張曉亞，徐金娣，許 軍，鄒葉廷，龍 芳, 3*，李松林*

整合糖組與代謝組學(xué)方法比較蒸制和酒燉熟地黃化學(xué)成分

張曉亞1, 2，徐金娣2，許 軍1，鄒葉廷1，龍 芳1, 3*，李松林1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 中藥質(zhì)量研究室，江蘇 南京 210028 2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院和中國中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院 中藥代謝組研究室，江蘇 南京 210028 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 呼吸科，江蘇 南京 210028

對《中國藥典》收載的蒸制和酒燉2種炮制法所得熟地黃的化學(xué)成分進(jìn)行比較研究。整合基于HPLC（C18）-PDA、HPLC（NH2）-ELSD和高效凝膠滲透色譜（HPGPC）-ELSD的糖組學(xué)和基于UPLC-QTOF-MS/MS的代謝組學(xué)方法，對2種熟地黃的糖類組分（多糖、寡糖和游離單糖）和非糖小分子組分進(jìn)行分析比較。與蒸制地黃相比，酒燉地黃多糖相對分子質(zhì)量范圍更寬，較大相對分子質(zhì)量多糖占比較高。2種熟地黃多糖均由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，但其物質(zhì)的量比稍有不同（2.57∶0.05∶1.00∶0.87∶0.102.07∶0.07∶1.00∶1.05∶0.17）。2種熟地黃均含有寡糖水蘇糖、甘露三糖和蜜二糖，但酒燉地黃中水蘇糖含量顯著高于蒸制地黃（＜0.01）。2種熟地黃均含有游離單糖葡萄糖、果糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，但酒燉地黃中葡萄糖（＜0.01）、鼠李糖（＜0.05）和甘露糖（＜0.05）含量均顯著低于蒸制地黃，而半乳糖含量顯著高于蒸制地黃（＜0.05）。2種熟地黃中共篩選到29個(gè)差異性非糖小分子成分，主要為環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類和呋喃醛衍生物。代表性成分定量分析表明，與蒸制地黃相比，酒燉地黃中梓醇、益母草苷和地黃苷D含量較高（＜0.01），密力特苷（＜0.05）和5-羥甲基糠醛（＜0.01）含量較低。蒸制和酒燉地黃內(nèi)在質(zhì)量存在顯著差異，這種內(nèi)在質(zhì)量差異是否會(huì)顯著影響其藥效仍有待深入研究。

熟地黃；蒸制；酒燉；糖組學(xué)；代謝組學(xué)；HPLC；高效凝膠滲透色譜；UPLC-QTOF-MS/MS；多糖；寡糖；游離單糖；甘露糖；半乳糖醛酸；葡萄糖；半乳糖；阿拉伯糖；水蘇糖；甘露三糖；蜜二糖；果糖；鼠李糖；環(huán)烯醚萜苷類；苯乙醇苷類；呋喃醛衍生物；梓醇；益母草苷；地黃苷D；密力特苷；5-羥甲基糠醛

熟地黃為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.干燥塊根的炮制品，具有補(bǔ)血滋陰、益精填髓的功效，用于血虛萎黃、肝腎陰虛等癥[1]。歷代本草記載了十余種熟地黃炮制方法[2-3]，其中蒸制法始見于漢代《金匱要略方論》[4]，酒燉法始見于明代《炮炙大法》[5]，此2種方法已被《中國藥典》2020年版收錄為法定方法[1]?，F(xiàn)代研究表明熟地黃中主要活性成分包括糖類、環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類和呋喃醛衍生物等[6]。李軍等[7]曾對蒸制和酒燉地黃的還原糖進(jìn)行含量比較，陶益等[8]和許軍等[9]曾對2種熟地黃中部分非糖類小分子成分進(jìn)行含量比較。但對熟地黃中糖類組分（游離單糖、寡糖和多糖）及非糖類小分子組分（環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類和呋喃醛衍生物等）同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)比較分析，從整體角度評價(jià)酒燉和蒸制熟地黃內(nèi)在質(zhì)量的研究還未見報(bào)道。

