聶佳惠，李紅軍，宋威武，吳承金，宋波濤，田振東*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬鈴薯生物學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室/湖北馬鈴薯工程技術(shù)研究中心/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢430070；2.中國南方馬鈴薯研究中心，湖北恩施430070）

馬鈴薯作為世界上第三大糧食作物，在世界糧食安全中起著重要作用[1]。中國馬鈴薯的種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一，目前，中國馬鈴薯鮮薯年產(chǎn)量達到9 000萬至1億t。然而，馬鈴薯生產(chǎn)易受到各種病蟲害影響，其中，晚疫病對馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重危害[2,3]。

馬鈴薯晚疫病發(fā)病與天氣有關(guān)，雨水充沛年份往往發(fā)病嚴重。生育期發(fā)病后，地上部分植株受到侵染，葉片受損或壞死，光合作用受到嚴重影響，塊莖無法膨大生長，造成較大的產(chǎn)量損失。發(fā)病后期孢子隨雨水沖刷進入土壤導(dǎo)致塊莖感染，在貯藏期發(fā)病造成嚴重損失。當(dāng)前，晚疫病防治主要依靠噴灑化學(xué)農(nóng)藥。但頻繁噴灑農(nóng)藥不僅對環(huán)境安全產(chǎn)生嚴峻的影響，而且加大了對病原菌的選擇壓，病原菌抗藥性增強，導(dǎo)致化學(xué)藥劑藥效減弱甚至喪失。

選擇和培育抗病品種是防治晚疫病最經(jīng)濟有效的方法。自從在野生種Solanum demissum中發(fā)現(xiàn)晚疫病抗病基因，育種家先后將一些主效R基因（R1～R11）轉(zhuǎn)移到馬鈴薯栽培種中[3,4]，但不久之后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)主效R基因并沒有持久抗性特點，大多數(shù)已知R基因已被克服。水平抗性對晚疫病菌的選擇壓小，可延緩?fù)硪卟【倪M化，抗性相對穩(wěn)定持久[5]。Mosquera等[6]對184個四倍體馬鈴薯品種及材料進行了單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分析，通過全基因組分析發(fā)現(xiàn)8個基因的SNP位點與晚疫病水平抗性關(guān)聯(lián)，特定SNP位點對晚疫病田間抗性有貢獻。

鄂西山區(qū)是馬鈴薯的傳統(tǒng)種植區(qū)域，栽培面積達40.00萬～40.67萬hm2。由湖北恩施中國南方馬鈴薯研究中心和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯團隊選育的鄂薯和華薯系列品種為湖北馬鈴薯生產(chǎn)提供了系列化品種。鄂薯系列的部分品種在育成早期抗性表現(xiàn)突出，例如‘鄂馬鈴薯1號’、‘鄂馬鈴薯3號’和‘鄂馬鈴薯5號’?！躐R鈴薯3號’田間抗性表現(xiàn)很好，曾經(jīng)在鄂西和西南山區(qū)廣泛種植，但現(xiàn)在抗性完全喪失。本研究根據(jù)國內(nèi)品種已知抗病基因組成情況，選取了3個（R3a，R3b，R8）抗病基因分子標(biāo)記，以及6個水平抗性相關(guān)基因SNP位點標(biāo)記對30個品種進行了檢測，以期對鄂薯和華薯系列品種晚疫病抗性遺傳背景有一個系統(tǒng)了解，為生產(chǎn)中品種選擇與布局提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 參試材料

本研究所用鄂薯系列馬鈴薯品種‘鄂馬鈴薯1號’，‘鄂馬鈴薯3號’～‘鄂馬鈴薯16號’，共計15個，由湖北恩施中國南方馬鈴薯研究中心主持選育而成，以下簡稱“鄂薯x號”；華薯系列品種‘華薯1號’～‘華薯4號’‘華渝5號’‘華渝6號’‘華薯7號’～‘華薯13號’，共計13個，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯團隊主持選育而成?！A恩1號’和‘華恩2號’由雙方聯(lián)合選育而成。具體信息見表1。

1.2 馬鈴薯基因組提取

田間或溫室采集馬鈴薯幼嫩葉片，利用改良的CTAB法[7]提取植物組織DNA，凝膠電泳檢測DNA完整性。將DNA稀釋至50 ng/μL，以RNA Polymerase II（RP2）基因為內(nèi)參，PCR擴增檢測質(zhì)量，引物信息見表2。

