彭 燕，鄭細閏，劉紅英，何青蓮，鄭廣娟

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一[1]。術(shù)前新輔助化療在局部晚期乳腺癌患者的治療中發(fā)揮了重要作用，并取得了較好的臨床療效[2]。HER-2是位于17號染色體上的跨膜蛋白，具有跨膜酪氨酸激酶活性，10%～25%的乳腺癌組織中可以檢測到HER-2蛋白過表達[3-4]，因此HER-2基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。目前，臨床常用的檢測方法主要為免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)及熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)，雖廣泛運用但仍存在一定判讀問題[5]。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)是一種檢測核酸分子的絕對定量技術(shù)，其運用直接的計數(shù)目標基因和參照基因(已知拷貝數(shù))數(shù)目，通過計算其比值，就可得到目標基因的拷貝數(shù)[5]。本實驗利用ddPCR技術(shù)檢測乳腺癌新輔助化療前后的HER-2擴增情況，并與IHC聯(lián)合FISH檢測這一傳統(tǒng)檢測方法進行結(jié)果對比，驗證ddPCR檢測的可行性，為臨床選擇該檢測方法提供可靠性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料本實驗通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院病歷系統(tǒng)及朗伽病理系統(tǒng)收集了確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者62例(術(shù)前均未接受放、化療及內(nèi)分泌治療、靶向藥物等新輔助治療的穿刺活檢組織和經(jīng)過規(guī)范新輔助化療后的手術(shù)根治標本)納入實驗，編號為1、2、3……62，患者均為女性，年齡28～82歲，平均(52±12.85)歲。

1.2 儀器與試劑常規(guī)儀器有全自動免疫組化儀、StatSpin雜交儀，Droplet Digital PCR系統(tǒng)、T100熱循環(huán)儀、PX1 PCR plate Seale及微滴控制分析軟件。試劑主要有Ultra View DAB檢測試劑盒和HER-2抗體均由羅氏診斷公司提供，F(xiàn)ISH檢測試劑盒由北京金菩嘉醫(yī)療公司提供，ddPCR試劑盒由伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)公司提供。

1.3 方法乳腺癌標本離體后立即經(jīng)10%中性福爾馬林固定6～24 h，按照病理科流程常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片4～10張。

1.3.1IHC 采用Bench Mark XT全自動免疫組化儀對HER-2進行檢測，HER-2積分為2+的不確定病例則按試劑盒說明書操作進行FISH檢測。

1.3.2ddPCR檢測 根據(jù)試劑盒說明操作將樣本提取和純化DNA，將含有樣品的20 μL DNA反應(yīng)液置于微滴發(fā)生器的樣品孔中并加入70 μL微滴生成油使其生成納升級的油包水液滴，之后取40 μL轉(zhuǎn)入96孔板中用鋁箔熱封膜密封，置于Bio-Rad C1000熱封膜儀上，進行40個常規(guī)的PCR擴增反應(yīng)循環(huán)，最后利用檢測儀自帶控制分析軟件進行熒光檢測和數(shù)據(jù)分析。

1.4 HER-2結(jié)果判讀

1.4.1IHC染色結(jié)果評估 參照我國《乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)》[6]：腫瘤細胞無著色為0；>10%癌細胞呈不完整的微弱細胞膜染色為1+；>10%癌細胞呈完整弱至中等強度的細胞膜染色或≤10%浸潤癌細胞呈強而完整的細胞膜染色為2+；>10%癌細胞呈強且完整、均勻的細胞膜著色為3+。結(jié)果判讀：0～1+為陰性，2+為可疑陽性，3+為陽性。

1.4.2FISH結(jié)果判讀 參照我國《乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)》[6]：(1)平均HER-2拷貝數(shù)/細胞<4.0判為FISH陰性。(2)HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數(shù)/細胞≥6.0判為FISH陽性。(3)HER-2/CEP17比值<2.0，4.0≤平均HER-2拷貝數(shù)/細胞<6.0，此種情況建議重新計數(shù)至少20個細胞核信號，如果結(jié)果改變，則對2次結(jié)果進行綜合判斷分析。如仍為上述情況，需要在FISH報告中備注：此類患者HER-2狀態(tài)的判斷需結(jié)合IHC結(jié)果。(4)HER-2/CEP17比值≥2.0；平均HER-2拷貝數(shù)/細胞≥4.0判為FISH陽性。若平均HER-2拷貝數(shù)/細胞<4.0則增加計數(shù)細胞，如果結(jié)果維持不變，則判為FISH陰性。目前對于平均HER-2拷貝數(shù)/細胞<4.0判為FISH陽性尚有一些爭議，建議臨床醫(yī)師重復(fù)閱片或增加一名臨床醫(yī)師閱片，結(jié)果參考IHC檢測結(jié)果，同時對患者進行溝通。

1.4.3ddPCR的結(jié)果判讀 用CNV表示HER-2拷貝數(shù)/細胞的比值，CNV≥3.2為陽性，CNV<3.2為陰性[7]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對穿刺標本和手術(shù)根治標本行ddPCR檢測與IHC聯(lián)合FISH檢測HER-2結(jié)果符合率用κ法分析其一致性；κ>0.75，P<0.01，認為兩法檢驗一致性較好。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌新輔助化療前的穿刺活檢標本結(jié)果