近年來，代謝組學(xué)和糖組學(xué)方法已成功應(yīng)用到中藥炮制研究，區(qū)別于單一或幾個(gè)成分為指標(biāo)，通過同時(shí)表征非糖小分子組分和糖類組分，能從整體角度全面解析中藥炮制化學(xué)機(jī)制[10-12]。本課題組前期曾構(gòu)建基于HPLC（C18）-PDA、HPLC（NH2）- ELSD和高效凝膠滲透色譜（HPGPC）-ELSD的糖組學(xué)以及基于UPLC-QTOF-MS/MS的代謝組學(xué)方法，對生地黃和蒸制熟地黃的糖類組分和非糖小分子組分進(jìn)行了比較研究，揭示了九蒸九制過程熟地黃整體質(zhì)量變化規(guī)律，探討了熟地黃炮制過程中多糖、寡糖以及小分子組分的化學(xué)轉(zhuǎn)化機(jī)制，明確了地黃炮制大分子多糖與小分子呋喃醛及其糖苷類組分之間的聯(lián)系[10-11]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，整合糖組和代謝組學(xué)方法，對酒燉和蒸制地黃的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)比較研究，為不同炮制法熟地黃的藥效物質(zhì)研究提供參考。

1 儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2489紫外檢測器、EmpowerTM3工作站、Waters Acquity UPLCTM液相色譜儀、Waters Synapt G2-SQ-TOF質(zhì)譜儀，美國Waters公司；2000ES蒸發(fā)光散射檢測器，美國Alltech公司；Milli-Q超純水制備儀，美國Millipore公司；AT201電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-250E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

乙腈，色譜純，美國TEDIA公司；甲醇，色譜級(jí)，江蘇漢邦科技有限公司；甲酸，質(zhì)譜級(jí)，德國Sigma-Aldrich公司。1苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），國藥集團(tuán)有限公司；黃酒，批號(hào)20180914，規(guī)格500 mL，中糧紹興酒有限公司。分析用水為Millipore超純水；其余試劑均為分析純。

對照品：甘露糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%，批號(hào)140651-201403）、鼠李糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)111683-201502）、葡萄糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%，批號(hào)110833-201908）、半乳糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，批號(hào)100226-201807）、右旋糖酐相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（1套，批號(hào)140637-201203）購于中國食品藥品檢定研究院；半乳糖醛酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，批號(hào)T0034）購于上海寶曼生物科技有限公司；阿拉伯糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%，批號(hào)ASB-00001945-001）購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；(?)-果糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%，批號(hào)00628）、(+)-蜜二糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%，批號(hào)91016）購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；甘露三糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96%，批號(hào)17122602）購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；水蘇糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號(hào)LB98325）購于Sigma-Aldrich公司；5-羥甲基糠醛（5-HMF，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)140919）、毛蕊花糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)201006）、異毛蕊花糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%，批號(hào)201106）、梓醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號(hào)20131005）和桃葉珊瑚苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)201102）購于四川維克奇生物科技有限公司；益母草苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)HL030494）、地黃苷D（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.3%，批號(hào)J0T-11004）購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；密力特苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)HM030541）購于寶雞市辰光生物科技有限公司。

生地黃樣品（編號(hào)JSPACM-26-6）購于河南溫縣地黃種植戶，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院李松林研究員鑒定為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的干燥塊根。

2 方法

2.1 蒸制和酒燉熟地黃的制備

2.1.1 蒸制熟地黃[10]取生地黃，置蒸屜中，加適量水，按照《中國藥典》2020年版附錄IV0213炮制通則蒸法隔水蒸制，每次蒸6 h，取出，60 ℃干燥12 h，共蒸制6次，蒸液與地黃拌勻。取出，晾曬至約八成干時(shí)，切塊（1 cm3左右），60 ℃干燥，即得。

