李文兵，群 培，蔡曉霞，蔣敏桃，海來約布，黃艷菲，楊正明，張紹山，陳 晨，劉 圓

基于質(zhì)量守恒定律的藏藥佐塔質(zhì)量控制研究

李文兵1, 2，群 培3, 4，蔡曉霞2, 4，蔣敏桃5，海來約布2, 4，黃艷菲1, 2，楊正明1, 2，張紹山1, 2，陳 晨1, 2，劉 圓2, 6*

1. 西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041 2. 四川省羌彝藥用資源保護與利用技術工程實驗室，四川 成都 610225 3. 西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院，西藏 拉薩 850000 4. 西南民族大學藥學院，四川 成都 610041 5. 成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137 6. 西南民族大學民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041

建立藏藥佐塔中單質(zhì)硫和HgS含量測定方法，并根據(jù)質(zhì)量守恒定律制定合理限度，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。采用結晶法分離純化佐塔中單質(zhì)硫，X射線單晶衍射進行結構鑒定；高效液相色譜法測定佐塔樣品中單質(zhì)硫含量，硫氰酸銨容量法測定HgS含量；根據(jù)佐塔炮制過程中水銀和硫黃等比例加入特點，采用質(zhì)量守恒定律計算單質(zhì)硫和HgS限度及八金八礦灰添加量。佐塔中分離得到的單質(zhì)硫屬斜方晶系S8，空間群Fddd，晶胞參數(shù)＝1.046 2(9) nm，＝ 1.286 3(9) nm，＝2.448 3(2) nm，＝3.294 8(5) nm3，＝＝＝90°，＝16，(000)＝2049；9批佐塔中單質(zhì)硫質(zhì)量分數(shù)在35.35%～40.66%，HgS質(zhì)量分數(shù)在53.54%～56.33%；根據(jù)Hg＋S→HgS化學反應方程式及質(zhì)量守恒定律可推算，佐塔中單質(zhì)硫和HgS最大限量分別為42.0%和58.0%，9批佐塔中八金八礦灰添加量為2.96%～8.33%。通過測定佐塔中單質(zhì)硫和HgS含量，不僅可較全面評價佐塔質(zhì)量，還能計算八金八礦灰等輔料加入量，為其質(zhì)量標準建立及后續(xù)炮制工藝規(guī)范化研究提供參考。

藏藥；佐塔；質(zhì)量守恒定律；單質(zhì)硫；硫化汞；質(zhì)量控制；結晶法；HPLC法；硫氰酸銨容量法；八金八礦灰

佐塔是藏語仁青歐曲佐珠欽木（????????????????????????????????）的簡稱，有佐太、佐臺等不同譯法，是藏藥復方制劑中重要的佐劑，為生產(chǎn)仁青常覺、仁青芒覺、七十味珍珠丸等藏藥名貴制劑的重要原料[1]。藏醫(yī)藥理論認為佐塔與諸藥相配，能起到增強療效、降低毒性的作用，被譽為“藏藥之母本”“藏藥寶中寶”[2]。佐是指煉制，塔指灰、粉末，佐塔是指煮煉之灰，即將水銀經(jīng)過洗煉、煮煉等過程祛污除毒后，加入硫黃、八金八礦灰炮制而成[3]。佐塔代表藏藥炮制最高水平，在2006年被列入國家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)保護目錄。

