張偉同，徐五琴，王亞兵

WHO(2019)乳腺腫瘤分類對乳腺惡性葉狀腫瘤(malignant phyllodes tumor, MPT)的診斷標準進行了調(diào)整，除了繼續(xù)強調(diào)間質(zhì)細胞核的多形性、間質(zhì)過度增生、核分裂象計數(shù)、間質(zhì)細胞豐富、浸潤性邊緣等參數(shù)外，將含有異源性成分的種類做了修改，廢除了將高分化脂肪肉瘤(well-differentiated liposarcoma, WDLS)作為判斷MPT的組織學標準，而稱之為伴高分化脂肪肉瘤分化葉狀腫瘤(differentiation of well-differentiated liposarcoma in phyllodes tumor, DWLSPT)。因為已有證據(jù)表明，這些葉狀腫瘤內(nèi)的異常脂肪細胞并不存在其它部位WDLS特有的MDM2和CDK4基因突變。根據(jù)共識意見，這種異源性成分無轉(zhuǎn)移潛能，所以一致認為，除非有其它惡性的組織學改變，否則僅有這種異源性成分存在不足以診斷MPT，這就顛覆了以往對MPT的認識。本文通過對2例DWLSPT進行臨床病理分析，以提高對這類腫瘤的認識，從而掌握新的診斷標準。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院甲乳外科2016年1月～2020年1月診治的乳腺葉狀腫瘤76例，占同期所有乳腺腫瘤的4.94%(76/1 538)，其中DWLSPT有2例(2/1 538，0.13%)，占葉狀腫瘤的2.63%(2/76)。收集患者年齡、腫瘤直徑、超聲檢查、鉬靶檢查、手術(shù)方式、臨床分期、隨訪結(jié)果(電話隨訪)等臨床病理資料。

1.2 標本處理所有標本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，Leica-300S全自動脫水機中常規(guī)脫水、石蠟包埋、Leica RM2235石蠟切片機上3 μm厚切片、Leica ST5020全封閉染色機中HE染色；所有切片均由兩位乳腺專科病理醫(yī)師閱片，組織學類型按照WHO(2012)乳腺腫瘤分類標準診斷[1]，臨床分期則依據(jù)第8版AJCC乳腺癌分期系統(tǒng)[2]。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 用涂膠的防脫載玻片撈取3 μm厚蠟片。免疫組化采用EnVision兩步法在徠卡(Leica BOND-MAX)自動免疫組化儀進行標記，免疫組化所用一抗包括S-100蛋白(15E2E2+4C4.9)、MDM2(SMP14)、CDK4(EP180)、p16(16P04/JC2)、CD117(EP11)、CD34(EP88)、Ki-67(MIB1)試劑盒均購自北京中杉金橋公司，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判讀：S-100蛋白和p16胞核/胞質(zhì)著色，MDM2、CDK4和Ki-67均為胞核著色，CD34胞膜著色，CD117為胞膜/胞質(zhì)著色。選用2例纖維腺瘤作為對照。

1.3.2FISH 選取2例DWLSPT組織固定充分的蠟塊進行FISH檢測，以其它部位WDLS蠟塊作為陽性對照。制作4 μm厚切片，經(jīng)脫蠟、乙醇沖洗及蛋白酶消化等預(yù)處理，滴加已變性的MDM2和CDK4探針(購自廣州安必平醫(yī)藥公司)，雜交過夜。MDM2和CDK4 FISH結(jié)果的判讀參考文獻[3]：評估至少100個細胞，計數(shù)胞核內(nèi)的紅色、綠色信號，超過20%的細胞核內(nèi)出現(xiàn)擴增(2個綠色信號，≥3個紅色信號)或單個細胞核內(nèi)出現(xiàn)成簇的紅色信號判讀為陽性。