2.1.2 酒燉熟地黃 取生地黃，置燉盅中，按照生地黃與黃酒用量比例5∶2加入黃酒拌勻，浸泡 1 h，按照《中國藥典》2020年版附錄IV 0213炮制通則，共隔水燉36 h，分6次進(jìn)行，每次6 h。取出，晾曬至約八成干時(shí)，切塊（1 cm3左右），60 ℃干燥，即得。

2.2 地黃多糖制備

精密稱取蒸制/酒燉地黃樣品10.0 g，加入超純水140 mL，100 ℃煎煮提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至50 mL，加入188 mL 95%乙醇，在4 ℃下靜置12 h，3500 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，保存上清液，備用（記錄體積），沉淀用無水乙醇洗滌3次，60 ℃揮干，得蒸制/酒燉地黃多糖。

2.3 地黃糖組分表征

2.3.1 地黃多糖的重均相對分子質(zhì)量（w）分布范圍分析

（1）對照品溶液制備：精密稱取w分別為2700、5250、9750、13 050、36 800、64 650、135 350、300 600、2 000 000的右旋糖酐對照品適量，用超純水溶解并定容，制成質(zhì)量濃度均為2.0 mg/mL的對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣。

（2）供試品溶液制備：精密稱取蒸制/酒燉地黃多糖各15.00 mg，分別加1 mL超純水溶解，過0.45 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣。

根據(jù)工程特點(diǎn)和要求，選用中聯(lián)ZDG 360成槽機(jī)進(jìn)行施工，成槽機(jī)上的糾偏裝置能夠?qū)Τ刹圪|(zhì)量隨時(shí)監(jiān)控、糾正。成槽現(xiàn)場圖見圖5。

（3）色譜條件：按課題組已建立的方法[10]進(jìn)行測定，色譜柱為TSK-GEL G4000PWxL凝膠柱（300 mm×7.8 mm，10 μm），柱溫35 ℃，流動(dòng)相為超純水，體積流量0.5 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，ELSD漂移管溫度115 ℃，N2體積流量3.2 L/min。

（4）多糖w分布：以右旋糖苷對照品保留時(shí)間為橫坐標(biāo)（），w的對數(shù)值為縱坐標(biāo)（lgw），得線性回歸方程lgw＝9.481 7－0.205 9，＝0.996 3。蒸制和酒燉地黃多糖色譜圖見圖1，以對照品線性回歸方程計(jì)算蒸制地黃多糖w分布范圍為1.02×103～5.54×106，主要有4個(gè)色譜峰，w分別為2.63×106、9.33×105、5.37×105、2.57×103，根據(jù)峰面積計(jì)算其相對含量分別為5.68%、7.87%、17.05%、69.41%；酒燉地黃多糖w分布范圍為1.01×103～6.98×106，主要有3個(gè)色譜峰，w分別為3.50×106、6.46×105、2.51×103，相對含量分別為1.98%、50.99%、47.03%。

圖1 蒸制和酒燉地黃多糖的HPGPC圖

2.3.2 地黃多糖的單糖組成分析

（1）對照品溶液制備：取各單糖對照品適量，精密稱定，分別用超純水溶解并定容，制成甘露糖2.51 mg/mL、鼠李糖1.99 mg/mL、半乳糖醛酸2.52 mg/mL、葡萄糖2.33 mg/mL、半乳糖2.03 mg/mL、阿拉伯糖2.43 mg/mL的單一對照品溶液。精密吸取各單一對照品溶液100 μL，加入氨水溶液和0.5 mol/L PMP甲醇溶液各100 μL，混合，70 ℃反應(yīng)30 min。冷卻，加入100 μL冰醋酸中和溶液，再加入500 μL氯仿萃取3次，離心，上清液稀釋10倍，0.45 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣。