1.3 抗病基因分子標(biāo)記檢測

R3a、R3b和R8抗性基因標(biāo)記引物信息見表2。采用2×Taq Master MiX試劑（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），體系為2×Taq Master MiX 5μL，F(xiàn)-和R-Primer各0.5μL（5μM），ddH2O 3μL，模板1μL，總體系10μL。擴增反應(yīng)：95℃5 min；95℃30 s，55～59℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取8μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖膠上10 V/cm恒壓電泳。

1.4 目標(biāo)區(qū)域SNP擴增與測序

根據(jù)Mosquera等[6]報道一些功能基因可能參與馬鈴薯田間抗性，其中一些基因內(nèi)部SNP位點與水平抗性相關(guān)。選取6個與晚疫病田間抗性關(guān)聯(lián)的目標(biāo)基因，在包含SNP位點區(qū)域兩端設(shè)計引物，用于擴增目標(biāo)區(qū)域，引物序列參考丁德駿[9]，引物相關(guān)信息見表3。采用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），體系為：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPs Mix 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，F(xiàn)-和R-Primer各2μL（5μM），模板1μL，ddH2O 18μL，總體系50μL。PCR擴增條件同1.3，退火溫度見表3。凝膠電泳檢測PCR是否擴增成功，后將PCR產(chǎn)物送昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序，利用Snap gene軟件分析目標(biāo)區(qū)域SNP結(jié)果。

表1 供試馬鈴薯品種信息Table 1 Information of potato varieties tested

表2 R8、R3a和R3b引物序列Table 2 Primer sequences for detection R8,R3a and R3b genes

表3 目標(biāo)SNP區(qū)域擴增引物序列Table 3 Primer sequences for amplification of target SNP region

2 結(jié)果與分析

2.1 鄂薯系列R3a，R3b和R8抗病基因分子標(biāo)記檢測

以鄂薯和華恩系列基因組DNA為模板，以RP2基因為內(nèi)參，用表2所示R3a，R3b，R8引物分別擴增。如圖1所示，內(nèi)參基因引物能夠擴增約820 bp片段。R3a引物可以在‘華恩2號’、‘鄂薯1號’、‘鄂薯5號’、‘鄂薯6號’、‘鄂薯8號’、‘鄂薯9號’和‘鄂薯10號’擴增出預(yù)期大小的片段。R3b引物可以在‘華恩2號’、‘鄂薯1號’、‘鄂薯5號’、‘鄂薯6號’、‘鄂薯8號’、‘鄂薯9號’、‘鄂薯10號’、‘鄂薯11號’、‘鄂薯13號’中擴增出預(yù)期大小的片段。R8引物可以在‘華恩1號’、‘華恩2號’、‘鄂薯5號’、‘鄂薯8號’、‘鄂薯9號’、‘鄂薯10號’、‘鄂薯14號’和‘鄂薯15號’擴增出預(yù)期大小的片段。

圖1 鄂薯系列品種R3a，R3b和R8基因標(biāo)記擴增電泳圖Figure 1 Electrophoretic images of R3a,R3b and R8 marker amplification in Eshu varieties

2.2 華薯系列R3a和R3b抗病基因分子標(biāo)記檢測

以華薯系列基因組DNA為模板，以RP2基因為內(nèi)參，用R3a和R3b引物分別擴增。如圖2所示，內(nèi)參基因引物能夠擴增約820 bp片段。R3a引物可以在‘華渝6號’、‘華薯7號’和‘華薯9號’中擴增出預(yù)期大小的片段。R3b引物可以在‘華薯3號’、‘華渝6號’、‘華薯7號’和‘華薯9號’中擴增出預(yù)期大小的片段。R8引物在華薯系列中擴增特異性不好，因此，后續(xù)沒有擴增。