2 結(jié)果

2例患者年齡分別為58歲和62歲，腫塊直徑分別為5.3 cm和6.9 cm；B超檢查和鉬靶檢查的BI-RADS評分均為4B。2例均行單純?nèi)橄偾谐?前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)。低倍鏡下2例DWLSPT均觀察到分葉狀結(jié)構(gòu)；上皮成分可見腺上皮和肌上皮排列的雙層結(jié)構(gòu)，腺上皮呈普通型增生(usual ductal hyperplasia, UDH)。例1見葉狀結(jié)構(gòu)，間質(zhì)成分稍豐富(圖1)，中度異型，核分裂象9個/10 HPF，出現(xiàn)透明變性和黏液變性；部分區(qū)域有分帶現(xiàn)象；局部區(qū)域見WDLS成分，約占整個病變的70%，其內(nèi)含有分化成熟的脂肪組織，間隔內(nèi)見印戒樣和蜘蛛樣脂母細胞。例2也見葉狀結(jié)構(gòu)，間質(zhì)細胞較為豐富，細胞異型明顯，核分裂象18個/10 HPF，分帶現(xiàn)象明顯，WDLS成分約占10%(圖2)。2例腫瘤中均未見壞死和神經(jīng)侵犯；腫瘤大多區(qū)域與周圍乳腺組織境界清楚，局部區(qū)域呈浸潤性生長。均無前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，也無遠處轉(zhuǎn)移征象。免疫表型：WDLS成分S-100蛋白、p16陽性，MDM2(圖3)和CDK4陰性(圖4)；其它成分CD117陽性，CD34弱陽性，Ki-67總增殖指數(shù)分別為20%和50%。臨床分期均為ⅡB期。FISH檢測均未發(fā)現(xiàn)MDM2基因(圖5)和CDK4基因擴增(圖6)。例1如除去WDLS，僅能診斷為交界性葉狀腫瘤(borderline phyllodes tumor, BoPT)，電話隨訪例1術(shù)后無瘤生存35個月，無局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移；例2于術(shù)后40個月時出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，行復(fù)發(fā)病灶切除術(shù)，其內(nèi)僅見纖維肉瘤樣成分，無上皮性成分，未見WDLS成分；電話隨訪時無遠處轉(zhuǎn)移。

3 討論

葉狀腫瘤屬于乳腺纖維上皮性腫瘤的一種，其診斷、生物學行為、預(yù)后和治療一直備受爭議。WHO(2012)乳腺腫瘤分類[1]中，MPT的診斷標準有間質(zhì)細胞核明顯多形性、間質(zhì)成分過度增生(即一個低倍鏡視野下未見上皮性成分)、間質(zhì)細胞核分裂象增多(≥10個/10 HPF)、間質(zhì)細胞豐富常為彌漫性的、有浸潤性邊緣。如缺乏上述組織學改變，而間質(zhì)出現(xiàn)惡性異質(zhì)性成分，如脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、纖維肉瘤等，即可診斷為MPT。WHO(2019)乳腺腫瘤分類中對MPT診斷標準除了在將核分裂象數(shù)計數(shù)方法以≥5個/mm2替代了≥10個/10 HPF外，就是在葉狀腫瘤中出現(xiàn)WDLS，不再作為診斷MPT的依據(jù)。本組例1在間質(zhì)細胞核的多形性、間質(zhì)過度增生、核分裂象計數(shù)、間質(zhì)細胞豐富、浸潤性邊緣等指標上僅達到診斷BoPT的標準，由于存在WDLS，才診斷為MPT；例2中，除了含有WDLS外，其它各項指標均達到了診斷MPT的標準。由此可見惡性異源性成分在WHO(2012)中診斷MPT的重要價值。

圖1 例1見葉狀結(jié)構(gòu)，局部間質(zhì)成分稍豐富，多數(shù)區(qū)域為WDLS成分 圖2 例2見葉狀結(jié)構(gòu)，間質(zhì)細胞較為豐富，細胞異型明顯，見少量脂肪肉瘤成分 圖3 例1：WDLS細胞MDM2陰性，EnVision法 圖4 例1：WDLS細胞CDK4陰性，EnVision法 圖5 例1：MDM2擴增探針：計數(shù)100個細胞，紅色160，綠色155，紅綠比例為1.03，紅色平均值為1.6；未見MDM2基因擴增 圖6 例2：CDK4擴增探針計數(shù)100個細胞，紅色185，綠色160，紅綠比例為1.15，紅色平均值為1.85，未顯示CDK4基因擴增

