郭敬強(qiáng)，林勝璋

人參皂苷Rg3對(duì)胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管的影響

郭敬強(qiáng)1，林勝璋2*

1. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬五院，麗水市中心醫(yī)院，浙江 麗水 323000 2. 浙江樹(shù)人大學(xué)樹(shù)蘭國(guó)際醫(yī)學(xué)院附屬樹(shù)蘭杭州醫(yī)院，浙江 杭州 310004

探究人參皂苷Rg3對(duì)胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成的影響。裸鼠背側(cè)近右后肢處sc胰腺癌SW-1900細(xì)胞建立胰腺癌皮下移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及人參皂苷Rg3低、高劑量（10、20 mg/kg）組。給藥組ip人參皂苷Rg3，對(duì)照組ip 0.9%氯化鈉溶液，每2天1次，連續(xù)4周。給藥結(jié)束3 d后裸鼠脫頸椎處死，取瘤組織。采用免疫組化法檢測(cè)各組裸鼠瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31表達(dá)，計(jì)算微血管密度；采用qRT-PCR和Western blotting法檢測(cè)各組裸鼠瘤組織中血管內(nèi)皮鈣黏素（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）、絡(luò)氨酸激酶受體A2（erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2）mRNA和蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，人參皂苷Rg3組胰腺癌裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量顯著降低（＜0.05），微血管密度顯著降低（＜0.05），VE-cadherin、EphA2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05）。人參皂苷Rg3可能通過(guò)調(diào)控VE-cadherin、EphA2 mRNA和蛋白表達(dá)，從而抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成。

人參皂苷Rg3；胰腺癌；新生血管；血管內(nèi)皮鈣黏素；絡(luò)氨酸激酶受體A2

胰腺癌是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率位居惡性腫瘤第7位，病死率位居第6位[1]。胰腺癌惡性程度高，由于其生物學(xué)特性，患者早期無(wú)特異性臨床癥狀，病情進(jìn)展迅速，部分患者就診時(shí)已發(fā)展為晚期階段，臨床治療效果不佳[1-2]。目前臨床以手術(shù)、靶向、免疫等治療及化療為主[3]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤新生血管的形成與機(jī)體血液循環(huán)有關(guān)，可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與侵襲[4-5]。因此，基于腫瘤新生血管的研究是開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物的新方向。人參具有顯著的抗腫瘤作用，人參皂苷是其主要活性成分。人參皂苷Rg3具有抑制新生血管形成的作用[6-8]，臨床常將以人參皂苷Rg3為主要活性成分的參一膠囊用于多種腫瘤的輔助治療。本研究通過(guò)建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，考察人參皂苷Rg3對(duì)裸鼠腫瘤新生血管的影響，并探討人參皂苷Rg3抑制胰腺癌新生血管形成的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/C裸鼠，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SYXK（浙）2015-0009。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度40%～60%，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)wydw2019-0012）。

1.2 細(xì)胞

胰腺癌SW-1990細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.3 藥品與試劑

人參皂苷Rg3（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海博蘊(yùn)生物科技有限公司；血管內(nèi)皮鈣黏素（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）抗體購(gòu)自美國(guó)abgent公司；絡(luò)氨酸激酶受體A2（erythropoietin- producing hepatocellular receptor A2，EphA2）抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司；CD31抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；山羊抗鼠生物素標(biāo)記的抗體購(gòu)自美國(guó)Earthox公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；免疫組化二步法試劑盒、DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.4 儀器

Elx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（奧地利KIALAB公司）；電泳儀、電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；TS100倒置顯微鏡、E4500型照相機(jī)（日本Nikon公司）；Image-proplus 6.0免疫組化彩色圖像（美國(guó)Media Cybemetics公司）；GS-15R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SW-1990細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 動(dòng)物模型建立、分組與給藥

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW-1990細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為3×106/L，于裸鼠背側(cè)近右后肢處sc 100 μL細(xì)胞懸浮液，1周后，按照文獻(xiàn)方法[9]，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及人參皂苷Rg3低、高劑量（10、20 mg/kg）組，每組8只。人參皂苷Rg3溶于生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為l mg/mL的溶液，給藥組ip人參皂苷Rg3，對(duì)照組ip 0.9%氯化鈉溶液，每2天1次，連續(xù)4周。給藥結(jié)束3 d后，裸鼠脫頸椎處死，取瘤組織，稱(chēng)定瘤質(zhì)量并計(jì)算人參皂苷Rg3的抑瘤率。

抑瘤率＝(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量

2.3 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影響

各組瘤組織于4%多聚甲醛中固定48 h，縱行切取瘤組織，于自動(dòng)組織處理機(jī)處理并切片，采用免疫組化法檢測(cè)血管標(biāo)志物CD31表達(dá)情況。根據(jù)Weidner計(jì)數(shù)方法，鏡下觀察微血管呈棕色的單個(gè)或成簇細(xì)胞，在100×光鏡下尋找病灶微血管密度高的區(qū)域，在400×光鏡下隨機(jī)計(jì)算5個(gè)視野下的微血管數(shù)，計(jì)算其平均值，作為腫瘤微血管密度。