2.3 鄂薯和華薯系列馬鈴薯品種中SNP位點檢測

本研究在部分供試品種中檢測了6個基因的SNP位點。從基因組DNA中用高保真Taq酶擴增目標(biāo)區(qū)域片段，然后對PCR片段進行測序，利用測序結(jié)果判讀軟件Chromas在目標(biāo)區(qū)域判讀SNP位點。由于馬鈴薯為同源四倍體，同一位點四個SNP可能處于雜合狀態(tài)。圖3示意‘鄂薯10號’4個基因SNP位點判讀結(jié)果，方框所示區(qū)域為4個基因中目標(biāo)SNP位點。圖3A代表STAOS2-SNP692位點為G和C；圖3B代表HMGCR-SNP567位 點 為G和C；圖3C代 表CYP71D11-SNP346位點為T，C和A；圖3D代表Rpivnt1-SNP539位點為G和A。將19個品種SNP位點判讀結(jié)果匯總于表4。有些位點顯示單一SNP，表明該位點為純合類型，例如‘鄂薯13號’CYP71D11-SNP346位點為T，表明該位點4個等位位點純合（TTTT）；有的位點為2個SNP位點，例如‘鄂薯10號’HMGCR-SNP567位點為G/C，表明處于雜合狀態(tài)。有的位點顯示存在3個SNP位，例如‘鄂薯10號’CYP71D11-SNP346位點為T/C/A。表4灰色背景標(biāo)記SNP位點為有益SNP位點，即對晚疫病抗性有貢獻的位點。總體上看在擴增 品 種 中STAOS2-SNP692，HMGCR-SNP567，CYP71D11-SNP346和Rpivnt1-SNP539的有益SNP位點出現(xiàn)頻率高，有些有益SNP位點處于純合狀態(tài)，有些處于雜合狀態(tài)。PLOX1-SNP8089位點在所測品種中都處于純合狀態(tài)。

2.4 鄂薯和華薯系列馬鈴薯品種抗性與標(biāo)記和SNP位點關(guān)系分析

主效R基因控制的抗性表現(xiàn)往往與晚疫病菌生理小種有關(guān)。隨著田間生理小種的變化，含有R基因抗性品種的表現(xiàn)也會發(fā)生變化。各品種審定或登記時的抗性表現(xiàn)及標(biāo)記結(jié)果見表5。R3a抗病基因已被克服。就R3b和R8而言，鄂薯系列中，品種抗性與抗病基因分子標(biāo)記有無總體呈正相關(guān)，例如：檢測到R3b分子標(biāo)記的‘鄂薯1號’、‘鄂薯6號’和‘鄂薯13號’的區(qū)試抗性為中抗以上；檢測到R8基因分子標(biāo)記的‘鄂薯14號’、‘鄂薯15號’和‘華恩1號’區(qū)試抗性表現(xiàn)均為中抗；同時檢測到R3b、R8基因分子標(biāo)記的‘鄂薯5號’和‘華恩2號’區(qū)試表現(xiàn)為中抗以上。有些品種中檢測到抗病基因分子標(biāo)記，但區(qū)試抗性表現(xiàn)為感病，例如：‘鄂薯8號’～‘鄂薯11號’。另外，‘鄂薯3號’、‘鄂薯4號’和‘鄂薯16號’未檢測到R3b和R8抗病基因分子標(biāo)記，但區(qū)試抗性表現(xiàn)為中抗以上。華薯系列品種中‘華薯3號’、‘華渝6號’、‘華薯7號’和‘華薯9號’檢測到R3b分子標(biāo)記，但區(qū)試評價均為中感。

圖2 華薯系列品種R3a和R3b基因標(biāo)記擴增電泳圖Figure 2 Electrophoretic images of R3a and R3b marker amplification in Huashu varieties

圖3 ‘鄂薯10號’中4個基因SNPs位點檢測結(jié)果Figure 3 Detection of SNPs of four genes in'Eshu 10'variety

表4 6個基因晚疫病抗性SNP位點判讀結(jié)果Table 4 Interpretation results of SNPs of six late blight resistance related genes

目前認為R8基因是一個具有廣譜和持久的田間抗性的基因。分析2020年恩施田間晚疫病抗性評價結(jié)果與R8基因標(biāo)記的關(guān)系，鄂薯和華恩8個品種具有R8基因標(biāo)記，晚疫病抗性評級覆蓋3級（中抗，2/8），4級（中感，5/8）和5級（感病，1/8）。另外，無R8基因的品種抗性級別也存在變化，例如‘鄂薯4號’表現(xiàn)為3級中抗，‘鄂薯7號’則感病。表明R8基因標(biāo)記有無與田間抗性表現(xiàn)存在較為復(fù)雜的關(guān)系。

如表5所示，華薯系列中STAOS2-SNP692、HMGCR-SNP567、CYP71D11-SNP346和Rpivnt1-SNP539出現(xiàn)頻率較高，位點有雜合有純合，但整體抗性表現(xiàn)較差。例如：‘華薯3號’中檢測到4個純合的SNP位點，抗性表現(xiàn)仍為感??；‘華薯11號’檢測到2個純合位點、3個雜合位點，抗病表現(xiàn)仍為感病?？梢姽┰嚻贩N2020年恩施抗性評價級別與SNP位點關(guān)聯(lián)度較低。

表5 品種抗性、分子標(biāo)記與SNP位點結(jié)果匯總Table 5 Summary of resistance,molecular markers and SNPs of all the cultivars