佐塔的炮制需經(jīng)歷煅灰、洗煉、煎煮等多種工序，加入上百種輔料，歷時40余天才能完成，具有炮制工藝繁瑣，輔料復雜，保密性強等特點[4]，且含大量Hg、Pb、As等重金屬及有害元素，使得其安全性、炮制工藝規(guī)范化和質(zhì)量控制等一直是研究熱點和難點。近年來，國內(nèi)學者對于佐塔的研究，多集中在化學成分[5-7]、藥理[8-9]、毒理[10-12]、質(zhì)量標準[13]等方面。但在質(zhì)量標準研究方面多以HgS或重金屬元素含量為指標，尚未有對佐塔中單質(zhì)硫的形態(tài)及含量的研究，難以全面反映和控制佐塔的質(zhì)量?，F(xiàn)代研究表明，單質(zhì)硫具有消炎、鎮(zhèn)咳、祛痰等藥理作用[14]，內(nèi)服至腸內(nèi)可生成硫化氫，從而刺激腸壁，增加腸道蠕動[15]，這可能是佐塔與諸藥相配增強療效的機制之一。因此，對佐塔中單質(zhì)硫的形態(tài)及含量研究意義重大。本研究首次從佐塔中分離得到8個S原子組成的斜方晶系S8，并通過X射線單晶衍射技術進行結構鑒定，采用HPLC法和硫氰酸銨容量法分別測定單質(zhì)硫和HgS含量，并結合佐塔炮制過程中水銀和硫黃等量加入的特點，根據(jù)質(zhì)量守恒定律推算出單質(zhì)硫和HgS的最大限量及八金八礦灰等輔料的添加量，可為后續(xù)其質(zhì)量標準的建立及炮制工藝規(guī)范化研究奠定堅實基礎。

1 儀器與試藥

D8 QUEST X-射線單晶衍射儀，德國布魯克公司；Waters2695-2996型高效液相色譜儀，美國沃特世公司；ME204E型電子天平，Mettler Toledo公司；1810A摩爾原子型超純水器，上海摩勒科學儀器有限公司；KQ5200DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DB-1A數(shù)顯恒溫電熱板，常州市英格爾儀器制造有限公司。

單質(zhì)硫，批號F2015082，質(zhì)量分數(shù)99.99%，購于Aladdin公司；HgS（II），批號012992，質(zhì)量分數(shù)99.999%，購于Alfa Aesar公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

不同批次佐塔樣品（編號分別為ZT0901、ZT0902、ZT0903、ZT0904、ZT0905、ZT0906、ZT0907、ZT0908、ZT0909）分別由甘孜藏族自治州藏醫(yī)院、西藏自治區(qū)藏醫(yī)院、甘南藏族自治州藏醫(yī)院、德格縣藏醫(yī)院、德格縣宗薩藏醫(yī)院、青海省藏醫(yī)院、青海久美藏醫(yī)院、青海塔爾寺藏醫(yī)院、阿壩藏族羌族自治州藏醫(yī)院提供。

2 方法與結果

2.1 單質(zhì)硫分離與鑒定

2.1.1 樣品處理 取佐塔樣品2 g，加入50 mL二硫化碳超聲處理（功率600 W，頻率40 kHz）30 min，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，濾液加入50 mL無水乙醇，搖勻，至通風櫥內(nèi)，室溫（20 ℃）結晶，得淡黃色塊狀晶體578 mg。

2.1.2 結構鑒定 采用D8 QUEST X射線單晶衍射儀對分離的晶體結構進行測定，即在室溫下選取尺寸為34 μm×62 μm×151 μm的晶體置于衍射儀上，以石墨單色Cu-K α射線為衍射光源（＝154.178 pm記錄該晶體的數(shù)據(jù)，用Bruker SAINT結構解析。晶體學數(shù)據(jù)見表1～4，與文獻報道一致[16]，說明該淡黃色晶體為8個S原子組成的斜方晶系S8，即單質(zhì)硫，結構式見圖1。

2.2 單質(zhì)硫含量測定

2.2.1 色譜條件 Hypersll ODS-2 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（95∶5），檢測波長為260 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃。在選定條件下，單質(zhì)硫色譜峰與樣品中其他組分色譜峰達基線分離，其理論塔板數(shù)（）大于5000，色譜圖見圖2。

表1 晶體結構參數(shù)

表2 原子坐標與等效各向同性位移參數(shù)

U(eq)＝(U11＋U22＋U33)/3

表3 鍵長和鍵角參數(shù)

表4 各向異性原子位移參數(shù)

圖1 單質(zhì)硫(S8) 結構式

2.2.2 對照品溶液的制備 取單質(zhì)硫對照品適量，置于5 mL量瓶內(nèi)，用二硫化碳制成4.358 mg/mL對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液適量，依次用無水乙醇稀釋，得2.179、1.090、0.545、0.272、0.136 mg/mL系列對照品溶液。

