銀 萍，徐福霞，王志強(qiáng)，楊 珺

子宮頸癌是影響婦女健康的最常見腫瘤，2018年WHO統(tǒng)計(jì)報(bào)道，全球每年新增約50萬例子宮頸癌患者，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。子宮頸病變尤其是子宮頸癌早期即出現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，除與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染有關(guān)外，近年研究表明子宮頸癌的發(fā)生與子宮頸細(xì)胞染色體和miRNA異常改變有關(guān)[1]。腫瘤在發(fā)生過程中患者機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，且多處于高水平氧化應(yīng)激狀態(tài)[2]。目前有很多針對(duì)腫瘤患者機(jī)體氧化應(yīng)激的代謝反應(yīng)，產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤反應(yīng)的治療報(bào)道[3]。研究表明[4]，子宮頸病變患者機(jī)體抗氧化系統(tǒng)平衡障礙，患者機(jī)體存在過氧化現(xiàn)象。氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄活性因子核因子E2相關(guān)因子(NF-E2-related factor 2, Nrf2)可結(jié)合Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-related protein 1, Keap1)，恢復(fù)機(jī)體氧化失衡的狀態(tài)[5-6]。研究表明Nrf2/Keap1通路是在機(jī)體抗氧化中起保護(hù)性作用的關(guān)鍵通路。在關(guān)于子宮頸病變的機(jī)制分析中，檢測(cè)兩者表達(dá)與子宮頸病變關(guān)系的報(bào)道較少。本文采用免疫組化SP法檢測(cè)子宮頸上皮內(nèi)病變和子宮頸癌組織中Nrf2、Keap1蛋白的表達(dá)，著重探討兩者在子宮頸病變中的意義及與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年9月～2017年8月安徽省第二人民醫(yī)院存檔的67例子宮頸癌手術(shù)標(biāo)本，患者均未合并其他心、肝、肺、腦等重要臟器的嚴(yán)重病變，患者術(shù)前均未行放、化療，術(shù)后病理診斷均確診為子宮頸癌，根據(jù)2016年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)子宮頸癌分期，將67例子宮頸癌分為：Ⅰa期21例，Ⅰb期24例，Ⅱa期22例。病理類型：子宮頸鱗狀細(xì)胞癌51例，其中高分化12例，中分化20例，低分化19例；腺癌16例，其中高分化3例，中分化6例，低分化7例。另收集同期20例行子宮頸錐切的子宮頸上皮內(nèi)病變標(biāo)本?；颊吣挲g31～72歲，中位年齡48歲。術(shù)后子宮頸組織常規(guī)固定，石蠟包埋。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽省第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 主要試劑一抗：羊抗人Nrf2多克隆抗體(濃縮型，ab137550)、兔抗人Keap1多克隆抗體(濃縮型，ab226997)，均購于美國Abcam公司；抗原修復(fù)液、山羊血清、通用型二抗、DAB顯色劑、蘇木精、PBS緩沖液、中性樹脂，均購自福州邁新公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用SP法。將子宮頸組織置于10%中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡，微波抗原修復(fù)，血清抗原封閉，滴加一抗(羊抗人Nrf2多克隆抗體，稀釋比1 ∶300；兔抗人Keap1多克隆抗體，稀釋比1 ∶200)，4 ℃冰箱中孵育過夜；次日，PBS清洗10 min×3次，每片滴加即用型二抗50 μL，37 ℃溫箱中孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固，鏡檢。

1.4 結(jié)果判斷Nrf2、Keap1蛋白免疫組化染色結(jié)果由3名病理醫(yī)師獨(dú)立判定，參照文獻(xiàn)進(jìn)行定性和計(jì)分[6]，陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色；每張切片鏡下(40×)隨機(jī)觀察5個(gè)視野，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：<10%為0分；10%～25%為1分；26%～50%為2分；50%～75%為3分；>75%為4分。按照陽性細(xì)胞染色程度計(jì)分：無著色為0分；淺黃色為1分；黃色為2分；棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：>4分為高表達(dá)；1～4分為低表達(dá)；0分為陰性。

