謝樂斯，趙 盼，周 虹，王 煒，項晶晶

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌和前列腺癌[1]，近年我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均呈逐年升高趨勢。目前，錯配修復(fù)(mismatch repair, MMR)蛋白功能缺失在結(jié)直腸癌的風險評估、診斷和預(yù)后判斷中的意義已多有報道，其與85%的遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(Lynch綜合征)及15%的散發(fā)性結(jié)直腸癌相關(guān)，具有重要的臨床意義，而RAS(KRAS和NRAS)突變狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性尚存爭議。本文著重探討4種MMR蛋白(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)表達以及RAS(KRAS/NRAS)突變狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系及應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2019年11月浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院診治的186例結(jié)直腸癌患者，其中男性109例，女性77例；年齡20～88歲(64.54±11.21歲)；結(jié)腸癌96例，直腸癌90例。所有病例的病理切片均經(jīng)兩位資深病理醫(yī)師重新復(fù)診，包括復(fù)閱HE切片和診斷，統(tǒng)計腫瘤的組織學類型、發(fā)生部位、分化程度及腫瘤分期等臨床病理特征。按WHO(2019)消化系統(tǒng)腫瘤分類標準進行分類，依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版腫瘤TNM分期系統(tǒng)進行腫瘤分期。納入標準：術(shù)前未行放、化療和抗腫瘤藥物治療；臨床病理資料均完整。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，HE染色。使用DAKO公司Link48型自動免疫組化儀進行免疫組化EnVision兩步法染色。MSH2、MSH6、MLH1和PMS2抗體均購自廣州安必平公司。每批染色均設(shè)立已知陽性對照，并用PBS代替一抗作為陰性對照。MSH2、MSH6、MLH1及PMS2陽性均定位于細胞核。腫瘤周圍的正常上皮細胞、腫瘤內(nèi)浸潤的淋巴細胞、間質(zhì)細胞出現(xiàn)細胞核陽性著色可作為內(nèi)對照。判讀標準為所有腫瘤細胞核無陽性著色判定為該蛋白表達缺失，任何程度和比例細胞核著色均判定為蛋白表達存在。將4種MMR蛋白均陽性判定為錯配修復(fù)基因完整(proficient mismatch repair, pMMR)組，將4種MMR蛋白中的1種及以上表達缺失判定為錯配修復(fù)基因缺失(deficient mismatch repair, dMMR)組。

1.2.2突變擴增阻滯系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)法(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction, ARMS-PCR) 結(jié)直腸癌手術(shù)切除標本石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片10張，刮取腫瘤組織至1.5 mL滅菌EP管中備用。使用ARMS-PCR法(廈門艾德公司)檢測KRAS、NRAS基因2、3和4號外顯子突變。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。MMR蛋白表達、RAS基因突變狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的差異進行χ2檢驗、校正χ2檢驗或Fisher精確檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中4種MMR蛋白的表達免疫組化結(jié)果顯示，186例結(jié)直腸癌中MMR蛋白表達缺失dMMR組13例，MMR蛋白表達pMMR組173例，缺失率達6.99%，其中MSH2和MSH6共同缺失2例(圖1)；MLH1和PMS2共同缺失9例；MSH6單獨缺失1例；PMS2單獨缺失1例。

2.2 MMR蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系MMR蛋白表達缺失與結(jié)直腸癌患者發(fā)病年齡、腫瘤發(fā)病部位、是否伴有黏液腺癌成分、分化程度和臨床分期等有相關(guān)性(P<0.05)，表現(xiàn)為dMMR患者大多發(fā)病年齡低(<50歲)、腫瘤部位多為右半結(jié)腸、伴有黏液腺癌、腫瘤低分化、腫瘤分期早(大多為Ⅰ+Ⅱ期)，與患者性別無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

圖1 A.結(jié)腸癌細胞核中MSH2呈陰性，EnVision兩步法；B.結(jié)腸癌細胞核中MSH6呈陰性，EnVision兩步法；C.結(jié)腸癌細胞核中MLH1呈陽性，EnVision兩步法；D.結(jié)腸癌細胞核中PMS2呈陽性，EnVision兩步法