2.4 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2 mRNA表達(dá)的影響

按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取瘤組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-AAGCGTGAGTCGCAA-3’、下游引物5’-TCTC- CAGGTTTTCGC-3’；上游引物5’-GAGGGC- GTCATCTCCAAATA-3’、下游引物5’-TCAGACAC- CTTGCAGACCAG-3’；上游引物5’-GAGT- CAACGGATTTGGTCGT-3’、下游引物5’-TTGATT- TTGGAGGGATCTCG-3’。

2.5 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表達(dá)的影響

取100 mg瘤組織，加入0.8 mL裂解液研磨，于冰上孵育30 min，40 ℃、12 000 r/min離心5 min；超聲裂解3次，40 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清，采用BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣本經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入VE-cadherin、EphA2抗體，于4 ℃孵育過(guò)夜；TBS洗滌3次，加入山羊抗鼠生物素標(biāo)記的抗體，室溫孵育2 h；TBS洗滌3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯像，采用Alpha Ease FC 4.0軟件分析結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

3.2 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影響

如圖1和表2所示，與對(duì)照組比較，人參皂苷Rg3組皮下移植瘤微血管密度顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

表1 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤的影響()

與對(duì)照組比較：*＜0.05，下表同

*< 0.05control group, same as below tables

圖1 人參皂苷Rg3對(duì)胰腺癌裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影響(×400)

表2 人參皂苷Rg3對(duì)胰腺癌裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影響()

3.3 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2 mRNA表達(dá)的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤中和mRNA水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

3.4 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表達(dá)的影響

如圖2和表4所示，與對(duì)照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤中VE-cadherin和EphA2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

表3 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2 mRNA表達(dá)的影響()

圖2 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表達(dá)的影響

4 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤的微血管生成密切相關(guān)，微血管生成可作為腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后的重要指標(biāo)[10]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量降低，微血管生成減少，表明人參皂苷Rg3通過(guò)抑制荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管生成，從而抑制皮下移植瘤生長(zhǎng)。局部的毛細(xì)血管基底膜降解，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并遷移，內(nèi)皮細(xì)胞形成新的毛細(xì)血管。VE-cadherin僅在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，是內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞極性和完整性中發(fā)揮重要作用。VE-cadherin的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，VE-cadherin可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤病灶的黏附、遷移，促進(jìn)病灶內(nèi)新生血管的形成[11]，且與腫瘤體積呈正相關(guān)[12-13]。EphA2是Eph受體絡(luò)氨酸激酶家族成員之一，在多種惡性腫瘤或細(xì)胞株中高表達(dá)[14]。EphA2與其配體Ephrin A1結(jié)合后，激活下游胞質(zhì)底物蛋白，在腫瘤新生血管形成中發(fā)揮重要作用[15]。阻斷EphA2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或阻斷EphA受體酪氨酸激酶可抑制腫瘤血管生成[14]。研究發(fā)現(xiàn)，VE-cadherin可重新分布EphA2的配體，使EphA2與EphrinA1結(jié)合[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低，提示人參皂苷Rg3可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，下調(diào)VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表達(dá)，阻止EphA2與其配體結(jié)合，阻斷EphA2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

表4 人參皂苷Rg3對(duì)荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表達(dá)的影響()

本研究表明，人參皂苷Rg3可抑制VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表達(dá)，抑制瘤組織血管生成，從而提高荷瘤裸鼠生存質(zhì)量。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of ginsenoside Rg3on neovascularization of subcutaneous transplantation tumor of pancreatic cancer in nude mice

GUO Jing-qiang1, LIN Sheng-zhang2

1. Fifth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Lishui Central Hospital, Lishui 323000, China 2. Shulan Hangzhou Hospital Affiliated to Zhejiang Shuren University, Shulan International Medical College, Hangzhou 310004, China

To explore the effect of ginsenoside Rg3on the angiogenesis of subcutaneously transplanted tumor of pancreatic cancer in nude mice.Back of nude mice near the right hind limb were sc pancreatic cancer SW-1900 cells to establish a pancreatic cancer subcutaneous transplantation tumor model. Tumor-bearing nude mice were randomly divided into control group, low- and high-dose ginsenoside Rg3(10, 20 mg/kg) groups. Rats in administration group were ip ginsenoside Rg3and rats in control group were ip 0.9% sodium chloride solution, once every 2 d for four consecutive weeks. Three days after administration, nude mice were sacrificed by cervical vertebrae, and tumor tissues were collected. Immunohistochemical method was used to detect the expression of endothelial cell marker CD31 in the tumor tissues of nude mice, and the microvessel density was calculated. qRT-PCR and Western blotting were used to detect vascular endothelial cadherin (VE-cadherin), erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2 (EphA2) mRNA and protein expression levels.Compared with the control group, the weight of subcutaneously transplanted pancreatic cancer nude mice in ginsenoside Rg3group were significantly reduced (< 0.05); Microvessel density were significantly reduced (< 0.05), mRNA and protein expression levels of VE-cadherin and EphA2 were significantly reduced (< 0.05).Ginsenoside Rg3can regulate the expression of VE-cadherin and EphA2 mRNA and protein expression, thereby inhibiting the angiogenesis of subcutaneously transplanted pancreatic cancer in nude mice.

ginsenoside Rg3; pancreatic cancer; angiogenesis; vascular endothelial cadherin; erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2

R285.5

A

0253 - 2670(2021)06 - 1668 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.015

2020-10-25

郭敬強(qiáng)，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，從事肝膽胰臨床研究。

林勝璋，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事肝膽胰腫瘤治療基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail: wzfz1sz@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]