宋振碩，張 磊，王麗麗，林清霞，陳 林

(福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福州 350013)

添加一定比例的超微茶粉或茶提取物研制茶面包，是烘焙類茶食品領(lǐng)域產(chǎn)品開發(fā)與研究的重要內(nèi)容[1-4]。面包中添加超微茶粉或茶提取物，不僅可改變面包感官品質(zhì)和物理特性[5]，還可以明顯提高全麥面包的抗氧化活性[6]，另外有研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚作為添加劑具有降低面包中丙烯酰胺含量的作用[7]，茶面包中兒茶素保留量與快速消化淀粉含量顯著負相關(guān)，可以顯著降低面包的血糖潛力[8]。茶多酚作為天然抗氧化劑和主要功能成分，其含量高低可作為衡量茶食品質(zhì)量的重要指標。面包中有關(guān)多酚類化合物研究的提取方法常用甲醇溶液提取[8,9]，然而，甲醇作為提取溶劑存在較高的揮發(fā)性和毒性；多酚類化合物總量檢測方法多采用福林酚比色法[10,11]，利用酚羥基被氧化生成藍色物質(zhì)進行比色，是國際上植物中酚類化合物含量測定的常用方法，而面包基質(zhì)中存在一些其它酚類化合物等還原性物質(zhì)，也會被氧化顯色而影響測定的準確性。

乙醇因具有安全低毒、價格低廉、來源豐富的特點，在實際生產(chǎn)和科研中常被用來提取茶多酚或兒茶素[12,13]。兒茶素類化合物約占茶多酚總量的70%～80%，也是茶葉保健功能的首要成分，與香莢蘭素在強酸性條件下發(fā)生特異顯色反應(yīng)[13,14]，可有效排除其他還原性物質(zhì)的影響，且顯色靈敏度高。

本試驗以綠茶面包為例，使用95%乙醇浸提、硫酸-香莢蘭素比色法測定其中的兒茶素含量，優(yōu)化了提取參數(shù)，并進行了方法學考察，探討建立一種簡便、安全、準確的綠茶面包中兒茶素含量測定方法，對茶食品相關(guān)研究和產(chǎn)品質(zhì)量檢驗等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠茶面包：自制(以面粉量100%計，綠茶粉添加量為3%)。兒茶素(含量≥98%)：北京索萊寶科技有限公司；硫酸(含量95%～98%，分析純)：北京化工廠；95%乙醇(含量≥95%，分析純)、無水乙醇(含量≥99.7%，分析純)、香蘭素(含量≥99.5%，分析純)：國藥集團上海試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

PL602-L電子天平：美國梅特勒-托利多集團；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；Centrifuge 5430R臺式離心機：德國Eppendorf；DL-1020低溫循環(huán)泵：蘇州威爾實驗用品有限公司；Varioskan LUX多功能酶標儀：美國Thermo Scientific。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠茶面包中兒茶素提取條件優(yōu)化 提取條件優(yōu)化：按一定的料液比(g·mL-1)加入待測樣品和95%乙醇至離心管中，提取一定時間后，4000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容，硫酸-香莢蘭素比色法測定兒茶素含量。以料液比、浸提溫度、浸提時間作3因素3水平正交優(yōu)化試驗(具體試驗設(shè)計如表1所示)，以吸光度/料液比為評價指標獲得最優(yōu)提取方法。

硫酸-香莢蘭素比色法：吸取0.5 mL樣品溶液，加入2.5 mL l%的香莢蘭素/乙醇溶液和2.5 mL 30%的硫酸/乙醇溶液，搖勻，20℃反應(yīng)10 min后，采用酶標儀在500 nm處測定吸光度。

1.3.2 綠茶面包中兒茶素總量測定方法學考察

1.3.2.1 兒茶素標曲的制作 分別取0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.3 mg·mL-1的兒茶素標液0.5 mL于試管中，依次加入2.5 mL l%的香莢蘭素/乙醇溶液和2.5 mL 30%的硫酸/乙醇溶液，搖勻，20℃反應(yīng)10 min后，采用酶標儀在500 nm處測定反應(yīng)液吸光度值。

