劉媛媛，劉娜，付建軍，李紅兵，黃輝紅，寧博，唐先梅，何英利，趙英仁，劉錦鋒

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西 西安 710061；2.西安市中心醫(yī)院感染科，陜西 西安 710003；3.延安大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西 延安 716000；4.渭南市中心醫(yī)院感染科，陜西 渭南 714000；5.安康市中心醫(yī)院感染科，陜西安康 725000；6.寶雞市中心醫(yī)院感染科，陜西 寶雞 721000；7.漢中3201醫(yī)院感染科，陜西 漢中 723099

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)為黃病毒科的一種，大小為55～65 nm，有包膜的正單鏈RNA 病毒。丙型肝炎病毒是由哈維·奧爾特、邁克爾·霍頓和查爾斯·M·賴斯所發(fā)現(xiàn)，并且三人均在2020年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。丙型肝炎病毒在體內(nèi)感染后6 個(gè)月內(nèi)，因約80%的患者無(wú)明顯臨床癥狀，從而錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)期。丙型肝炎病毒在體內(nèi)持續(xù)潛伏，導(dǎo)致肝臟慢性炎癥，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化及肝癌，因此丙肝已成為我國(guó)乃至世界主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。由于HCV 病毒聚合酶缺乏校正功能的特點(diǎn)，使其自身基因組序列容易發(fā)生變異，目前研究已發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因型及100多種亞型。不同基因型與肝病進(jìn)展、肝癌發(fā)生及抗病毒藥物療效等密切相關(guān)。不同地區(qū)HCV基因型分布特點(diǎn)與感染、傳播路線密切相關(guān)，由于人口流動(dòng)性增加及感染途徑的變化，HCV 基因型的分布也不斷變化。探討HCV 基因型的地域分布特征對(duì)于了解HCV病毒傳播路線、制訂合理而有效的診療方案、制訂合適的防控措施具有重要的研究?jī)r(jià)值。相關(guān)資料顯示，陜西省大樣本的HCV基因分型數(shù)據(jù)缺乏，因此，本研究對(duì)陜西省陜南、關(guān)中、陜北三個(gè)主要地理區(qū)域HCV感染者進(jìn)行基因分型，以了解陜西省HCV基因型的分布特征，為丙肝的治療及預(yù)防提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年12月在陜西省7 家市級(jí)醫(yī)院(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安市中心醫(yī)院，延安大學(xué)附屬醫(yī)院，渭南市中心醫(yī)院，安康市中心醫(yī)院，寶雞市中心醫(yī)院，漢中3201醫(yī)院)就診的2827例HCV患者作為研究對(duì)象，所有患者均符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中HCV相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)且分型前未接受過(guò)抗病毒相關(guān)治療，排除因其他病毒所致的肝炎及酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等其他導(dǎo)致肝臟病變的疾病。收集所有患者的臨床資料，包括性別、年齡、居住地區(qū)等。其中，男性1639 例，女性1188 例；年齡17～75 歲，平均(46.35±14.38)歲；陜北地區(qū)(榆林、延安)298 例，陜南地區(qū)(漢中、安康)213 例，關(guān)中地區(qū)(西安、寶雞、渭南)2316 例。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)本采集 于晨間抽取兩組患者入院時(shí)的靜脈血10 mL，置于室溫下靜置24 h，離心后取陽(yáng)性血清1.0 mL用Eppendor離心管分裝，-70℃保存標(biāo)本。

1.2.2 HCV基因型檢測(cè) 采用PCR-熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行HCV基因型檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自泰普生物科學(xué)有限公司，所有操作均嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明書。PCR-RDB分子雜交提取HCV 基因分型RNA 的方法：①取已滅菌離心管，依次加入50 μL RNA 蛋白酶K、200 μL 血清、200 μL 裂解液。②搖蕩均勻后，通過(guò)離心泵高速離心10 s，放于72℃環(huán)境中靜置10 min。③在其中加入250 μL 無(wú)水乙醇，使其充分融合在一起，再將其轉(zhuǎn)入離心柱中。以12000 r/min離心1 min后，除去離心液。④在離心柱中加入500 μL抑制去除液，以12000 r/min離心1 min，然后加入500 μL去離子液，以12000 r/min離心1 min，再重復(fù)一次，最后將離心柱移入新的收集試管中。⑤將離心柱以14000 r/min 離心3 min 以除去殘余乙醇。⑥將離心柱移入新的無(wú)菌離心管中，放于72℃環(huán)境中靜置2 min，再加入已預(yù)熱的50 μL洗脫液，室溫下靜置1 min，再以14000 r/min 離心1 min。⑦在試管中加入30 μL 提取的病毒核酸，按PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：第一次為：94℃5 min，然后再以以下方式進(jìn)行循環(huán)：94℃40 s；50℃40 s；72℃40 s，30個(gè)循環(huán)；第二次為：94℃5 min，按以下方式循環(huán)：94℃40 s；54℃40 s；72℃40 s，30個(gè)循環(huán)。所有檢測(cè)孔均設(shè)置為FAM 和HEX，熒光信號(hào)收集：60℃45 s；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的Start 值，End 值以及Threshold 值，點(diǎn)擊Analysis 自動(dòng)獲取分析結(jié)果，在Report界面查看結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) 采用PCR-熒光探針?lè)z測(cè)HCV 基因型分型，對(duì)比不同地區(qū)、不同性別患者間的HCV基因型分布情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)描述采用百分率表示，多個(gè)樣本率間的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果 本組2827例HCV感染者中，有2595 例成功分型，檢出率為91.79%。其中1b 型1049 例，占37.11%；2a型1241例，占43.90%；1a型25例，占0.88%；2b型13例，占0.46%；3a 型181例，占6.4%；3b型50 例，占1.77%；6a 型36例，占1.27%，見(jiàn)圖1。