（2）供試品溶液制備：精密吸取“2.3.1（2）”項(xiàng)下蒸制/酒燉地黃多糖溶液各0.5 mL，精密加入3 mol/L三氟乙酸3 mL，封口，100 ℃水解3 h，冷卻，60 ℃水浴揮干，精密加入1 mL超純水復(fù)溶，即得蒸制/酒燉地黃多糖水解液。精密吸取多糖水解液100 μL，按上述衍生化方法處理后，即得蒸制/酒燉地黃多糖水解液衍生化樣品。衍生化樣品稀釋10倍，0.45 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣。

（3）色譜條件：按課題組已建立方法[10]進(jìn)行測定，色譜柱為Grace AlltimaTMC18柱（250 mm×7.8 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流動(dòng)相為乙腈-100 mmol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫：0～5 min，15%～20%乙腈；5～30 min，20%～28%乙腈；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長245 nm。

（4）地黃多糖的單糖組成分析結(jié)果：通過與單糖對照品色譜圖保留時(shí)間進(jìn)行比較（圖2），蒸制和酒燉地黃多糖均由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成。采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各單糖含量，并換算成相對物質(zhì)的量比分別為2.57∶0.05∶1.00∶0.87∶0.10和2.07∶0.07∶1.00∶1.05∶0.17，可見各單糖相對含量稍有差異。

2.3.3 地黃寡糖分析

（1）對照品溶液制備：取各寡糖及果糖對照品適量，精密稱定，分別用60%乙腈溶解并定容，制成甘露三糖1.0 mg/mL、蔗糖1.2 mg/mL、麥芽糖1.3 mg/mL、棉籽糖1.2 mg/mL、蜜二糖1.2 mg/mL、水蘇糖1.0 mg/mL、果糖1.4 mg/mL的單一對照品溶液。

A-單糖混合對照品 B-蒸制地黃多糖水解液 C-酒燉地黃多糖水解液 D-蒸制地黃游離單糖 E-酒燉地黃游離單糖 1-甘露糖 2-鼠李糖 3-半乳糖醛酸 4-葡萄糖 5-半乳糖 6-阿拉伯糖

（3）色譜條件：按課題組已建立方法[10]進(jìn)行測定，色譜柱為Alltima Amino柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相為乙腈-水（70∶30）；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；ELSD漂移管溫度100 ℃；N2體積流量3.2 L/min。

（4）地黃寡糖分析結(jié)果：蒸制與酒燉地黃均含有甘露三糖、蜜二糖和水蘇糖（圖3），采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各寡糖含量（表1），其中甘露三糖、蜜二糖含量無顯著性差異，但酒燉地黃中水蘇糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于蒸制地黃（＜0.01）。

2.3.4 地黃游離單糖分析 精密吸取“2.2”項(xiàng)下醇沉上清液100 μL，按“2.3.2（2）”項(xiàng)下方法衍生化制備供試品溶液，并采用“2.3.2”項(xiàng)下對照品溶液和分析方法進(jìn)行表征。其中果糖為酮糖，無法進(jìn)行PMP衍生化，采用“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒸制和酒燉地黃均含有葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、果糖和阿拉伯糖（圖2、3）。采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中游離單糖含量。由表2可見酒燉地黃中葡萄糖（＜0.01）、鼠李糖（＜0.05）和甘露糖（＜0.05）含量均顯著低于蒸制地黃，半乳糖含量則顯著高于蒸制地黃（＜0.01）。

A-寡糖及果糖混合對照品 B-蒸制地黃樣品 C-酒燉地黃樣品 1-果糖 2-蔗糖 3-麥芽糖 4-蜜二糖 5-棉籽糖 6-甘露三糖 7-水蘇糖

表1 蒸制和酒燉地黃中寡糖的含量(, n =3)

與蒸制地黃比較：**＜0.01

**< 0.01RRP-S

表2 蒸制和酒燉地黃中游離單糖的含量(, n = 3)

