陶玉梅，任曉燕，袁明明，陳婷婷，金曉霞，衛(wèi)穎澤，楊書云，何 松

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，具有高度異質(zhì)性。根據(jù)2019 St. Gallen國際共識[1]，采用免疫組化替代基因表達譜分析(gene expression profiling, GEP)可將浸潤性乳腺癌(invasive breast carcinoma, IBC)分為四個亞型：Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型以及三陰型?；讟尤橄侔?basal-like breast carcinoma, BLBC)是三陰型乳腺癌(triple negative breast carcinoma, TNBC)的一種亞型[2]。本文通過對718例IBC進行回顧性分析，以期為IBC，特別是TNBC的臨床治療提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2017年12月南通市腫瘤醫(yī)院病理科存檔及會診的IBC標本718例，患者年齡22～89歲，中位年齡53歲，均為女性。由兩名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師采用雙盲法重新閱片，組織學分型標準參照WHO(2019)乳腺腫瘤分類，組織學分級參照Elston&Ellis法，分子分型采用免疫組化替代分型，標準參照2019 St. Gallen乳腺癌會議國際共識[1]：將ER陽性≥1%，PR陽性>20%，Ki-67增殖指數(shù)<30%且HER-2陰性定義為Luminal A型；Luminal B型分兩種情況，一種是ER陽性，Ki-67增殖指數(shù)≥30%或PR陽性<20%，HER-2陰性，另一種是ER陽性，PR陽性，任何水平的Ki-67增殖指數(shù)，HER-2陽性；將ER陰性，PR陰性，HER-2陽性定義為HER-2過表達型；將ER、PR及HER-2三者均陰性定義為三陰型。所有患者術(shù)前均未行放療、化療等任何治療。

1.2 試劑一抗ER(EP1/兔單克隆抗體，稀釋度1 ∶400)，PR(EP2/兔單克隆抗體，稀釋度1 ∶1 200)，EGFR(EP22/兔單克隆抗體，稀釋度1 ∶200)，均購自北京中杉金橋公司，HER-2(A0485/兔多克隆抗體，稀釋度1 ∶800)，CK5/6(D5/16 B4/鼠單克隆抗體，稀釋度1 ∶600)，Ki-67(MIB1/鼠單克隆抗體，稀釋度1 ∶600)及EnVision試劑盒，均購自DAKO公司。

1.3 方法標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，免疫組化染色采用EnVision兩步法，Ki-67使用檸檬酸鹽修復液進行抗原修復，其余指標均采用EDTA修復。所有病例均設(shè)陽性和陰性對照。ER、PR以子宮內(nèi)膜作為陽性對照，HER-2以已知陽性乳腺癌作為陽性對照，Ki-67、EGFR以闌尾作為陽性對照，CK5/6以正常皮膚作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定在IBC區(qū)域腫瘤細胞出現(xiàn)定位明確的棕黃色或棕褐色顆粒判定為特異性陽性反應。ER、PR、Ki-67陽性定位于細胞核，HER-2和EGFR陽性定位于細胞膜，CK5/6陽性定位于細胞質(zhì)。ER、PR及HER-2的免疫組化染色評分參照中國乳腺癌專家組推薦的乳腺癌雌、孕激素受體免疫組織化學檢測指南[3]及乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)[4]，ER、PR以1%作為陽性臨界值，HER-2以>10%腫瘤細胞呈現(xiàn)完整的細胞膜環(huán)周強著色定義為陽性(3+)；>10%腫瘤細胞呈現(xiàn)完整的細胞膜弱至中等程度著色，或<10%腫瘤細胞呈現(xiàn)完整的細胞膜強著色定義為不確定(2+)；>10%腫瘤細胞呈現(xiàn)微弱或幾乎察覺不到的不完整的細胞膜著色定義陰性(1+)；無著色或<10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細胞膜著色定義為0，0和1+均定義為陰性。HER-2免疫組化評分為2+的病例均再行熒光原位雜交檢測有無HER-2基因擴增，分別納入HER-2陽性組和陰性組。CK5/6和EGFR免疫組化染色評分采用三點評分系統(tǒng)[5]，浸潤癌細胞無著色為陰性，<20%浸潤癌細胞出現(xiàn)弱到中等或強著色為弱陽性，≥20%浸潤癌細胞出現(xiàn)強著色為強陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。等級資料多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，多項無序分類資料采用χ2檢驗，兩變量相關(guān)行Pearson等級相關(guān)檢驗，均行雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學分類及分級情況本組718例IBC組織學類型以非特殊類型浸潤性乳腺癌(invasive breast carcinoma of no specific type, IBC-NST)最多，合計659例(91.8%)，其中經(jīng)典型IBC-NST 631例，變異形態(tài)IBC-NST 28例(伴髓樣特征的IBC-NST 26例、伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的IBC-NST 2例)。特殊類型IBC 59例，占8.2%，其中浸潤性小葉癌26例，黏液腺癌13例，浸潤性微乳頭狀癌9例，大汗腺癌8例，化生性癌3例。718例IBC中，TNBC 149例，非三陰型乳腺癌(non-triple negative breast carcinoma, N-TNBC)569例。149例TNBC中，IBC-NST最多，合計132例，占88.6%，其次是大汗腺癌，合計7例，占4.7%。569例N-TNBC中，IBC-NST 527例，占92.6%(表1)。