圖1 陜西省HCV基因型分布

2.2 陜西省三大地區(qū)HCV基因分型特征 關(guān)中和陜北地區(qū)，以2a 型為主，分別占43.36%和47.99%，而陜南以1b 型為主，占52.11%，三個(gè)地區(qū)的基因型分布比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=119.4，P＜0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，陜南與關(guān)中、陜北與關(guān)中、陜南與陜北之間的基因型分布差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=54.355，62.274，36.976；P＜0.05)，見(jiàn)表1和圖2。

表1 陜南、陜北、關(guān)中地區(qū)HCV基因型分布比較(例)

圖2 陜西省陜南、關(guān)中、陜北地區(qū)HCV基因分型分布

2.3 性別與HCV基因型的關(guān)系 納入的丙肝男性患者中2a 型比例最高(40%)，其次是1b 型(39%)和3a型(15%)；女性患者中2a型和1b型比例相同(46%)，其次是3a型(4%)。2a、1b型在不同性別組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.734，1.003；P＞0.05)，3a型在不同性別組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.037；P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 不同基因型的性別比較

3 討論

HCV 是一種流行于全球的RNA 病毒，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有1.7億的人口感染慢性HCV[1]。由于HCV的高遺傳變異性，目前HCV表現(xiàn)為7種基因型和100多種亞型，國(guó)際上通常采用阿拉伯?dāng)?shù)字(1～7)代表基因型，英文小寫字母代表基因亞型(如1a、1b等)。研究顯示，不同基因型或亞型感染的地理分布存在差異。1，2，3 型于全球最高，其中1 型約有8340 萬(wàn)患者(46.2%)，幾乎占所有感染者的一半，且超過(guò)1/3的患者位于東亞；其次是3 型約有5430 萬(wàn)感染者(30.1%)，且3/4的患者分布于南亞，據(jù)伊朗權(quán)威數(shù)據(jù)顯示，在伊朗地區(qū)，基因3 型為主要基因型，占90.3%左右[2]；2、4和6型感染者分別為1650萬(wàn)(9.1%)，1500萬(wàn)(8.3%)和980萬(wàn)(5.4%)，2型和6型病例于東亞最多，而北非和中東的4 型病例較多；有研究顯示5 型可能是全球最少的HCV 基因型，大約140 萬(wàn)人感染，大部分發(fā)生在南部和東部撒哈拉以南的非洲；迄今為止，7型是從一名居住于加拿大的中非移民體內(nèi)分離出來(lái)的，僅有此一例[3]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的慢性丙型病毒性肝炎與肝硬化、原發(fā)性肝癌甚至肝衰竭密切相關(guān)[4]，而HCV基因型與抗病毒藥物的療效密切相關(guān)，如1a、1b 型易發(fā)生嚴(yán)重肝臟疾病以及對(duì)干擾素治療的低反應(yīng)，且1b 型患者患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)更大[5]。因此，探討HCV基因分型的地域性分布特征對(duì)于明確HCV病毒的演變及基因分型的轉(zhuǎn)化、制訂合理有效的診療方案具有重要的研究?jī)r(jià)值和意義。

我國(guó)是一個(gè)幅員遼闊，人口眾多的國(guó)家，丙肝的分布同全球略有不同。莊輝院士對(duì)我國(guó)各省慢性丙肝感染人群采取分層抽樣的方法調(diào)查后，顯示1b型為我國(guó)最主要基因型(56.8%)，但因我國(guó)地域廣闊，不同地區(qū)間差異較大[6]。其次為2a型。我國(guó)南方和北方的基因型分布也不相同，且基因型3a型、3b型、6a型正逐漸增加，同時(shí)1b型和2a型正處于降低趨勢(shì)[7]。一項(xiàng)納入29個(gè)省市自治區(qū)的32030例HCV感染者大樣本調(diào)查研究同樣發(fā)現(xiàn)1b(52.18%)、2a(28.69%)為我國(guó)最主要的基因型[8]。在我國(guó)北方地區(qū)HCV 基因型比較單一，以1b 和2a 為主；南方地區(qū)的HCV 基因型種類較多，以1b型為主，其次為2a、3a、3b，各型均占有較大比例。但一些地區(qū)基因型分布較特殊，例如云南省以3b型為主、香港以6a型為主。近幾年，由于受流動(dòng)人口、涉毒人員增加、經(jīng)濟(jì)全球化、人員流動(dòng)頻繁等因素影響，使得原有基因型分布狀況發(fā)生改變，例如，由于社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口流動(dòng)的增加等因素，6a型已經(jīng)取代了2a型，成為廣東第二大丙肝基因型[9-10]。