3 討論

聚合多個抗性基因是培育抗晚疫病品種的重要方法之一。分析已育成品種中抗病基因組成是獲得優(yōu)良抗病品種的重要基礎(chǔ)。本研究利用已開發(fā)的R3a、R3b和R8分子標(biāo)記，對3個系列品種進行了R基因組成分析，發(fā)現(xiàn)鄂薯和華恩系列品種中R基因出現(xiàn)頻率較高。R3a抗病基因已被克服[10]；R3b抗病基因?qū)δ承┎≡》N仍具有一定的抗病性；R8抗病基因具有廣譜和持久的田間抗性[11]，抗病能力較好。鄂薯和華恩的17個品種中，有9份檢測出R3b分子標(biāo)記，8份檢測出R8分子標(biāo)記，除‘鄂薯8號’、‘鄂薯9號’和‘鄂薯10號’區(qū)試抗性表現(xiàn)為感病外，其余品種均表現(xiàn)為抗病，表明該系列品種抗病能力主要由抗病基因提供。除‘華渝5號’外，華薯系列區(qū)試評價均為中感，但檢測到4個品種含有R3b分子標(biāo)記。這種情形可能是部分病原菌小種能克服R3b基因，或分子標(biāo)記不準確造成。劉勛等[12]通過分子標(biāo)記檢測到‘華薯2號’和‘鄂薯3號’中含R3b抗病基因，但本研究并未檢測到，表明R基因分子標(biāo)記的準確性仍需提高。另外，部分品種中未檢測到抗病基因分子標(biāo)記，但抗性表現(xiàn)較好，例如：‘鄂薯4號’，推測該品種中含有其他抗性基因。

盡管R8抗病基因具有持久的田間抗性，但當(dāng)前中國馬鈴薯產(chǎn)區(qū)存在“超級毒力”小種可以克服R8基因[10]。從本研究的結(jié)果來看，具有R8標(biāo)記的8個鄂薯和華恩品種抗性級別田間存在差異，但是總體而言，中抗和中感占比（7/8）更高。由于2020年馬鈴薯生長季節(jié)恩施天氣多雨潮濕，晚疫病發(fā)病很嚴重，絕大部分品種田間抗性表現(xiàn)很差，也可能導(dǎo)致抗性評價沒有分辨度，抗性與標(biāo)記之間的關(guān)系被掩蓋。

水平抗性對多種晚疫病菌小種表現(xiàn)抗性，抗性較為穩(wěn)定，微效多基因?qū)λ娇剐跃哂幸欢ㄘ暙I[13]。本研究挑取了6個與水平抗性緊密關(guān)聯(lián)基因的特異SNP位點，探索育成品種中的SNP位點分布，以期了解這些位點是否與水平抗性相關(guān)。根據(jù)Mosquera等[6]報道，水平抗性SNP位點對晚疫病抗性貢獻與該位點劑量有關(guān)，即該位點趨向純合時貢獻更明顯。本研究中，STAOS2、HMGCR、CYP71D11和Rpivnt1基因的有益SNP位點在品種中出現(xiàn)次數(shù)較多，頻率達79%以上，各基因特異位點的純合比例各不相同，分別為38.8%、60.0%、26.3%和57.9%。但綜合華薯、鄂薯和華恩系列的品種區(qū)試抗性表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)相關(guān)品種的區(qū)試抗性并未提高，表明抗性表現(xiàn)與SNP位點分布無明顯關(guān)聯(lián)。然而丁德駿[9]研究結(jié)果表明一些SNP位點與其研究群體材料晚疫病抗性存在一定關(guān)聯(lián)。這種差異可能受馬鈴薯的遺傳背景、田間的實際發(fā)病情況、晚疫病菌的變化等因素影響。就多年田間種植觀察，‘華恩1號’、‘華恩2號’、‘華渝5號’和‘華渝6號’具有較好田間抗性。

研究結(jié)果顯示鄂薯、華恩和華薯系列部分馬鈴薯品種含有R3a和R3b基因，鄂薯和華恩系列含有R8基因。同時，部分馬鈴薯品種中檢測到一些與田間抗性有關(guān)的SNP位點?？共』驑?biāo)記、田間抗性有關(guān)的SNP位點存在與否與晚疫病抗性評價結(jié)果存在復(fù)雜的關(guān)系，有待根據(jù)多年的田間抗性評價結(jié)果判斷。本研究結(jié)果可為進一步深入探究標(biāo)記與抗性之間的關(guān)系奠定較好基礎(chǔ)。

2017年各地區(qū)馬鈴薯（折糧）播種面積和產(chǎn)量