表1 718例IBC病理組織學分類及分級[n (%)]

2.2 各分子分型IBC中CK5/6、EGFR的表達718例IBC中Luminal A型191例(26.6%)；Luminal B型264例(36.8%)，其中Luminal B型HER-2陰性型191例(26.6%)，Luminal B型HER-2陽性型73例(10.2%)；HER-2過表達型114例(15.9%)；TNBC 149例(20.8%)。718例IBC中CK5/6陽性率為14.2%(102/718)，其中弱陽性49例，強陽性53例；EGFR陽性率為29.0%(208/718)，其中弱陽性93例，強陽性115例，CK5/6和EGFR共陽性率為11.1%(80/718)。149例TNBC中，CK5/6陽性率為45.6%(68/149)，其中弱陽性28例，強陽性40例；EGFR陽性率為65.8%(98/149)，其中弱陽性33例，強陽性65例；CK5/6和EGFR共陽性率為37.6%(56/149)。569例N-TNBC中，CK5/6陽性率為6.0%(34/569)，其中弱陽性21例，強陽性13例；EGFR陽性率為19.3%(110/569)，其中弱陽性60例，強陽性50例；CK5/6和EGFR共陽性率為4.2%(24/569)。CK5/6、EGFR在TNBC中的陽性率及共陽性率顯著高于N-TNBC中的陽性率(P<0.01，表2)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CK5/6、EGFR在TNBC中的共陽性率顯著高于Luminal A型、Luminal B型HER-2陰性型、Luminal B型HER-2陽性型以及HER-2過表達型中的陽性率(P<0.05，表2)。

表2 不同分子分型IBC中CK5/6和EGFR的表達[n(%)]

2.3 CK5/6、EGFR的表達與IBC臨床病理特征的關(guān)系CK5/6在IBC-NST中的陽性率為14.6%(96/659)，EGFR在IBC-NST中的陽性率為29.7%(196/659)，兩者共陽性率為11.5%(76/659)；CK5/6在特殊類型IBC中的陽性率為10.2%(6/59)，EGFR在特殊類型IBC中的陽性率為20.3%(12/59)，兩者共陽性率為6.8%(4/59)。在IBC中，CK5/6與EGFR的表達相關(guān)(rs=0.490，P<0.01)，且在TNBC中也存在相關(guān)性(rs=0.400，P<0.01)。CK5/6、EGFR在年齡≤53歲組和>53歲組之間以及在IBC-NST和特殊類型IBC中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，但CK5/6、EGFR表達與IBC-NST的組織學分級相關(guān)，其在組織學分級Ⅲ級腫瘤中的表達率顯著高于Ⅰ級以及Ⅱ級腫瘤中的表達率(P<0.01，表3)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CK5/6在IBC中的表達和ER、PR、Ki-67的表達有相關(guān)性(P<0.01)，但與HER-2的表達無關(guān)(P>0.05)；EGFR的表達與ER、PR、HER-2、Ki-67表達均有相關(guān)性(P<0.01，表3)。