2.1.1穿刺活檢標本HER-2的檢測結(jié)果 62例穿刺活檢標本中，IHC檢測結(jié)果HER-2陰性有33例，可疑陽性有15例，陽性有14例(圖1)；HER-2可疑陽性標本FISH檢測有9例為陰性，6例為陽性(圖2)；即IHC聯(lián)合FISH檢測HER-2陰性有42例，陽性有20例。ddPCR檢測HER-2陰性有37例，陽性有25例(圖3)。

2.1.2穿刺活檢標本的ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測HER-2結(jié)果對比 穿刺活檢標本HER-2檢測結(jié)果：ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測均為陽性有19例，均為陰性有36例；其中6例ddPCR檢測陽性，而IHC聯(lián)合FISH檢測為陰性；1例ddPCR檢測陰性，IHC聯(lián)合FISH檢測為陽性。兩種方法檢測結(jié)果，一致性好(κ=0.758，P<0.01，表1)。

表1 穿刺活檢標本的ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測HER-2結(jié)果對比

2.2 乳腺癌新輔助化療后的手術(shù)根治標本結(jié)果

2.2.1手術(shù)根治標本HER-2的檢測結(jié)果 62例手術(shù)根治標本中，IHC檢測HER-2陰性有25例，可疑陽性有23例，陽性有14例；HER-2可疑陽性標本FISH檢測有17例為陰性，6例為陽性；即IHC聯(lián)合FISH檢測HER-2陰性有42例，陽性有20例。ddPCR檢測HER-2陰性有40例，陽性有22例(圖4)。

圖1 IHC染色HER-2結(jié)果：A.0；B.1+；C.2+；D.3+ 圖2 FISH檢測HER-2結(jié)果；紅色信號為HER-2基因，綠色信號為17號染色體；A.HER-2陰性；B.HER-2陽性；C.HER-2可疑陽性需參考IHC結(jié)果；D.HER-2簇狀陽性

圖3 ddPCR法檢測穿刺活檢標本HER-2的結(jié)果

圖4 ddPCR法檢測手術(shù)根治標本HER-2的結(jié)果

2.2.2手術(shù)根治標本的ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測HER-2結(jié)果對比 手術(shù)根治標本HER-2檢測結(jié)果：ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測均為陽性有18例，均為陰性有38例；其中4例ddPCR檢測陽性，IHC聯(lián)合FISH檢測為陰性；2例ddPCR檢測為陰性，IHC聯(lián)合FISH檢測為陽性。兩種方法檢測結(jié)果，一致性好(κ=0.784，P<0.01，表2)。

表2 手術(shù)根治標本的ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測HER-2結(jié)果對比

3 討論

HER-2和腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，是乳腺癌用于預(yù)后的重要判斷因子及靶點治療的指標，因此HER-2狀態(tài)的檢測在臨床中顯得尤為重要。尤其對篩選靶向藥物獲益患者尤為重要[8]，有利于乳腺癌患者的個體化治療。

本組實驗結(jié)果顯示，乳腺癌新輔助化療前后的標本行ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測HER-2的結(jié)果一致性好。IHC是通過檢測組織細胞內(nèi)各種抗原物質(zhì)的一種檢測方法，具有快速簡便、特異性好、敏感性高等優(yōu)點，但結(jié)果易受到內(nèi)環(huán)境溫度、抗體滴度、人為操作、病理醫(yī)師的主觀判讀等因素影響造成假陰性或假陽性。FISH雖然相對穩(wěn)定但檢測費用較高、熒光易淬滅且操作繁瑣，容易造成信號丟失導(dǎo)致結(jié)果假陰性；除此之外，有研究顯示，部分乳腺癌中17號染色體存在著HER-2基因和著絲粒的共同擴增[9]，導(dǎo)致醫(yī)師在判讀中受到一定影響。而ddPCR檢測結(jié)果準確可信且操作簡單、方便快速、結(jié)果直觀明了，大幅度降低了病理醫(yī)師的工作量。

另外本實驗亦發(fā)現(xiàn)部分標本存在結(jié)果差異性，特別是穿刺標本中有6例ddPCR檢測為陽性，IHC聯(lián)合FISH檢測為陰性；導(dǎo)致的原因主要有：(1)主要依靠臨床醫(yī)師根據(jù)B超的定位進行穿刺，具有一定的主觀局限性；(2)細胞數(shù)量少或腫瘤細胞存在異質(zhì)性，導(dǎo)致檢測樣本無法進行刮取有效的腫瘤細胞且不可避免取到緊鄰腫瘤組織的正常組織或炎癥細胞；因此產(chǎn)生其結(jié)果的差異性。由于本次實驗樣本量有限，需要更多的臨床實驗數(shù)據(jù)進行大樣本量的分析，進一步論證行ddPCR檢測HER-2結(jié)果的可靠性。

綜上所述，在乳腺癌新輔助化療中采用ddPCR技術(shù)檢測HER-2基因是可行的。盡管IHC染色快速簡便、易保存、費用低但檢測結(jié)果準確性仍需提高；FISH檢測準確性較高，但耗時長、操作繁瑣且熒光易淬滅，不易長期保存；ddPCR技術(shù)則彌補了IHC和FISH的局限性，并且快速簡便、耗時短、結(jié)果直觀，因此對IHC與FISH檢測結(jié)果不一致性時[10]，臨床及病理科可以運用ddPCR技術(shù)加以驗證此標本中HER-2基因的擴增狀態(tài)。但由于本實驗納入檢測標本有限，仍需要擴大實驗標本量，為臨床提供更有力的證據(jù)。