宋振碩,張 磊,王麗麗,林清霞,陳 林
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,福建 福州 350013)
添加一定比例的超微茶粉或茶提取物研制茶面包,是烘焙類茶食品領(lǐng)域產(chǎn)品開發(fā)與研究的重要內(nèi)容[1-4]。面包中添加超微茶粉或茶提取物,不僅可改變面包感官品質(zhì)和物理特性[5],還可以明顯提高全麥面包的抗氧化活性[6],另外有研究發(fā)現(xiàn),茶多酚作為添加劑具有降低面包中丙烯酰胺含量的作用[7],茶面包中兒茶素保留量與快速消化淀粉含量顯著負(fù)相關(guān),可以顯著降低面包的血糖潛力[8]。茶多酚作為天然抗氧化劑和主要功能成分,其含量高低可作為衡量茶食品質(zhì)量的重要指標(biāo)。面包中有關(guān)多酚類化合物研究的提取方法常用甲醇溶液提取[8,9],然而,甲醇作為提取溶劑存在較高的揮發(fā)性和毒性;多酚類化合物總量檢測(cè)方法多采用福林酚比色法[10,11],利用酚羥基被氧化生成藍(lán)色物質(zhì)進(jìn)行比色,是國(guó)際上植物中酚類化合物含量測(cè)定的常用方法,而面包基質(zhì)中存在一些其它酚類化合物等還原性物質(zhì),也會(huì)被氧化顯色而影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。
乙醇因具有安全低毒、價(jià)格低廉、來(lái)源豐富的特點(diǎn),在實(shí)際生產(chǎn)和科研中常被用來(lái)提取茶多酚或兒茶素[12,13]。兒茶素類化合物約占茶多酚總量的70%~80%,也是茶葉保健功能的首要成分,與香莢蘭素在強(qiáng)酸性條件下發(fā)生特異顯色反應(yīng)[13,14],可有效排除其他還原性物質(zhì)的影響,且顯色靈敏度高。
本試驗(yàn)以綠茶面包為例,使用95%乙醇浸提、硫酸-香莢蘭素比色法測(cè)定其中的兒茶素含量,優(yōu)化了提取參數(shù),并進(jìn)行了方法學(xué)考察,探討建立一種簡(jiǎn)便、安全、準(zhǔn)確的綠茶面包中兒茶素含量測(cè)定方法,對(duì)茶食品相關(guān)研究和產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)等具有重要意義。
綠茶面包:自制(以面粉量100%計(jì),綠茶粉添加量為3%)。兒茶素(含量≥98%):北京索萊寶科技有限公司;硫酸(含量95%~98%,分析純):北京化工廠;95%乙醇(含量≥95%,分析純)、無(wú)水乙醇(含量≥99.7%,分析純)、香蘭素(含量≥99.5%,分析純):國(guó)藥集團(tuán)上海試劑有限公司。
PL602-L電子天平:美國(guó)梅特勒-托利多集團(tuán);HWS-28型電熱恒溫水浴鍋:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Centrifuge 5430R臺(tái)式離心機(jī):德國(guó)Eppendorf;DL-1020低溫循環(huán)泵:蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司;Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀:美國(guó)Thermo Scientific。
1.3.1 綠茶面包中兒茶素提取條件優(yōu)化 提取條件優(yōu)化:按一定的料液比(g·mL-1)加入待測(cè)樣品和95%乙醇至離心管中,提取一定時(shí)間后,4000 r·min-1離心10 min,收集上清液定容,硫酸-香莢蘭素比色法測(cè)定兒茶素含量。以料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間作3因素3水平正交優(yōu)化試驗(yàn)(具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示),以吸光度/料液比為評(píng)價(jià)指標(biāo)獲得最優(yōu)提取方法。
硫酸-香莢蘭素比色法:吸取0.5 mL樣品溶液,加入2.5 mL l%的香莢蘭素/乙醇溶液和2.5 mL 30%的硫酸/乙醇溶液,搖勻,20℃反應(yīng)10 min后,采用酶標(biāo)儀在500 nm處測(cè)定吸光度。
1.3.2 綠茶面包中兒茶素總量測(cè)定方法學(xué)考察
1.3.2.1 兒茶素標(biāo)曲的制作 分別取0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.3 mg·mL-1的兒茶素標(biāo)液0.5 mL于試管中,依次加入2.5 mL l%的香莢蘭素/乙醇溶液和2.5 mL 30%的硫酸/乙醇溶液,搖勻,20℃反應(yīng)10 min后,采用酶標(biāo)儀在500 nm處測(cè)定反應(yīng)液吸光度值。
1.3.2.2 重復(fù)性 準(zhǔn)確稱取6份樣品,按照確定的浸提方法和反應(yīng)體系,測(cè)定反應(yīng)液的吸光度,考察測(cè)定方法的重復(fù)性。
1.3.2.3 穩(wěn)定性 按上述反應(yīng)體系,分別測(cè)定95%乙醇、0.3 mg·mL-1的標(biāo)液、樣品浸提液在顯色反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min后的吸光度,考察反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。
1.3.2.4 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確稱取6份兒茶素濃度已知的樣品,分別加入兒茶素標(biāo)品0.2、0.3、0.4 mg,按照確定的浸提方法和反應(yīng)體系,測(cè)定反應(yīng)液的吸光度,并計(jì)算兒茶素的回收率。