2.4 CK5/6、EGFR表達與TNBC臨床病理特征的關(guān)系718例IBC中，TNBC 149例，占20.8%，患者年齡29～85歲，中位年齡54歲。CK5/6在不同年齡組間表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.024)，EGFR在年齡組間表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.902)。CK5/6和EGFR表達與Ki-67高表達相關(guān)(P均<0.05，表4)。對TNBC中132例IBC-NST進一步分析發(fā)現(xiàn)：CK5/6與TNBC組織學分級相關(guān)，其在組織學分級Ⅲ級腫瘤中的陽性率高于Ⅰ級以及Ⅱ級腫瘤中的陽性率(P=0.013)，而EGFR與組織學分級無關(guān)(P=0.077)。149例TNBC中，110例鏡下可見腫瘤呈推擠性生長，缺乏腺管結(jié)構(gòu)，有中央壞死(圖1)，腫瘤細胞異型性明顯，核分裂象多見，間質(zhì)可見輕到中等的淋巴細胞反應(圖2)，表達CK5/6(圖3)和(或)EGFR標記(圖4)，根據(jù)形態(tài)學特征及免疫表型，將該110例歸為BLBC，占IBC的15.3%(110/718)，占TNBC 73.8%(110/149)。BLBC中CK5/6的陽性率為61.8%(68/110)，EGFR的陽性率為89.1%(98/110)，兩者共陽性率為50.9%(56/110)。

表3 CK5/6、EGFR表達與IBC臨床病理特征的關(guān)系

表4 CK5/6、EGFR表達與TNBC臨床病理特征的關(guān)系

圖1 BLBC呈推擠性生長，缺乏導管結(jié)構(gòu)，有中央壞死 圖2 BLBC細胞異形性明顯，核分裂象多見，間質(zhì)輕～中度淋巴細胞反應 圖3 BLBC中CK5/6呈陽性，EnVision兩步法 圖4 BLBC中EGFR呈陽性，EnVision兩步法

3 討論

不同分子分型IBC治療方案和效果均不相同，目前Luminal A型多采用內(nèi)分泌治療，Luminal B型HER-2陰性型多采用內(nèi)分泌治療+化療，Luminal B型HER-2陽性型可采用內(nèi)分泌治療+化療及HER-2治療，HER-2過表達型采用化療+HER-2治療療效較好，TNBC對激素療法和HER-2靶向療法均無效，化療是早期和進展期TNBC患者系統(tǒng)性治療推薦方案。根據(jù)共識，本實驗中Luminal A型191例(26.6%)；Luminal B型HER-2陰性型191例(26.6%)，Luminal B型HER-2陽性型73例(10.2%)；HER-2過表達型114例(15.9%)；TNBC 149例(20.8%)。實驗結(jié)果與Ishitha等[6]的研究結(jié)果基本一致。

有研究報道，CK5/6和EGFR陽性IBC惡性程度高，臨床上更具侵襲性，預后更差[7]。本組718例IBC中，CK5/6和EGFR在年齡組間以及在IBC-NST和其他特殊類型IBC之間的表達差異無統(tǒng)計學意義，但是在TNBC和其他分子分型之間以及在IBC-NST的組織學分級之間的表達差異有顯著性。TNBC中CK5/6、EGFR的陽性率及兩者共陽性率均高于N-TNBC，且在TNBC中CK5/6、EGFR表達均與Ki-67高表達有相關(guān)性。以上結(jié)果顯示，CK5/6、EGFR在IBC中的表達和腫瘤的惡性程度有關(guān)。ER、PR、HER-2、Ki-67是IBC重要的治療靶點和預后標志物。本組實驗結(jié)果顯示，CK5/6與ER、PR、Ki-67的表達均有相關(guān)性，但與HER-2表達無相關(guān)性，而EGFR與ER、PR、HER-2、Ki-67表達均有相關(guān)性，提示EGFR也可以作為IBC的預后標志物。

