譚 林，陳維順，周紅兵，王 騫，艾瓊嘉，屈偉明

粒狀頭樣3(Grainyhead-like 3, GRHL3)是一種轉(zhuǎn)錄因子，為高度保守的Grainyhead家族成員之一。最近研究發(fā)現(xiàn)，GRHL3不僅在正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，如皮膚屏障形成、傷口愈合、眼瞼及神經(jīng)管閉合、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和調(diào)亡等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且參與腫瘤相關(guān)靶基因和信號(hào)通路的調(diào)控，與腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等密切相關(guān)[1]。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于GRHL3在結(jié)直腸癌中的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中GRHL3、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)蛋白E-cadherin和Ki-67的表達(dá)，探討三者表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征以及患者預(yù)后的關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌的早期診斷及評(píng)估預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年2月～2015年2月中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院存檔的100例結(jié)直腸癌根治術(shù)標(biāo)本及其中30例相應(yīng)的癌旁正常腸黏膜組織標(biāo)本(均為手術(shù)切緣，病理證實(shí)無(wú)癌浸潤(rùn))?；颊咝g(shù)前均未接受放、化療，所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。其中男性63例，女性37例，年齡27～84歲，中位年齡62歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理診斷為結(jié)直腸癌；(2)患者術(shù)前未行放、化療；(3)行結(jié)直腸癌根治術(shù)；(4)臨床及病理資料均完整，可追蹤隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)有嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能損害或其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者。所有患者對(duì)本實(shí)驗(yàn)均知情，組織標(biāo)本的獲取和使用均獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。根據(jù)國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)推薦的TNM分類系統(tǒng)(第8版)，對(duì)病理切片進(jìn)行評(píng)估。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定后，脫水、透明、浸蠟，包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑兔抗人GRHL3多克隆抗體(PA5-41616)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(MAB-0738)、鼠抗人Ki-67單克隆抗體(MAB-0672)均購(gòu)自福州邁新公司。SP試劑盒、DAB顯色劑、中性樹(shù)膠封片劑均購(gòu)自北京中杉金橋公司。二甲苯、無(wú)水乙醇、石蠟、PBS緩沖液、枸櫞酸鈉緩沖液均購(gòu)自廣州瑞斯生物公司。

1.3 免疫組化常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸高壓修復(fù)2.5 min，H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，正常山羊血清封閉，滴加一抗(GRHL3，稀釋度為1 ∶800，E-cadherin和Ki-67均為抗體原液)，孵育過(guò)夜，復(fù)溫45 min，滴加通用型二抗，置于室溫孵育25 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡鏡檢及圖像采集分析。

1.4 結(jié)果判讀由病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，以細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒為陽(yáng)性。免疫組化計(jì)分包括染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例。(1)按染色強(qiáng)度分級(jí)：無(wú)染色或與背景一致的淺黃色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞比例分級(jí)：每片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野(200×)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0～3分為陰性，4～6分為陽(yáng)性。

1.5 隨訪自患者手術(shù)起通過(guò)門診或電話定期隨訪，每半年隨訪1次，隨訪截至2020年2月，以患者死亡、失訪或最后隨訪時(shí)間為終點(diǎn)，隨訪內(nèi)容主要為患者生存情況，總生存期定義為自患者入組開(kāi)始至因任何原因死亡的時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)指標(biāo)(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析；采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率、組間生存曲線的比較采用Log-rank檢驗(yàn)；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析GRHL3、E-cadherin和Ki-67表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表達(dá)GRHL3表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，Ki-67表達(dá)主要定位于細(xì)胞核。結(jié)直腸癌組織中GRHL3和Ki-67陽(yáng)性率(64.0%和60.0%)高于癌旁正常組織(30.0%和6.7%)，結(jié)直腸癌組織中E-cadherin陽(yáng)性率(55.0%)低于癌旁正常組織(99.7%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖1、2)。

2.2 GRHL3、E-cadherin和Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系結(jié)直腸癌組織中，GRHL3和Ki-67的表達(dá)與腫瘤大小密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GRHL3和E-cadherin的表達(dá)與TNM分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，三者表達(dá)均與患者性別、年齡、分化程度無(wú)關(guān)(表2)。

2.3 結(jié)直腸癌組織中GRHL3、E-cadherin與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析100例結(jié)直腸癌組織中GRHL3與E-cadherin和Ki-67的表達(dá)，結(jié)果顯示，GRHL3與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(χ2=6.674，P=0.010，rs=-0.260)，GRHL3與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)(χ2=7.799，P=0.005，rs=0.281，表3)。

表1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表達(dá)

表2 GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌組織中GRHL3與E-cadherin和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