1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用 Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制,使用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2及方差分析可知,不同試驗(yàn)組合間試驗(yàn)結(jié)果差異顯著(p<0.05),最佳的試驗(yàn)組合為A1B3C3:料液比1:20(g·mL-1)、浸提溫度70℃、浸提時(shí)間45 min,浸提效果顯著好于其它組合,浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(p<0.05),料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著(p>0.05)。
2.2.1 線性范圍 按1.3.2.1方法繪制吸光度值與兒茶素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1),從圖1可知,兒茶素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=3.0732C-0.0265(R2=0.9996)??梢?,兒茶素在0.025~0.3 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),吸光度與兒茶素濃度的線性關(guān)系良好。
圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of catechins
2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 同一實(shí)驗(yàn)樣品重復(fù)測(cè)定6次,試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知,兒茶素的平均含量為2.20 mg·g-1,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.31%,表明該方法重復(fù)性較好。
表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability of proposed methodology
2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別測(cè)定空白(95%乙醇)、0.3 mg·mL-1的兒茶素標(biāo)液與試驗(yàn)樣品隨時(shí)間變化的吸光度穩(wěn)定性,試驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出,空白在10~60 min內(nèi)吸光度變化不顯著,基線較平,0.3 mg·mL-1的兒茶素標(biāo)液在10~30 min內(nèi)吸光度變化不顯著,40 min后吸光度變化顯著,實(shí)驗(yàn)樣品在10~50 min內(nèi)吸光度變化不顯著,60 min后吸光度變化顯著,說(shuō)明在兒茶素高濃度的情況下,顯色反應(yīng)產(chǎn)物更加不穩(wěn)定。因此,為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性,顯色反應(yīng)后需在10~30 min內(nèi)測(cè)定完成。
圖2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Stability of proposed methodology注:小寫字母的不同表示其差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。
2.2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 高、中、低不同濃度的兒茶素加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知,加標(biāo)回收率范圍在98.75%~103.25%,可以滿足綠茶面包中兒茶素含量測(cè)定的需要。
表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recovery rate on catechins of proposed methodology
試驗(yàn)選擇95%乙醇作為提取溶劑,考察優(yōu)化了提取參數(shù),應(yīng)用硫酸-香莢蘭素比色法檢測(cè)綠茶面包中兒茶素總量,并進(jìn)行了方法學(xué)考察。在正交試驗(yàn)各因素水平范圍內(nèi),最佳的浸提組合選擇為料液比1∶20 (g·mL-1)、浸提溫度70℃、浸提時(shí)間45 min。應(yīng)用硫酸-香莢蘭素比色法檢測(cè)綠茶面包中兒茶素總量,反應(yīng)液在20℃條件下、反應(yīng)時(shí)間在10~30 min范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果較準(zhǔn)確,兒茶素濃度在0.025~0.3 mg·mL-1范圍內(nèi),吸光度與濃度線性關(guān)系良好(R2=0.9996),同一樣品重復(fù)測(cè)定6次的RSD為1.31%,兒茶素的高、中、低濃度加標(biāo)回收率范圍為98.75%~103.25%。本方法操作簡(jiǎn)便、安全,并具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,可滿足綠茶面包中兒茶素總量的檢測(cè)分析。