1.5 隨訪67例子宮頸癌患者隨訪包括門診復(fù)查、電話和微信等，患者生存期以手術(shù)日開始計(jì)算，截至2020年8月，隨訪4～72個(gè)月，中位時(shí)間為40個(gè)月，其中有5例患者失訪，8例患者死亡，1例Ⅰa期、3例Ⅰb期、4例Ⅱa期患者。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)，子宮頸癌組織中蛋白表達(dá)與患者生存期的關(guān)系采取Kaplan-Meier分析，患者生存率曲線采取Log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同子宮頸病變組織中Nrf2、Keap1蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，Nrf2蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淺～棕黃色(圖1)。隨著子宮頸癌組織病理分期的升高，Nrf2表達(dá)逐漸升高(表1)。Ⅰb、Ⅱa期子宮頸癌組織中Nrf2的表達(dá)與子宮頸上皮內(nèi)病變組織相比，差異有顯著性(P<0.05)。Keap1蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，呈淺～棕黃色(圖2)。隨著子宮頸癌組織病理分期的升高，Keap1蛋白表達(dá)逐漸降低，與上皮內(nèi)病變組織相比，差異有顯著性(P<0.05，表1)。

圖1 不同子宮頸病變組織中Nrf2蛋白均呈陽性，SP法：A.子宮頸上皮內(nèi)病變；B.子宮頸癌Ⅰa期；C.子宮頸癌Ⅰb期；D.子宮頸癌Ⅱa期 圖2 不同子宮頸病變組織中Keap1蛋白均呈陽性，SP法：A.子宮頸上皮內(nèi)病變；B.子宮頸癌Ⅰa期；C.子宮頸癌Ⅰb期；D.子宮頸癌Ⅱa期

表1 不同子宮頸病變組織中Nrf2與Keap1蛋白的表達(dá)[n(%)]

2.2 Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，子宮頸癌組織中Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)與患者年齡、腫瘤生長方式(外生、內(nèi)生、糜爛、潰瘍型)、腫瘤直徑，以及FIGO臨床分期無相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤浸潤程度(深肌層浸潤明顯高于無深肌層浸潤)、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P<0.05，表2)。

表2 Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)與子宮頸病變患者預(yù)后的相關(guān)性本組67例子宮頸癌患者有5例失訪，死亡8例(其中Ⅰa期1例、Ⅰb期3例、Ⅱa期4例)，隨訪4～72個(gè)月。Nrf2蛋白陰性、低表達(dá)、高表達(dá)的患者病死率分別為0(0/18)、8.0%(2/25)、25.0%(6/24)。Keap1蛋白陰性、低表達(dá)、高表達(dá)的患者病死率分別為16.7(5/30)、7.1%(2/28)、11.1%(1/9)。Log-rank檢驗(yàn)表明，Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)水平不同，患者生存率差異有顯著性(χ2=7.623、7.988，P<0.05，圖3)。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線顯示子宮頸病變組織中Nrf2(A)和Keap1(B)蛋白表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