與蒸制地黃比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01RRP-S

2.4 地黃非糖小分子組分表征

2.4.1 對照品溶液制備 取梓醇、桃葉珊瑚苷、密力特苷、益母草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-HMF對照品適量，精密稱定，用50%甲醇溶解并定容，混合，再用倍半稀釋法制成含梓醇9.5 μg/mL、桃葉珊瑚苷10.0 μg/mL、密力特苷10.5 μg/mL、益母草苷10.6 μg/mL、毛蕊花糖苷10.4 μg/mL、異毛蕊花糖苷10.4 μg/mL、地黃苷D 11.6 μg/mL、5-HMF 11.8 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液制備 精密量取“2.2”項(xiàng)下上清液各5 mL，加甲醇，定容至10 mL，12 000 r/min離心（離心半徑6.5 cm）10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣。

2.4.3 UPLC-QTOF-MS/MS分析 參照課題組已建立的方法[10]，采用代謝組學(xué)策略對蒸制和酒燉地黃中的差異性非糖小分子進(jìn)行表征，采用選擇離子模式（SIM）方法對代表性成分進(jìn)行定量分析，其中5-HMF由于其弱離子化，采用UPLC-PDA檢測。

（1）色譜條件：Waters Acquity HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～2 min，2%～5% B；2～5 min，5%～12% B；5～10 min，12%～20% B；10～12 min，20%～30% B；12～13 min，30%～50% B；13～15 min，50%～100% B；15～16 min，100% B；體積流量0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。5-HMF檢測波長283 nm。

（2）質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源負(fù)離子模式下的MSEcentroid采集，低碰撞能量6 eV，高碰撞能量30～60 eV，毛細(xì)管電壓2.7 kV，錐孔電壓35 V，離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃，反向錐孔氣流50 L/h，脫溶劑氣600 L/h，質(zhì)量掃描范圍/100～1500，Q-TOF采集率0.2 s，以亮氨酸腦啡肽為校正液（[M?H]?/554.261 5）。

（3）定量方法學(xué)考察：將混合對照品溶液按照倍數(shù)稀釋法稀釋，得到12個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按上述條件分析，記錄峰面積，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比為3和10時(shí)各對照品的質(zhì)量濃度作為檢測限和定量限。取蒸制地黃上清液3份，每份樣品連續(xù)測定2次，連續(xù)3 d，各分析成分峰面積的RSD值用于評價(jià)日內(nèi)和日間精密度。取已測定指標(biāo)成分含量的蒸制地黃樣品，分別加入一定量的對照品溶液（相當(dāng)于原樣品中各指標(biāo)成分含量的50%、100%、150%），每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備3份用于加樣回收率測定。取精密度測試的樣品分別在2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，以各分析物峰面積的RSD值評價(jià)穩(wěn)定性。

2.4.4 數(shù)據(jù)采集與處理以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用 采用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行采集，使用Progenesis QI v2.3軟件（美國Waters公司）進(jìn)行峰提取、峰匹配及歸一化等處理，信息導(dǎo)入EZinfo 3.0軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0軟件，組間比較采用檢驗(yàn)，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.5 差異性成分篩選 PCA分析結(jié)果如圖4所示，模型的擬合效果和預(yù)測能力良好（2X0.986，2＝0.966），酒燉和蒸制地黃可明顯區(qū)分，表明其非糖小分子存在明顯差異。采用OPLS-DA進(jìn)行分析得S-plot圖（圖5），以＜0.05且VIP＞1篩選差異成分，并根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰、加和離子峰和特征碎片離子峰與對照品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對，共鑒定出29個(gè)差異成分，其中環(huán)烯醚萜苷類成分9個(gè)，苯乙醇苷類成分10個(gè)，呋喃醛衍生物1個(gè)（圖6和表3）。將鑒定出的差異成分的峰面積進(jìn)行min-max標(biāo)準(zhǔn)化處理，將歸一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果見圖7。