脂肪肉瘤作為一種較為常見的軟組織腫瘤，包含多種類型，如WDLS/不典型脂肪腫瘤(atypical lipomatous tumour, ALT)、多形性脂肪肉瘤(pleomorphic liposarcoma, PLS)、黏液型脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma, MLS)、去分化脂肪肉瘤(dedifferentiated liposarcoma, DDLPS)等。Warrier等[4]報道了2例含有異質(zhì)性成分的MPT，僅1例含有脂肪肉瘤成分。Zujic等[5]報道1例35歲年輕女性含有脂肪肉瘤成分的MPT。Kim等[6]從影像學角度報道了1例含有脂肪肉瘤成分的MPT，在磁共振上能夠觀察到脂肪影，這3組報道均為WDLS。Sancheti等[7]報道的1例MPT則含有PLS成分。Polat等[8]則報道了1例BoPT含有PLS成分，之所以將其診斷為BoPT，是因為觀察到間質(zhì)細胞核分裂象僅為2個/10 HPF，未采納WHO(2012)乳腺腫瘤分類的觀點。典型的WDLS/ALT主要由成熟的脂肪構(gòu)成，同時伴有數(shù)量不等的細胞核深染的梭形細胞和多泡狀脂母細胞，而PLS則具有非常顯著的細胞多形性，包括奇異型巨細胞，許多細胞含有強嗜酸性胞質(zhì)和嗜伊紅的透明小滴，缺乏特征性的單泡狀或多泡狀脂母細胞。含有PLS的MPT一定要與化生性癌相鑒別，化生性癌與MPT鑒別較為有用的標志物包括CKpan、p63、CD34、CD117和BCL-2，CKpan與p63在MPT中通常陰性，在化生性癌則陽性，CD34和BCL-2的表達與之相反。肖曉嵐等[9]報道1例間質(zhì)過度生長伴p63異常表達的MPT，說明免疫組化的局限性。廣泛取材并觀察有無浸潤性癌和間葉雙向分化成分存在至關(guān)重要。合理使用并解讀免疫組化標記，為尋找不易觀察到的上皮性成分可提供有效的幫助[10]。

MDM2是一種鼠雙微體2基因，CDK4即為周期蛋白依賴激酶，是與細胞周期進程相對應(yīng)的一套Ser/Thr激酶系統(tǒng)。MDM2和CDK4位于染色體12q13-15區(qū)段，調(diào)控細胞周期進程，在細胞由G1期向S期過渡中起限速作用[10]。目前，利用免疫組化和(或)FISH檢測MDM2和CDK4已經(jīng)成為診斷脂肪肉瘤[11]和骨肉瘤[12]的常規(guī)輔助手段。Hallin等[13]報道1例伴有脂肪肉瘤分化的葉狀腫瘤，其含異質(zhì)性成分包括WDLS和PLS，利用免疫組化和FISH手段，未見MDM2和CDK4蛋白表達，僅表達p16蛋白；也無位于12q13-15的MDM2和CDK4基因擴增。其它學者也未在含有WDLS和PLS成分的葉狀腫瘤中未發(fā)現(xiàn)MDM2和CDK4蛋白表達及基因擴增。本組2例中均未檢測出MDM2和CDK4的表達和擴增，是否預(yù)示著DWLSPT中的脂肪成分是非腫瘤性的，而是一種化生，因為雖然觀察到脂母細胞的存在，但多為分化成熟的脂肪組織，故WHO(2019)乳腺腫瘤分類中提出DWLSPT的概念。p16基因又稱MTS基因，是一種細胞周期中的基本基因，直接參與細胞周期的調(diào)控，負調(diào)節(jié)細胞的增殖。李寧等[14]研究發(fā)現(xiàn)p16在脂肪肉瘤中的表達與腫瘤分化呈負相關(guān)，隨著分化程度的降低，其表達也呈下降趨勢。本組2例中的WDLS成分表達p16也印證了上述觀點。

綜上，葉狀腫瘤中僅含有的WDLS成分不再作為診斷MPT的依據(jù)，必須結(jié)合其它指標。但因病例數(shù)較少，還有待積累更多病例進行深入探究。