revealed that the fibroblasts markers vimentin and α-SMA were positive， cytokeratin staining， desmin staining， and von Willebrand factor staining were negative， which showed that the primary fibroblasts were fibroblasts. In addition， the proliferative ability of fibroblasts derived from airway tissues was significantly higher than that from alveolar tissues. Conclusion： Primary fibroblasts derived from airway and alveolar tissues could maintain good condition within passage 5. And it provided a good cell tool to investigate the functional difference between this kind of fibroblasts.

KEY WORDS fibroblasts； airway； pulmonary alveolus； mice； microisolation； primary culture

慢性阻塞性肺病（慢阻肺）是一種常見(jiàn)的慢性進(jìn)行性疾病，最新研究結(jié)果提示40歲以上人群中發(fā)病率達(dá)到 11.7%，構(gòu)成了重大疾病負(fù)擔(dān)[1-5]。慢阻肺的病理特征是小氣道壁重構(gòu)和肺氣腫，這兩個(gè)解剖上臨近的部位卻呈現(xiàn)截然相反的細(xì)胞外基質(zhì)沉積特點(diǎn)[6-9]，明確其機(jī)制可有助于發(fā)現(xiàn)慢阻肺干預(yù)的新靶點(diǎn)。成纖維細(xì)胞作為肺產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，有助于局部損傷修復(fù)[10-12]。因此，原代分離氣道和肺泡兩個(gè)獨(dú)立部位的成纖維細(xì)胞是探索小氣道壁和肺泡細(xì)胞外基質(zhì)沉積差異的必要細(xì)胞工具。然而，已有研究多采用全肺成纖維細(xì)胞原代分離培養(yǎng)或者細(xì)胞系培養(yǎng)的方法[13-15]。因此，本研究應(yīng)用顯微解剖加組織塊法，探索分離小鼠氣道和肺泡兩個(gè)獨(dú)立部位的原代成纖維細(xì)胞的方法，觀察并鑒定獲取細(xì)胞的功能與性狀特性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周（20～25 g）清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠，購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理獲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理審批，并符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》的相關(guān)要求。

1.1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12 （dulbeccos modified eagle medium/F12）培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸鈉（EDTA）和Hank平衡鹽溶液（HBSS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。無(wú)血清凍存液購(gòu)自蘇州新賽美公司。細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)Corning公司。兔抗小鼠波形蛋白（vimentin）抗體、小鼠抗小鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體、兔抗小鼠角蛋白（cytokeratin）抗體、兔抗小鼠結(jié)蛋白（desmin）抗體、兔抗小鼠血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）抗體、FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗、FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；阿爾瑪藍(lán)（alamar blue）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；麻醉藥Avertin（2，2，2-三溴乙醇溶液）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

體視顯微鏡購(gòu)自德國(guó)萊卡公司；熒光正置顯微鏡，含5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，細(xì)胞超凈臺(tái)，低溫離心機(jī)均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；顯微剪、顯微鑷購(gòu)于上海金鐘公司；硅膠、大頭釘購(gòu)于上海元象醫(yī)療器械有限公司。

1.2 細(xì)胞分離培養(yǎng)

1.2.1 原代氣道和肺泡成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)

原代氣道部位成纖維細(xì)胞：取6～8周的C57BL/6小鼠，經(jīng)腹腔快速注射過(guò)量麻醉藥Avertin（1 000 mg/kg）將小鼠處死后，將其全身置于75%乙醇內(nèi)消毒5 s，在無(wú)菌環(huán)境下剖胸，暴露心肺，將帶有氣管的完整雙肺取出，迅速將其放在裝有預(yù)冷1%雙抗液的PBS中沖洗，用大頭針將雙肺水平固定于預(yù)先備好的裝有硅膠的直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，向皿內(nèi)倒入預(yù)冷HBSS使液面能覆蓋兩側(cè)肺組織。在體視顯微鏡下沿氣管樹(shù)向下分離氣道組織，將分離到的氣道組織剪至1 mm ×1 mm×1 mm大小并將其放入預(yù)冷的無(wú)菌容器內(nèi)，把每20～25塊氣道組織轉(zhuǎn)移至25T的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，使組織塊均勻分布于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入1 ml含50% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶放入細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置24 h。待組織塊貼壁牢固后，再向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)補(bǔ)齊4 ml含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5 d并靜置，從第3～4天開(kāi)始陸續(xù)會(huì)有成纖維細(xì)胞從組織塊周?chē)莱?。?天吸去原來(lái)的培養(yǎng)液，取出組織塊，加入新鮮的含20% FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)液4～5 ml，每2 d換液1次。