圖4 蒸制和酒燉地黃的負(fù)離子模式下PCA得分圖

2.4.6 代表性成分定量分析

（1）方法學(xué)驗(yàn)證：方法線性良好（＞0.990 0，表4），靈敏度高（檢測限＜0.084 μg/mL，定量限＜0.250 μg/mL），精密度良好（日內(nèi)精密度RSD≤5.44%，日間精密度RSD≤6.60%），準(zhǔn)確度較高（平均加樣回收率為84.20%～99.87%），穩(wěn)定性良好（RSD≤6.79%）（表4）。

（2）含量測定：對酒燉和蒸制地黃中主要差異性成分和某些活性成分進(jìn)行定量[18-19]，結(jié)果表明環(huán)烯醚萜苷類成分和呋喃醛衍生物在2種地黃中含量差異較大。酒燉地黃中梓醇含量為蒸制地黃的20.9倍，益母草苷含量為蒸制地黃的20.7倍，地黃苷D含量也較高（＜0.01），但密力特苷和5-HMF則較低（＜0.05，表5）。

圖5 蒸制和酒燉地黃在負(fù)離子模式下的S-plot圖

1-梓醇 3-地黃苷D 4-密力特苷 6-益母草苷 25-異毛蕊花糖苷 30-桃葉珊瑚苷 31-毛蕊花糖苷

表3 蒸制和酒燉地黃差異非糖小分子成分信息

3 討論

本研究通過整合基于LC-UV/ELSD/MS的糖組學(xué)和代謝組學(xué)方法，對蒸制和酒燉地黃的糖組分和非糖小分子組分進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)酒燉地黃多糖主要組分w較大（6.46×105左右），蒸制地黃多糖主要組分w較小（2.57×103左右）。與蒸制地黃相比，酒燉地黃中水蘇糖含量較高，而游離單糖含量較低。酒燉地黃中梓醇和益母草苷含量分別是蒸制地黃的20.9、20.7倍，而5-HMF含量則低17%?？梢?，酒燉和蒸制地黃的糖類組分和非糖小分子組分均存在顯著差異。

本實(shí)驗(yàn)及其他學(xué)者前期研究均發(fā)現(xiàn)，炮制過程中地黃的部分多糖發(fā)生水解反應(yīng)生成寡糖，水蘇糖等寡糖易分解產(chǎn)生甘露三糖和蜜二糖，而甘露三糖和蜜二糖會(huì)進(jìn)一步分解；梓醇和益母草苷等苷類成分易水解成相應(yīng)苷元；多糖、寡糖和苷類成分水解時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的還原糖，還原糖和氨基酸進(jìn)一步發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生5-HMF等呋喃醛衍生物[11-12]。蒸制和酒燉熟地黃的化學(xué)成分差異，其可能原因是炮制輔料黃酒的加入影響了某些水解酶的活性，從而影響了多糖、寡糖和苷類成分的降解速度。

圖7 蒸制和酒燉地黃差異成分的熱圖分析

梁代《本草經(jīng)集注》有“得清酒良”的記載[20]，認(rèn)為地黃加酒炮制后具有較好的療效。元代《湯液本草》記載地黃“熟則性寒而補(bǔ)腎”“假酒力則微溫，大補(bǔ)，血衰者須用之”[21]，指出了蒸制地黃和酒制地黃藥性和臨床作用的區(qū)別。本研究發(fā)現(xiàn)蒸制和酒燉熟地黃在大小分子組分上均存在顯著差異，這種差異是否顯著影響其藥效還需要更多的生物活性模型加以驗(yàn)證。

近期研究發(fā)現(xiàn)，水蘇糖作為一種功能性低聚糖，能夠通過促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌的增殖，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，發(fā)揮改善胃腸道功能、調(diào)節(jié)免疫和緩解炎癥等作用[22]；梓醇對血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和腎系膜細(xì)胞有保護(hù)作用，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、降糖和抗腫瘤等活性[23]；5-HMF具有抗氧化和抗炎活性[24]。上述幾種成分在蒸制和酒燉地黃中的含量有顯著差異，其與藥性、藥效的關(guān)聯(lián)性值得深入研究。