圖2 單質(zhì)硫對照品溶液(A) 和佐塔樣品(B) 的HPLC圖

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率600 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用無水乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”項下單質(zhì)硫系列對照品溶液，進樣10 μL，測定各色譜峰峰面積。以對照品進樣量為橫坐標（），色譜峰峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線，計算回歸方程。結果單質(zhì)硫回歸方程為＝1 203.25＋470.43，＝0.999 8，結果表明單質(zhì)硫進樣量在1.362～21.790 μg線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定單質(zhì)硫峰面積，其RSD為0.21%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一批佐塔樣品（批號ZT0901）6份，分別按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，進樣10 μL，測定峰面積，計算單質(zhì)硫含量。結果S8平均質(zhì)量分數(shù)為35.35%，RSD為1.52%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一佐塔供試品溶液（批號ZT0901），分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定峰面積，結果單質(zhì)硫峰面積的RSD為0.18%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品（批號ZT0901，S的質(zhì)量分數(shù)為35.35%）約0.05 g，共6份，精密稱定，分別精密加入16 mg的單質(zhì)硫對照品，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，進樣10 μL，測定峰面積，計算加樣回收率。結果表明S平均加樣回收率為97.72%，RSD為1.11%，表明該方法準確度良好。

2.2.9 樣品含量測定 取9批佐塔樣品，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，進樣10 μL，測定峰面積，計算單質(zhì)硫的含量，結果見表5。

2.3 HgS含量測定

2.3.1 測定方法 取本品粉末約0.3 g，精密稱定，置錐形瓶中，加硫酸10 mL與硝酸鉀2.0 g，加熱使其溶解，放冷，加水50 mL，并加1%高錳酸鉀溶液至顯粉紅色，再滴加2%硫酸亞鐵溶液至紅色消失后，加硫酸鐵銨指示液2 mL，用硫氰酸銨滴定液（0.1 mol/L）滴定。每毫升硫氰酸銨滴定液（0.1 mol/L）相當于11.63 mg的HgS。

2.3.2 線性關系考察 分別取HgS（II）0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 g，精密稱定，按“2.3.1”項測定方法測定HgS的含量。以HgS的質(zhì)量為橫坐標（），硫氰酸銨滴定液滴定的體積為縱坐標（），繪制標準曲線，計算回歸方程。結果回歸方程為＝85.54－0.41，＝0.999 6，表明HgS質(zhì)量在0.05～0.40 g線性關系良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批佐塔樣品（批號ZT0909）6份，分別按“2.3.1”項方法制備供試品溶液，測定HgS的含量。結果HgS平均質(zhì)量分數(shù)為54.51%，RSD為0.32%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品（批號ZT0909，硫化汞的質(zhì)量分數(shù)為54.51%）約0.15 g，共6份，精密稱定，分別精密加入80 mg的HgS（II）對照品，按“2.3.1”項方法制備供試品溶液，并測定HgS含量，計算加樣回收率。結果表明平均加樣回收率為99.60%，RSD為0.54%，說明該方法準確度良好。

2.3.5 樣品含量測定 取9批佐塔樣品，按“2.3.1”項方法制備供試品溶液，并測定樣品中HgS含量，結果見表5。

2.4 基于質(zhì)量守恒定律的佐塔中主要成分及輔料限度推算

佐塔是以水銀和硫黃為主要原料，再輔以八金灰（金、銀、鐵等8種金屬灰）、八礦灰（自然銅、金礦石、銀礦石等8種礦石灰）炮制而成。在炮制過程中尚需加入大量的動、植、礦物對水銀進行祛毒處理。

由于“佐塔”的炮制工藝屬于機密，不同藏醫(yī)院工藝和輔料也不盡相同，使得其炮制工藝規(guī)范化和質(zhì)量控制標準化存在一定難度。課題組前期通過文獻查閱[17]和各藏醫(yī)院調(diào)研發(fā)現(xiàn)，不同藏醫(yī)院炮制佐塔所用輔料種類和數(shù)量雖有所差別，但最后一步祛毒后的水銀和硫黃均為等比例（質(zhì)量）加入，并加入一定比例的八金八礦灰，因此，可根據(jù)水銀和硫黃化學反應方程式（Hg＋S→HgS）及質(zhì)量守恒定律來計算佐塔中HgS、過量S的最大限量以及八金八礦灰添加量。