本研究是目前樣本量最大的關(guān)于陜西省HCV 基因型分析，所研究結(jié)果為我省慢性丙肝患者進(jìn)行個(gè)體化抗病毒治療、經(jīng)濟(jì)且有效預(yù)防HCV傳播具有重要意義。本研究采用大樣本調(diào)查研究的方式，在陜西省三大地區(qū)(陜南、陜北、關(guān)中)的地區(qū)級(jí)中心醫(yī)院，收集了共2827例HCV感染者血清，結(jié)果顯示陜西省丙肝基因分型以2a型(43.90%)為主，其次依次為1b型(37.11%)，3a型(6.40%)，3b型(1.77%)。本研究顯示，陜南、陜北及關(guān)中病毒基因型并不完全一致，陜南以1b型為主，因地理位置、生活習(xí)慣等不同，對(duì)HCV 感染及傳播途徑也不盡相同。由于秦嶺這一天然分界線的存在，陜南地理位置更接近于四川，基因分型也更接近于四川[11-12]。本研究顯示陜北和關(guān)中均以2a型為主，2a型在我國(guó)丙肝基因型中僅次于1b型，而在陜西地區(qū)則排第一。在我國(guó)，2a型始于1979年，在此之前集中在西北地區(qū)，可能與毒品沿古代絲綢之路從西方和中亞運(yùn)輸?shù)轿覈?guó)有關(guān)。并且我國(guó)西北部的2a型菌株和日本菌株很接近，提示2a型可能是流行于中國(guó)北部地區(qū)，特別是我省的原因之一[13]?；蛐?a和3b在靜脈吸毒者中非常常見(jiàn)，主要在歐洲，美國(guó)和東南亞地區(qū)，我國(guó)主要集中在我國(guó)西南地區(qū)(云南、貴州、四川)和東部地區(qū)，尤其是靜脈吸毒的艾滋病患者，甚至高于1b型[14]。本研究顯示3a基因型在我省占有一定比例，考慮與鄰近國(guó)家(如阿富汗、阿塞拜疆、烏茲別克斯坦、白俄羅斯等)通過(guò)販運(yùn)毒品傳播到中國(guó)以及與經(jīng)濟(jì)發(fā)展導(dǎo)致的人口流動(dòng)性增加有關(guān)。

研究顯示，丙肝基因型分布可能與性別有關(guān)，在利比亞人群中，基因1 型中男性比例較高，而4 型則多發(fā)生于女性[15]；而在希臘的一項(xiàng)研究中顯示，1 型在老年人和女性中更常見(jiàn)，3 型在年輕人和男性中較常見(jiàn)[16]。此外，丙肝基因型分布在很大程度上受傳播途徑的影響，例如在年輕男性中，通過(guò)注射吸毒進(jìn)行持續(xù)傳播顯示出較高的患病率，而在受感染人群年齡較大的國(guó)家中，則是通過(guò)母嬰傳播和不安全血液制品的使用等途徑傳播[17]。Christer 在一項(xiàng)靜脈吸毒人群中研究性別對(duì)HCV 感染的影響中指出，在納入的310 例靜脈吸毒人群中，268 例吸毒人員HCV 抗體陽(yáng)性(86.5%)，其中207例可以檢測(cè)出HCV-RNA。1型和3 型基因分別占35.9%和33%，女性在HCV 感染中更容易自發(fā)性的恢復(fù)，可能導(dǎo)致相對(duì)性的男性吸毒人員HCV比例的升高[18]。在我國(guó)多個(gè)地區(qū)，均有研究顯示在吸毒人群中，男性所占比例明顯高于女性。本研究結(jié)果顯示，女性丙肝患者以2a，1b型為主，男性患者最多的2a型，其次是1b型和3a型，且男性3a型比例明顯高于女性，考慮與通過(guò)販運(yùn)毒品傳播到中國(guó)，且吸毒人員中，男性所占比重較大有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示陜西省的HCV 基因型的分布特征不同于省外其他地區(qū)，主要以2a 型、1b 型、3a 型為主，且3a 型基因型分布可能與性別有關(guān)，這將有助于了解陜西省不同地理區(qū)域丙型病毒性肝炎的流行病學(xué)趨勢(shì)，為疾病防控部門提供依據(jù)，也將為臨床工作者制訂更加合理且有針對(duì)性的診療方案和藥物的合理選擇提供幫助。