表4 UPLC-QTOF-MS/MS定量方法學(xué)驗(yàn)證

表5 蒸制和酒燉地黃中代表性非糖小分子成分的含量(, n = 3)

與蒸制地黃比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01RRP-S

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Integrating glycomics and metabolomics to compare chemical profiles of steaming and wine-stewing processed

ZHANG Xiao-ya1, 2, XU Jin-di2, XU Jun1, ZOU Ye-ting1, LONG Fang1, 3, LI Song-lin1, 2

1. Department of Pharmaceutical Analysis, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine to Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China 2. Department of Metabolomics, Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine and Jiangsu Branch of Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China 3. Department of Respiratory Medicine, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine to Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China

To compare the chemical profiles of Shudihuang (, RRP) processed by steaming (RRP-S) and wine-stewing (RRP-W) documented in China Pharmacopeia.HPLC-PDA, HPLC-ELSD and HPGPC-ELSD based glycomics and UPLC-QTOF-MS/MS based metabolomics were integrated to compare the glycome (polysaccharides, oligosaccharides and free monosaccharides) and metabolome (non-sugar small molecules) respectively in RRP-S and RRP-W.Compared with RRP-S, the molecular weight range of polysaccharides in RRP-W was broader, and the proportion of larger molecular weight polysaccharides was higher. Both the polysaccharides in RRP-S and RRP-W were composed of mannose, galacturonic acid, glucose, galactose and arabinose, but with different molar ratios (2.57:0.05:1.00:0.87:0.102.07:0.07:1.00:1.05:0.17). Oligosaccharides stachyose, manninotriose and melibiose were detectable in both RRP-S and RRP-W with the content of stachyose significantly higher in RRP-W than that in RRP-S (< 0.01). Free monosaccharides glucose, fructose, rhamnose, mannose, galactose and arabinose were detected in both RRP-S and RRP-W, with the contents of glucose (< 0.01), rhamnose (< 0.05) and mannose (< 0.05) significantly lower, whereas galactose higher (< 0.05) respectively, in RRP-W than that in RRP-S. A total of 29 non-sugar small molecules with significant abundance difference between RRP-W and RRP-S were identified or tentatively assigned, the chemical types of which belonged to iridoid glycosides, phenylethanoid glycosides and furfural derivative. The quantitative determination of the representative non-sugar small molecules showed that the contents of catalpol, leonuride and rehmannioside D were higher in RRP-W (< 0.01), whereas melittoside (< 0.05) and 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF,< 0.01) were lower in RRP-W, than that in RRP-S.There is significant difference in intrinsic quality between RRP-S and RRP-W, and whether the quality variations could obviously affect the bioactivities of RRP-S and RRP-W deserves further investigation.

; steaming; wine-stewing; glycomics; metabolomics; HPLC; HPGPC; UPLC-QTOF-MS/ MS; polysaccharide; oligosaccharides; free monosaccharide; mannose; galactouronic acid; glucose; galactose; arabinose; stachyose; mannotriose; melibiose; fructose; rhamnose; iridoid glycosides; phenylethanoid glycosides; furan aldehyde derivatives; catalpol; leonuride; rehmannioside D; melittoside; 5-hydroxymethylfurfural

R283.6

A

0253 - 2670(2021)06 - 1591 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.006

2020-10-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81872975）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81603262）；江蘇省中醫(yī)藥研究院自主科研項(xiàng)目（BM2018024-2019001）

張曉亞，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail: zxy11162020@163.com

李松林，研究員，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制和新產(chǎn)品研發(fā)。E-mail: songlinli64@126.com

龍 芳，副研究員，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究。E-mail: longfangcpu@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]