2.4.1 單質(zhì)硫和HgS限度 根據(jù)Hg和S物質(zhì)的量比為1∶1反應，當?shù)荣|(zhì)量的Hg和S加入時，S出現(xiàn)過量，因此，根據(jù)質(zhì)量守恒定律，可以推算出佐塔中HgS的質(zhì)量分數(shù)為＝/(21＋2)，式中為HgS的質(zhì)量分數(shù)，為佐塔中HgS質(zhì)量，1為加入水銀或硫黃質(zhì)量，2為加入八金八礦灰質(zhì)量。

由于Hg完全反應，因此，＝×232.65/(2××200.60＋2)＝232.65/(401.20＋2/)。

同理，佐塔中過量的單質(zhì)硫的質(zhì)量分數(shù)計算公式為＝(×200.60－×32.05)/(2××200.60＋2)＝168.55/(401.20＋2/)，式中為HgS的物質(zhì)的量。

當八金八礦灰添加量2＝0時，佐塔中單質(zhì)硫和HgS質(zhì)量分數(shù)最高，分別為42.01%和57.99%。含量測定結果也表明，9批佐塔中單質(zhì)硫質(zhì)量分數(shù)在35.35%～40.66%，HgS質(zhì)量分數(shù)在53.54%～56.33%，均在最大限度范圍內(nèi)，說明根據(jù)質(zhì)量守恒定律推斷的單質(zhì)硫和HgS最大限量具可行性。根據(jù)9批佐塔樣品含量測定結果，暫定單質(zhì)硫為30%～42%，HgS為50%～58%。

2.4.2 八金八礦灰添加量 由于HgS較單質(zhì)硫的化學性質(zhì)穩(wěn)定，八金八礦灰中含Hg量相對于佐塔中Hg的加入量可忽略不計，因此，通過硫氰酸銨容量法測定佐塔中HgS含量后，可使用公式＝×232.65/(2××200.60＋2)＝232.65/(401.20＋2/)計算佐塔中八金八礦灰添加量，結果見表5。

表5 不同批次佐塔中單質(zhì)硫和HgS含量及八金八礦灰添加量

3 討論

佐塔的炮制又稱水銀煉制法，始載于《四部醫(yī)典（后序）》[18]中，其后珠欽?烏堅巴對其炮制工藝有較為詳細的描述[19]。佐塔是以劇毒水銀為主要原料，經(jīng)洗、煮等多種工藝，上百種動、植、礦物輔料祛污除毒后，再與等質(zhì)量的硫黃及一定比例的八金八礦灰煉制而得，是藏醫(yī)藥中非常獨特的一項制藥技術，代表了藏藥炮制最高水平，具有不可替代的醫(yī)療和政治地位。由于佐塔的炮制具有工藝繁瑣、輔料復雜、保密性強等特點，使得其炮制工藝規(guī)范化、質(zhì)量控制標準化一直作為瓶頸問題限制了其發(fā)展。

目前，國內(nèi)學者對佐塔質(zhì)量標準研究主要是以HgS為指標，尚有50%左右的成分未得到有效控制。本研究采用結晶法，首次從佐塔中分離得到S8，并通過X射線單晶衍射鑒定為8原子S組成的斜方晶系S8。并以此為指標，建立了HPLC含量測定方法，與常規(guī)的酸堿滴定法和氧瓶燃燒法相比，具有簡單、快速、準確性高等優(yōu)點。

在供試品制備過程中，考慮到單質(zhì)硫極性較小，易溶于二硫化碳，在甲醇、乙醇等微溶，但由于二硫化碳極性小，毒性大，對實驗人員和儀器都有一定的影響，因此，采用無水乙醇作為樣品提取溶劑，考察不同料液比對其影響，結果表明，當料液達1∶1000時，能將佐塔中單質(zhì)硫提取完全。通過測定單質(zhì)硫和HgS的含量，可控制佐塔中90%以上成分，使其質(zhì)量基本可控?；谄湓谂谥七^程中，水銀和硫黃等質(zhì)量加入這一特點，根據(jù)Hg＋S→HgS化學反應方程式及質(zhì)量守恒定律，可計算HgS和過量單質(zhì)硫最大限量，為其單質(zhì)硫和HgS的合理上下限度的制定提供理論依據(jù)。