3 討論

子宮頸癌的病死率僅次于乳腺癌，全球每年約50萬新發(fā)病例，我國每年約有14萬例，其嚴(yán)重危及女性的生命安全[1]。目前，子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，探明其發(fā)病機(jī)制可為治療提供新的診斷和治療依據(jù)。子宮頸癌患者早期癥狀不典型，晚期患者出現(xiàn)全身衰竭，生活質(zhì)量急劇下降，故早期診療并預(yù)防癌變顯得極為重要。研究表明，HPV感染是導(dǎo)致患者子宮頸癌的重要因素之一，HPV的E2基因可以整合到宿主DNA中，破壞子宮頸上皮細(xì)胞基因的完整性，使其癌變風(fēng)險(xiǎn)提高[7]。HPV致癌蛋白E2、E6可以和氧化應(yīng)激相互協(xié)同作用，引起DNA氧化，損傷子宮頸上皮細(xì)胞，并使得癌變后的子宮頸上皮細(xì)胞凋亡受抑制，因而貫穿著子宮頸癌的發(fā)病過程。HPV感染是導(dǎo)致子宮頸癌的重要致病因素，子宮頸上皮持續(xù)暴露、HPV感染與氧化應(yīng)激協(xié)同作用下，子宮頸上皮細(xì)胞與病毒基因組重新整合，升高子宮頸上皮細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性，引起子宮頸上皮致瘤風(fēng)險(xiǎn)，加速病毒DNA整合和腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)可以降低腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)[9]，子宮頸癌患者機(jī)體活性氧簇濃度增加，引起DNA氧化損傷，加速與病毒基因組整合。氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致DNA、RNA和蛋白質(zhì)損傷，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化基因的累積，氧化應(yīng)激與高危HPV慢性炎癥有協(xié)同作用，機(jī)體為對(duì)抗氧化應(yīng)激，會(huì)產(chǎn)生保護(hù)性抗氧化防御，以維持氧化還原平衡。HPV感染導(dǎo)致子宮頸癌，其致癌性存在氧化應(yīng)激的協(xié)同作用，本文探討氧化應(yīng)激與子宮頸病變發(fā)生和預(yù)后的關(guān)系。

信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)、癌基因激活等存在于子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中[10-11]。Nrf2是反映機(jī)體中氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)抗氧化酶，Keap1是負(fù)調(diào)控Nrf2因子，在機(jī)體內(nèi)兩者可以結(jié)合，從而泛素化降解Nrf2蛋白，使正常機(jī)體中Nrf2處于低水平狀態(tài)[12]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在子宮頸上皮內(nèi)病變組織中Nrf2蛋白陽性率低于子宮頸癌組織，而Keap1蛋白陽性率在子宮頸上皮內(nèi)病變組織中較高，隨著上皮內(nèi)病變向低分化子宮頸癌病變的發(fā)展，在氧化應(yīng)激刺激后，會(huì)破壞細(xì)胞中Keap1蛋白的半胱氨酸巰基，降低Nrf2與Keap1結(jié)合，加劇兩者的解離，使靶基因的轉(zhuǎn)錄加快，抗氧化作用更為明顯。Nrf2/Keap1信號(hào)通路可能參與HPV的致癌性，并協(xié)同調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激[13]。通過降低機(jī)體活性氧含量，減輕對(duì)子宮頸上皮DNA氧化受損，防止子宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡變。本實(shí)驗(yàn)分析Nrf2和Keap1蛋白與子宮頸癌臨床病理的關(guān)系，結(jié)果顯示，Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)與子宮頸癌患者年齡、子宮頸癌類型和大小、FIGO臨床分期等無相關(guān)性，但與組織學(xué)分級(jí)、深肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有相關(guān)性，Nrf2/Keap1在子宮頸病變中的不同表達(dá)，反映該信號(hào)通路在子宮頸上皮內(nèi)病變至子宮頸癌發(fā)展進(jìn)程中起一定作用。同時(shí)，雖然與子宮頸上皮內(nèi)病變相比，子宮頸癌組織中Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)差異有顯著性，但本組不同臨床分期之間蛋白表達(dá)差異無顯著性，有待進(jìn)一步收集病例，得出更加明確結(jié)論。同時(shí)，Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)與子宮頸病變患者預(yù)后有一定的相關(guān)性，Nrf2蛋白表達(dá)升高、Keap1蛋白表達(dá)降低，往往提示患者病死率高，兩者聯(lián)合檢查可能在子宮頸癌患者預(yù)后中有一定的價(jià)值。

綜上所述，氧化應(yīng)激Nrf2和Keap1蛋白在子宮頸上皮內(nèi)病變和子宮頸癌Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa期表達(dá)不同，隨著子宮頸病變病理分級(jí)升高，Nrf2蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，Keap1蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，且Keap1蛋白表達(dá)與腫瘤肌層浸潤、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有相關(guān)性。兩種蛋白的表達(dá)，可能與子宮頸癌病變的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后相關(guān)。