2.3 RAS基因突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系186例結(jié)直腸癌組織中RAS基因突變者97例(52.15%)，其中KRAS突變88例(47.31%)：2號外顯子突變74例(84.09%)，3號和4號外顯子突變各7例(7.95%)；NRAS突變9例(4.84%)：2號外顯子突變6例(66.66%)，3號外顯子突變3例(33.33%)，4號外顯子突變未檢出。χ2檢驗顯示，186例結(jié)直腸癌患者RAS基因突變與患者性別、年齡、腫瘤部位、是否伴黏液腺癌成分、腫瘤分化及腫瘤分期等均無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 MMR蛋白表達及RAS基因突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.4 不同MMR-RAS基因狀態(tài)及與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系本組13例dMMR病例檢出dMMR-RAS突變型4例(30.8%)，其中KRAS突變3例(2例為2號外顯子突變，1例為4號外顯子突變)，NRAS突變1例(2號外顯子突變)。4例中3例為女性，3例年齡<50歲，年齡最小者20歲，3例位于右半結(jié)腸，4例均無黏液腺癌成分且均有低分化成分，3例腫瘤分期為Ⅱ期，1例為Ⅳ期；dMMR-RAS野生型9例(69.2%)，其中5例為女性，僅1例年齡<50歲，8例位于右半結(jié)腸，8例伴有不同程度黏液腺癌成分，5例有低分化成分，7例腫瘤分期為Ⅱ期，2例為Ⅳ期。dMMR-RAS突變組與dMMR-RAS野生組相比，兩者在是否有黏液腺癌上差異有顯著性(P<0.05)，在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤部位、腫瘤分化及腫瘤分期方面差異均無顯著性(P>0.05，表2)。

本組173例pMMR病例中檢出RAS突變型93例(53.8%)，其中KRAS突變85例(2號外顯子突變72例，3號外顯子突變7例，4號外顯子突變6例)，NRAS突變8例(2號外顯子突變5例，3號外顯子突變3例)。pMMR-RAS突變組與pMMR-RAS野生組在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤部位、是否伴黏液腺癌、腫瘤分化及腫瘤分期方面差異均無顯著性(P>0.05，表2)。

3 討論

隨著分子生物學的發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)MMR蛋白表達和RAS突變等分子標志物與結(jié)直腸癌臨床病理學特征、生物學行為、治療及預(yù)后等密切相關(guān)。NCCN指南推薦對于所有新診斷為結(jié)直腸癌的患者均進行MMR或微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)的常規(guī)檢測，這不僅可為新發(fā)結(jié)直腸癌患者篩查Lynch綜合征提供參考，還可提示Ⅱ期高微衛(wèi)星不穩(wěn)定(high microsatellite instability，MSI-H)結(jié)直腸癌患者預(yù)后良好，不能從5-FU單藥輔助化療中獲益，但能夠從抗PD-1免疫治療中獲益[2-3]。研究表明MMR狀態(tài)是評估結(jié)直腸癌的重要分子標志物，dMMR結(jié)直腸癌的臨床病理特征包括好發(fā)于年輕患者、右半結(jié)腸、常見于低分化及早期腫瘤，dMMR結(jié)直腸癌患者具有良好的預(yù)后和治療反應(yīng)。Guo等[4]對結(jié)直腸癌臨床Ⅰ～Ⅳ期1 834個樣本進行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)dMMR與臨床Ⅲ期結(jié)直腸癌患者較長的生存期獨立相關(guān)。本組實驗檢測186例結(jié)直腸癌組織中的MMR蛋白表達，發(fā)現(xiàn)MMR蛋白總?cè)笔蕿?.99%，接近于Guo等報道的6.7%。結(jié)合患者的臨床病理資料進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)dMMR患者好發(fā)于50歲以下年輕患者、腫瘤部位多為右半結(jié)腸、伴有黏液腺癌和腫瘤低分化、腫瘤分期早(Ⅰ+Ⅱ期)的患者，與患者性別無關(guān)，這與上述結(jié)果基本一致。