佐塔在炮制工藝復雜，且高度保密，不同藏醫(yī)院所有輔料種類和數(shù)量有一定差別，給其工藝規(guī)范化研究帶來了困難。本研究通過佐塔中HgS的含量，根據(jù)質(zhì)量守恒定律還可計算八金八礦灰添加量，在佐塔炮制工藝保密的情況下，探索出一條工藝規(guī)范化研究模式，可為藏藥佐塔及其他炮制品的研究提供一種新思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality control of Tibetan medicine Zuota based on law of conservation of mass

LI Wen-bing1, 2, QUN Pei3, 4, CAI Xiao-xia2, 4, JIANG Min-tao5, HAILAI Yue-bu2, 4, HUANG Yan-fei1, 2, YANG Zheng-ming1, 2, ZHANG Shao-shan1, 2, CHEN Chen1, 2, LIU Yuan2, 6

1. Institute of Qinghai-Tibetan Plateau, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China 2. Sichuan Provincial Technology Engineering Laboratory of Qiang-Yi Medicinal Resources Protection and Utilization, Chengdu 610225, China 3. Tibetan Institute for Food and Drug Control, Lasa 850000, China 4. College of Pharmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China 5. School of Pharmacy, Chengdu University of TCM, Chengdu 611137, China 6. Ethnic Medicine Institute, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China

The study aims to establish a method for the determination of contents of elemental sulfur (S) and HgS in Zuota, a Tibetan medicine, and set a reasonable limitation of their contents based on the law of conservation of mass, so as to provide a basis for its quality control.The method of crystallization method was used to separate and purify the sulfur in Zuota, and the method of X-ray diffraction was used for its structure identification. The method of HPLC and NH4SCN titration method were used to determine the contents of S and HgS in Zuota, respectively. According to the characteristics of mercury and sulfur added at the same proportion in the process of Zuota, the limitation of S and HgS, and the added content of eight kinds of metal ash and eight mineral ash were calculated by the law of conservation of mass.S isolated from Zuota belonged to orthorhombic system of S8, the spatial group of Fddd. The cell parameters were= 1.046 2(9) nm,=1.286 3(9) nm,=2.448 3(2) nm,= 3.294 8(5) nm3,=== 90°,= 16,(000) = 2049. The contents of S and HgS in nine batches of Zuota were 35.35%—40.66% and 53.54%—56.33%, respectively. According to the chemical reaction equation of Hg + S→HgS and the law of conservation of mass, the max limited contents of S and HgS in Zuota should not more than 42.0% and 58.0%, respectively. The additive amount of eight kinds of metal ash and eight mineral ash in nine batches of Zuota was 2.96%—8.33%.By determining the contents of S and HgS in Zuota, not only the quality of Zuota could be assessed comprehensively, but also the amount of eight kinds of metal ash, eight mineral ash and other things which were used as auxiliary materials could be speculated. This study can provide a useful reference for the research on the standardization of processing technology and establishment of quality standards of Zuota.

Tibetan medicine; Zuota; law of conservation of mass; elemental sulphur; mercuricsulfide; quality control; crystallization method; HPLC; NH4SCN titration method; eight kinds of metal ash and eight mineral ash

R283.6

A

0253 - 2670(2021)06 - 1608 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.008

2020-10-11

國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1708005）；四川省藥品監(jiān)督管理局項目（510201201810173）；西南民族大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資助（2020NGD01）

李文兵（1988—），男，博士，高級工程師，研究方向為民族藥炮制工藝及質(zhì)量標準研究。Tel: 13540876731 E-mail: 285892232@qq.com

劉 圓（1968—），女，博士生導師，教授，從事少數(shù)民族藥物研究和教學。Tel: (028)85528812 E-mail: 499769896@qq.com

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