TNBC的診斷依賴于免疫組化、熒光原位雜交對ER、PR以及HER-2蛋白表達水平的準確評價[8]。本組實驗顯示，149例TNBC中CK5/6在年齡組間表達有差異，且在組織學分級之間表達有差異，而EGFR在年齡及組織學分級之間表達差異無統(tǒng)計學意義，提示CK5/6可以作為TNBC的預后標志物。本組149例TNBC中CK5/6和EGFR的陽性率分別為45.6%(68/149)和65.8%(98/149)，兩者共陽性率為37.6%(56/149)，陽性率高于N-TNBC組。TNBC中，組織學分級Ⅲ級89例(59.7%)，在569例N-TNBC中，組織學分級Ⅲ級170例(29.9%)，提示TNBC比N-TNBC惡性度更高，預后更差。大多數(shù)TNBC均是高級別，臨床預后較差，但是也有罕見臨床相關(guān)的低級別TNBC，預后較好。高級別TNBC包括組織學分級Ⅲ級的IBC-NST，梭形細胞化生性癌、伴軟骨分化的化生性癌、大汗腺癌及鱗狀細胞化生性癌等；低級別TNBC包括分泌性癌、腺樣囊性癌、低級別腺鱗癌、低級別纖維瘤病樣化生性癌及多形態(tài)癌等[9]。本組149例TNBC中，組織學Ⅲ級的IBC-NST浸潤性癌占89例(59.7%)，特殊類型中化生性癌3例(2.0%)，大汗腺癌7例(4.7%)，這些類型IBC級別高，預后較差；黏液癌3例(2.0%)，2例(1.3%)為單純型，1例(0.7%)為混合型，單純型黏液癌很少發(fā)生局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，預后相對較好，混合型黏液癌預后較差。Lehmann等[10]通過GEP研究了587例TNBC，聚類分析顯示出6種獨立亞型，包括兩種基底樣型(BL1型和BL2型)、免疫調(diào)節(jié)(immunomodulatory, IM)型、間葉(mesenchymal, M)型、間葉干細胞(mesenchymal stem-like, MSL)型及腔樣雄激素受體(luminal androgen receptor, LAR)型。BL1型和BL2型具有更高的細胞周期和DNA損傷反應基因表達，并且代表性細胞系對順鉑更具反應性。M型和MSL型富含上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，生長因子途徑和細胞模型對NVP-BEZ235(PI3K/mTOR抑制劑)和達沙替尼(abl/src抑制劑)有反應。LAR型細胞系對比卡魯胺(AR拮抗劑)具有獨特的敏感性。TNBC在分子水平上的顯著異質(zhì)性，導致其一直缺乏明確有效的靶向治療[11]。近年來，Roci等[12]研究發(fā)現(xiàn)精氨酸酶2(Arginine 2, ARG2)高表達于特定乳腺癌類型，如ER陰性的BLBC，并與患者不良預后密切相關(guān)，而ER陰性的BLBC與TNBC高度交叉重疊。該研究結(jié)果表明，ARG2抑制劑有望成為TNBC的代謝靶向療法。

BLBC是Perou等[13]于2000年首次應用GEP，根據(jù)不同的基因表達類型提出的具有基底細胞基因表型的一類特殊腫瘤，是傳統(tǒng)TNBC的一種基底亞型。而如何基于免疫組化標記定義BLBC尚未達成共識[14]。目前多數(shù)學者傾向Nielsen等[2]基于轉(zhuǎn)錄和免疫組化對比提出的BLBC定義，即ER、PR和HER-2均陰性，CK5/6和(或)EGFR陽性。本組基于此免疫組化標準和BLBC組織學特點，在149例TNBC中，篩選出BLBC 110例，占IBC 15.2%(110/718)，占TNBC 73.8%(110/149)，與文獻報道基本一致[15-16]。BLBC中CK5/6的陽性率為61.8%(68/110)，EGFR的陽性率為89.1%(98/110)，兩者共陽性率為50.9%(56/110)，高于TNBC(37.6%)。本組實驗結(jié)果顯示，在TNBC中，CK5/6和EGFR均與Ki-67高表達有相關(guān)性(P<0.05)，這也說明了BLBC具有更高的惡性度和更具侵襲性的特征。BLBC組織學類型多樣，有研究表明[17]，BLBC主要為IBC-NST、化生性癌和腺樣囊性癌等。本實驗中BLBC的組織學類型主要為IBC-NST、大汗腺癌及化生性癌。BLBC缺乏特異的治療靶點，患者術(shù)后生存率低。官兵等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在BLBC中miRNA-205通過負性靶向調(diào)控原癌基因KLF12和抑制侵襲，具有抑癌基因的功能。Jiang等[19]對465例中國人群原發(fā)TNBC進行分類，發(fā)現(xiàn)基底樣免疫抑制型存在高頻BRCA1/2胚系突變及基因組不穩(wěn)定性，預后差。按照同源重組修復缺陷評分(homologous recombination repair defect score, HRD score)進一步分類，發(fā)現(xiàn)高HRD亞組對鉑類或PARP抑制劑敏感。這或許可為BLBC的精準治療提供新的研究依據(jù)。