表2 dMMR與pMMR中RAS基因突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

目前RAS突變已成為潛在的腫瘤標志物以及精準治療的靶點，具有重要的臨床意義[5-7]。RAS突變可以預(yù)測抗EGFR治療耐藥，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌抗EGFR治療前篩查的必要項目。NCCN指南也建議結(jié)直腸癌患者在接受西妥昔單抗和帕尼單抗治療前需進行擴展的RAS基因(包括KRAS和NRAS)檢測，以盡可能檢測出潛在的基因突變，保證靶向藥物的合理應(yīng)用。國內(nèi)外研究結(jié)果顯示[8]，27%～56%結(jié)直腸癌患者伴KRAS基因突變，1%～7%伴NRAS基因突變。本組實驗中RAS基因突變率為52.15%，其中KRAS突變率為47.31%，主要發(fā)生于2號外顯子，NRAS突變率為4.84%，與上述報道數(shù)據(jù)基本一致。關(guān)于RAS突變與臨床病理特征的關(guān)系目前尚不清楚，有研究指出結(jié)直腸癌中RAS突變與患者性別、組織學類型、分化程度、微衛(wèi)星穩(wěn)定表型等臨床病理特征有關(guān)[4,9]；也有文獻[10]報道，RAS突變與患者性別、組織學類型、分化程度、TNM分期等均無關(guān)，但與患者年齡有關(guān)。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)RAS不同突變亞型的臨床病理特征存在差異，KRAS突變與伴有黏液腺癌和腫瘤分期早顯著相關(guān)，而NRAS突變則與臨床病理特征均無相關(guān)性，兩種突變可能是彼此獨立的影響著結(jié)直腸癌的進程；而對KRAS野生型患者進行NRAS突變檢測，將有助解釋抗EGFR單克隆抗體治療的抗藥性。文獻報道1 735例結(jié)直腸癌患者的RAS狀態(tài)與臨床病理特征進行分析，發(fā)現(xiàn)KRAS突變更多見于男性、分化較好的普通型腺癌以及微衛(wèi)星穩(wěn)定表型，而NRAS突變與臨床病理特征無相關(guān)性[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)RAS突變與患者年齡、性別、腫瘤部位、組織學類型、分化程度、TNM分期等均無相關(guān)性，不同研究結(jié)果的差異可能與樣本量大小、種族、地域、不同檢測方法及判讀標準等因素有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)dMMR-RAS突變腫瘤常見于右半結(jié)腸，且多表現(xiàn)為黏液腺癌。本組實驗分析dMMR患者的RAS狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)dMMR病例中RAS突變率(30.8%)低于pMMR病例中RAS突變率(53.78%)，dMMR病例中RAS基因突變狀態(tài)與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、TNM分期等均無相關(guān)性，但與是否伴有黏液腺癌成分有顯著相關(guān)性，dMMR-RAS突變型病例均不伴有黏液腺癌成分，而dMMR-RAS野生型病例多伴黏液腺癌成分，這一結(jié)果與上述研究有較大差異，可能由于本組dMMR病例數(shù)較少，存在統(tǒng)計偏倚，后續(xù)將進一步進行大樣本驗證和分析。Zhang等[11]報道KRAS突變在dMMR腫瘤中常見，dMMR腫瘤中KRAS突變與臨床病理特征未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，且在臨床Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者中也未發(fā)現(xiàn)KRAS突變的預(yù)后因子。有研究發(fā)現(xiàn)dMMR-KRAS突變患者的5年腫瘤特異性生存率為76%，低于dMMR-KRAS野生組的93%，提示dMMR-KRAS突變患者預(yù)后更差。聯(lián)合檢測MMR和RAS狀態(tài)或可有助于結(jié)直腸癌的分子分型、預(yù)后判斷，并提供更明確的后續(xù)用藥指導(dǎo)。

綜上所述，本組實驗發(fā)現(xiàn)MMR蛋白表達和RAS基因突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征有關(guān)，檢測結(jié)直腸癌組織中MMR蛋白表達和RAS基因突變狀態(tài)，有助于制定術(shù)后診療方案和預(yù)后判斷，并可根據(jù)檢測情況給予更精準的靶向治療，提高個體化診療水平。