原代肺泡成纖維細(xì)胞：在體視顯微鏡下用顯微剪和顯微鑷在肺組織的邊緣剪下肺泡組織，將組織塊剪至約1 mm×1 mm×1 mm大小后放入預(yù)冷的無(wú)菌容器內(nèi)，每20～25塊轉(zhuǎn)移到25T培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，后續(xù)過(guò)程同上。此外，在體視顯微鏡下分離小鼠氣道組織以及周?chē)姆闻萁M織并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色以證實(shí)所分離組織具備氣道和肺泡組織的結(jié)構(gòu)特征。

1.2.2 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至12 d左右，細(xì)胞密度達(dá)到瓶底面積的80%～90%時(shí)，可進(jìn)行首次傳代。按細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行1∶2或者1∶3比例傳代，傳代后的細(xì)胞根據(jù)生長(zhǎng)情況每2 d換液1次，可用無(wú)血清凍存液凍存第2～4代細(xì)胞，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 細(xì)胞鑒定

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

在倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞的形態(tài)特征。

1.3.2 成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定

將培養(yǎng)的第2代細(xì)胞接種于置有蓋玻片的24孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至蓋玻片的70%～80%時(shí)取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定、吹干，按常規(guī)方法進(jìn)行vimentin、α-SMA、cytokeratin、desmin、vWF免疫熒光染色，并設(shè)立陰性對(duì)照（以PBS代替一抗），用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染細(xì)胞核，于熒光顯微鏡下觀察所分離培養(yǎng)細(xì)胞的染色情況。

1.3.3 細(xì)胞增殖能力測(cè)定

用含10%FBS的培養(yǎng)液稀釋對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的氣道和肺泡部位成纖維細(xì)胞后分別接種于96孔板內(nèi)，每孔接種細(xì)胞數(shù)1 000個(gè)，設(shè)置5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各部位設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，另外每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置空白對(duì)照孔。將96孔板放于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8 h以使細(xì)胞貼壁，貼壁后將第1組（0 h）孔內(nèi)原來(lái)的培養(yǎng)液吸出，每孔加入含10%阿爾瑪藍(lán)的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液100 μl，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h后使用545 nm和590 nm雙波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值。其余4組分別在細(xì)胞接種后的24、48、72、96 h分別加阿爾瑪藍(lán)試劑后孵育6 h，并檢測(cè)細(xì)胞各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的熒光值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

組織塊貼壁后的第3～4 d，肺泡和氣道組織塊周邊均出現(xiàn)新遷出的細(xì)胞（圖1）。顯微鏡下細(xì)胞以長(zhǎng)梭狀排列生長(zhǎng)，胞體豐滿(mǎn)，胞質(zhì)均勻，核呈圓形或卵圓形。氣道部位成纖維細(xì)胞在第5代前細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，狀態(tài)良好，性狀穩(wěn)定（圖2A）；肺泡部位成纖維細(xì)胞傳至第5代時(shí)生長(zhǎng)緩慢，狀態(tài)變差，但5代前狀態(tài)良好（圖2B）。兩個(gè)部位的培養(yǎng)細(xì)胞凍存復(fù)蘇后在第5代前生長(zhǎng)狀態(tài)均良好。

2.2 細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果

氣道和肺泡部位成纖維細(xì)胞的抗vimentin免疫熒光染色結(jié)果（圖3A、B）顯示，細(xì)胞骨架呈綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色；抗α-SMA免疫熒光染色結(jié)果（圖3D、E）顯示，細(xì)胞骨架呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色；而抗cytokeratin、desmin和vWF免疫熒光染色，僅細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)無(wú)熒光染色。

2.3 細(xì)胞增殖能力鑒定結(jié)果

采用阿爾瑪藍(lán)法檢測(cè)氣道和肺泡部位成纖維細(xì)胞增殖能力。增殖曲線(xiàn)結(jié)果（圖4）提示，在細(xì)胞生長(zhǎng)48 h后，氣道成纖維細(xì)胞的增殖能力顯著高于肺泡成纖維細(xì)胞（P<0.001），氣道成纖維細(xì)胞倍增時(shí)間約為48 h，而肺泡成纖維細(xì)胞倍增時(shí)間為72～96 h。