圖1 結(jié)直腸癌組織中GRHL3(A)、E-cadherin(B)和Ki-67(C)的表達(dá)，SP法 圖2 癌旁正常組織中GRHL3(A)、E-cadherin(B)和Ki-67(C)的表達(dá)，SP法

2.4 結(jié)直腸癌組織中GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系本組100例結(jié)直腸癌患者均獲得完整隨訪資料，通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)比較結(jié)直腸癌組織中GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系(圖3)。結(jié)果顯示，GRHL3陽(yáng)性患者5年總生存率為43.8%，GRHL3陰性患者5年總生存率為80.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Ki-67陽(yáng)性患者5年總生存率為46.7%，Ki-67陰性患者5年總生存率為72.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)。E-cadherin陽(yáng)性患者5年總生存率為72.7%，E-cadherin陰性患者5年總生存率為37.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。單因素Cox回歸分析顯示，TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、GRHL3陽(yáng)性、E-cadherin陰性及Ki-67陽(yáng)性與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān)(P<0.05)。多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、GRHL3陽(yáng)性、E-cadherin陰性是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表4)。

圖3 結(jié)直腸癌組織中GRHL3(A)、E-cadherin(B)和Ki-67(C)的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

表4 Cox回歸分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素

3 討論

GRHL3可以促進(jìn)某些細(xì)胞的增殖、變形、運(yùn)動(dòng)和遷移，由于其在這些方面的功能與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲具有高度的相似性，或兩者是一致的，導(dǎo)致近年關(guān)于GRHL3在腫瘤中的作用成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，GRHL3在乳腺癌[2]、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤[3]、食管鱗狀細(xì)胞癌[4]、胃癌[5]中高表達(dá)，且與患者臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞中GRHL3可特異性與E-cadherin近端啟動(dòng)子上的E-box相互作用抑制E-cadherin的表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)侵襲和遷移[6]。亦有研究發(fā)現(xiàn)[7]在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中GRHL3作為依賴miR-21原致癌網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)之一，擔(dān)任著保護(hù)性角色。由此可見(jiàn)，GRHL3在不同類型腫瘤中的作用不盡相同，且有可能相互矛盾。

E-cadherin是一種Ca2+依賴黏附分子，其表達(dá)的缺失是EMT最重要的標(biāo)志性變化，也是上皮腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的前提條件[8]。Ki-67是一種由兩條多肽鏈組成與有絲分裂密切相關(guān)的蛋白，存在于增殖活躍細(xì)胞的G1、S、G2和M期中，能夠比較準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，是一種應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)志物之一[9]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌中E-cadherin的陽(yáng)性率明顯低于癌旁正常組織，而Ki-67則正好相反。E-cadherin的表達(dá)水平與TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Ki-67的表達(dá)水平與腫瘤大小關(guān)系密切。Kaplan-Meier生存分析提示，E-cadherin陰性結(jié)直腸癌患者的5年生存率明顯低于陽(yáng)性患者，而Ki-67陽(yáng)性結(jié)直腸癌患者的5年生存率明顯低于陰性患者。單因素Cox回歸分析顯示，E-cadherin和Ki-67的表達(dá)均與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān)；多因素Cox回歸分析顯示，E-cadherin陰性是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)合既往研究，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)E-cadherin和Ki-67可作為評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的重要指標(biāo)。

Wang等[10]通過(guò)對(duì)進(jìn)展期結(jié)直腸癌組織和癌旁組織行微陣列分析，結(jié)果顯示GRHL3在結(jié)直腸癌中占主導(dǎo)地位，且下調(diào)GRHL3的表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲和遷移及使G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GRHL3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，提示GRHL3在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮促癌作用。GRHL3的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，證實(shí)GRHL3可能與結(jié)直腸癌的進(jìn)展密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GRHL3的表達(dá)與EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示GRHL3可能通過(guò)影響E-cadherin的表達(dá)參與EMT的發(fā)生，促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移；GRHL3的表達(dá)與增殖細(xì)胞標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)，提示GRHL3可能與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。此外，GRHL3陽(yáng)性患者5年生存率明顯低于陰性患者，同時(shí)多因素Cox回歸分析均顯示GRHL3陽(yáng)性是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。故作者推測(cè)GRHL3可能通過(guò)誘導(dǎo)EMT的發(fā)生和細(xì)胞的異常增殖，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響患者預(yù)后。

綜上所述，GRHL3在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且可能與E-cadherin和Ki-67之間存在一定相互作用，三者在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可作為評(píng)估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。進(jìn)一步探討GRHL3與E-cadherin和Ki-67之間相互作用的具體分子機(jī)制，有望為結(jié)直腸癌的生物靶向治療提供新思路。