1.3.2.2 重復(fù)性 準確稱取6份樣品，按照確定的浸提方法和反應(yīng)體系，測定反應(yīng)液的吸光度，考察測定方法的重復(fù)性。

1.3.2.3 穩(wěn)定性 按上述反應(yīng)體系，分別測定95%乙醇、0.3 mg·mL-1的標液、樣品浸提液在顯色反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min后的吸光度，考察反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

1.3.2.4 加標回收率 準確稱取6份兒茶素濃度已知的樣品，分別加入兒茶素標品0.2、0.3、0.4 mg，按照確定的浸提方法和反應(yīng)體系，測定反應(yīng)液的吸光度，并計算兒茶素的回收率。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用 Excel 2016 進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，使用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 L9(34)正交試驗結(jié)果

L9(34)正交試驗結(jié)果見表2。從表2及方差分析可知，不同試驗組合間試驗結(jié)果差異顯著(p<0.05)，最佳的試驗組合為A1B3C3：料液比1:20(g·mL-1)、浸提溫度70℃、浸提時間45 min，浸提效果顯著好于其它組合，浸提溫度和浸提時間對試驗結(jié)果有顯著影響(p<0.05)，料液比對試驗結(jié)果的影響不顯著(p>0.05)。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍 按1.3.2.1方法繪制吸光度值與兒茶素濃度的標準曲線(見圖1)，從圖1可知，兒茶素濃度的標準曲線為A=3.0732C-0.0265(R2=0.9996)?？梢姡瑑翰杷卦?.025～0.3 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，吸光度與兒茶素濃度的線性關(guān)系良好。

圖1 兒茶素標準曲線Fig.1 Standard curve of catechins

2.2.2 重復(fù)性試驗 同一實驗樣品重復(fù)測定6次，試驗結(jié)果見表3。由表3可知，兒茶素的平均含量為2.20 mg·g-1，相對標準偏差為1.31%，表明該方法重復(fù)性較好。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Repeatability of proposed methodology

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 分別測定空白(95%乙醇)、0.3 mg·mL-1的兒茶素標液與試驗樣品隨時間變化的吸光度穩(wěn)定性，試驗結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，空白在10～60 min內(nèi)吸光度變化不顯著，基線較平，0.3 mg·mL-1的兒茶素標液在10～30 min內(nèi)吸光度變化不顯著，40 min后吸光度變化顯著，實驗樣品在10～50 min內(nèi)吸光度變化不顯著，60 min后吸光度變化顯著，說明在兒茶素高濃度的情況下，顯色反應(yīng)產(chǎn)物更加不穩(wěn)定。因此，為保證測定結(jié)果的準確性，顯色反應(yīng)后需在10～30 min內(nèi)測定完成。

圖2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Fig.2 Stability of proposed methodology注：小寫字母的不同表示其差異達到顯著水平(P<0.05)。

2.2.4 加標回收率試驗 高、中、低不同濃度的兒茶素加標回收率試驗結(jié)果見表4。由表4可知，加標回收率范圍在98.75%～103.25%，可以滿足綠茶面包中兒茶素含量測定的需要。

表4 回收率試驗結(jié)果Table 4 Recovery rate on catechins of proposed methodology

3 結(jié)論

試驗選擇95%乙醇作為提取溶劑，考察優(yōu)化了提取參數(shù)，應(yīng)用硫酸-香莢蘭素比色法檢測綠茶面包中兒茶素總量，并進行了方法學考察。在正交試驗各因素水平范圍內(nèi)，最佳的浸提組合選擇為料液比1∶20 (g·mL-1)、浸提溫度70℃、浸提時間45 min。應(yīng)用硫酸-香莢蘭素比色法檢測綠茶面包中兒茶素總量，反應(yīng)液在20℃條件下、反應(yīng)時間在10～30 min范圍內(nèi)檢測結(jié)果較準確，兒茶素濃度在0.025～0.3 mg·mL-1范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關(guān)系良好(R2=0.9996)，同一樣品重復(fù)測定6次的RSD為1.31%，兒茶素的高、中、低濃度加標回收率范圍為98.75%～103.25%。本方法操作簡便、安全，并具有較高的靈敏度、準確性和穩(wěn)定性，可滿足綠茶面包中兒茶素總量的檢測分析。