3 討論

研究表明，肺組織氣道和肺泡部位的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)量存在很大的差異[8，11，16]，成纖維細(xì)胞是肺組織中產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的主要細(xì)胞[7，17]；同時(shí)慢阻肺的病理機(jī)制是小氣道纖維化（即細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積）和肺氣腫（即細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的缺失）[18]，因此，掌握分離、培養(yǎng)氣道和肺泡部位的成纖維細(xì)胞技術(shù)對(duì)于明確慢阻肺的區(qū)域化病理差異有重要的意義。

現(xiàn)有的肺組織原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的方法主要有組織塊法、酶消化法兩種[13，19]，而且都是關(guān)于全肺肺組織的成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，并未具體到肺內(nèi)不同解剖部位，比如氣道和肺泡部位成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。加之在應(yīng)用酶消化法提取原代成纖維細(xì)胞時(shí)，由于步驟煩瑣，消化時(shí)間長(zhǎng)且需要大量組織塊，限制了分區(qū)域原代成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)的應(yīng)用，因此我們采用組織塊法分離、培養(yǎng)氣道和肺泡部位原代成纖維細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)探索使用顯微解剖技術(shù)分離小鼠氣道和肺泡部位原代成纖維細(xì)胞的方法，并提出簡(jiǎn)單實(shí)用的操作流程：保留有氣管的完整肺組織可使操作者沿氣管樹(shù)走行逐級(jí)向下分離氣道組織；而且在取肺前沒(méi)有用PBS沖洗肺部血管，使肺部血管保留有凝固的紅色血塊，可幫助操作者在顯微視野內(nèi)清晰辨認(rèn)相伴而行的氣管和血管，以保證分離的組織是氣道而非血管。由于最終貼壁的組織塊數(shù)量和大小是原代成纖維細(xì)胞能否爬出以及爬出數(shù)量的決定因素，為了防止組織塊漂浮而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，我們?cè)趯⒓粝碌慕M織塊接種于培養(yǎng)瓶后，向瓶?jī)?nèi)先加入含有50% FBS的1 ml培養(yǎng)液，并維持24 h培養(yǎng)，使組織塊貼壁牢固。經(jīng)過(guò)前期摸索，我們發(fā)現(xiàn)1 ml的液體量既不會(huì)使組織塊漂浮，而且液體表面張力又不會(huì)使組織塊干燥壞死，同時(shí)含有高濃度血清可以給組織塊提供足夠的營(yíng)養(yǎng)。我們的研究結(jié)果也顯示經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)，80%的組織塊均可貼壁并保持組織活性。雖然有研究通過(guò)翻瓶2～4 h培養(yǎng)來(lái)確保組織塊附著在培養(yǎng)瓶上[13]，但是肺泡組織內(nèi)含有氣體、質(zhì)量輕、易于漂浮，2～4 h的時(shí)間或許不會(huì)使組織塊貼壁牢固，再翻動(dòng)培養(yǎng)瓶時(shí)依舊會(huì)使組織塊漂浮。

在對(duì)兩部位成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：氣道部位成纖維細(xì)胞可以穩(wěn)定傳至第5代，其性狀依然保持穩(wěn)定；但肺泡部位成纖維細(xì)胞傳至第5代時(shí)，由于增殖能力的降低，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。該細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)觀察結(jié)果和我們對(duì)兩部位細(xì)胞增殖能力的測(cè)定結(jié)果一致，同時(shí)也從側(cè)面驗(yàn)證了所分離的成纖維細(xì)胞來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同的部位。因此，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，我們均采用第2～4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述，顯微解剖聯(lián)合組織塊法分離培養(yǎng)肺組織氣道和肺泡部位原代成纖維細(xì)胞，可以穩(wěn)定保持組織塊的活性，為細(xì)胞貼壁、增殖提供了良好的基礎(chǔ)條件，能夠特異、高效、簡(jiǎn)便地獲得小鼠肺組織氣道和肺泡部位成纖維細(xì)胞，并穩(wěn)定傳代。該技術(shù)為研究慢阻肺的細(xì)胞外基質(zhì)在氣道和肺泡部位的表達(dá)差異提供了重要的細(xì)胞工具，同時(shí)也為慢阻肺的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究視角。

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