張帆，李澤東，彭禹，陳勝，周鈞

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科，湖南 長沙 410011；2.湖南省湘西自治州人民醫(yī)院 普外一科，湖南 吉首416000）

胰腺癌是第七常見的惡性腫瘤，在中國，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第六位因素[1]。其5年生存率僅有5%～10%，在確診胰腺癌后，患者的中位生存時間約為5～6個月[2-3]。實際上，絕大多數(shù)胰腺癌患者都出現(xiàn)了局部進展，甚至是遠處轉(zhuǎn)移（80%～85%），只有極少數(shù)患者是可以手術(shù)切除的（15%～20%）[4-5]。胰腺癌的不良預(yù)后原因眾多，例如，系統(tǒng)免疫炎癥指數(shù)可能是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素[6]，早期階段的檢測率低，具有遠處轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險，以及化療的效果較差等[7]，手術(shù)僅在診斷為早期胰腺癌的15%～20%的患者中被認為是可行的[8]，由于胰腺癌患者往往到了晚期，才開始出現(xiàn)少量癥狀，因而，開發(fā)能夠早期診斷胰腺癌的工具是有重大意義的[9]。血清碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是目前用作評估胰腺癌臨床治療療效的標(biāo)志物，盡管它低靈敏度和低特異性，但它仍然是胰腺癌中唯一獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的標(biāo)志物，其他抗原（例如CEA和CA125）作為早期標(biāo)記完全無效，但一些腫瘤學(xué)家仍將其用作治療反應(yīng)性的標(biāo)記[10]。因此，尋找更為有效的胰腺癌診斷分子標(biāo)志物，依舊是個值得深入探討的課題。

microRNA（miRNA）是長度約為18～25個核苷酸的非編碼RNA，發(fā)揮著調(diào)控基因表達和RNA沉默中的功能。異常的miRNA在多種腫瘤及良性疾病中被發(fā)現(xiàn)，并且發(fā)揮著重要的作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA可以在血漿、血清等體液中穩(wěn)定存在，這也使得研究循環(huán)miRNA以檢測疾病的進展成為可能[12-13]。由于miRNA可以在體液（例如血清或血漿）中檢測到，因此它們已成為潛在的有用的生物標(biāo)志物，用于風(fēng)險評估，診斷和預(yù)后[14]。例如，Martínez-Hernández等[15]的研究發(fā)現(xiàn)血清miR-19b和miR-26b可能用于預(yù)測免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病的發(fā)生，Huang等[16]發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的miR-487a，miR-493-5p，miR-501-3p和miR-502-5p是骨肉瘤的新型潛在診斷生物標(biāo)志物?？梢姡錷iRNA作為預(yù)測疾病的生物標(biāo)志物的巨大潛力。

決策樹是一種用于判別分析的監(jiān)督式機器學(xué)習(xí)算法，它易于理解和解釋。它允許通過以分層樹或規(guī)則集的形式生成可理解的知識結(jié)構(gòu)并以圖形直觀的方式呈現(xiàn)它們，從而從數(shù)據(jù)中提取知識[17]。決策樹也已用于鑒定癌癥中的生物標(biāo)志物，例如，利用miRNA表達數(shù)據(jù)進行肺癌診斷和亞型分型[18]，使用核受體表達定義一組肺癌的預(yù)后生物標(biāo)志物[19]等。本研究旨在通過分析GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中血清miRNA的測序數(shù)據(jù)，將決策樹的方法應(yīng)用于胰腺癌的預(yù)測中，確定胰腺癌的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

這項研究中我們比較了來自GEO數(shù)據(jù)庫的胰腺癌患者和健康對照人群的血清miRNA表達譜。其中納入研究的數(shù)據(jù)集包括：GSE113486，包含40例胰腺癌患者血清miRNA樣本，和100例非腫瘤對照樣本；GSE85589包含19例健康對照和88例胰腺癌患者血清樣本。GEOquery R包用于下載臨床信息及表達譜。

1.2 去除批次效應(yīng)

由于本研究下載的表達譜數(shù)據(jù)是經(jīng)過預(yù)先處理及標(biāo)準(zhǔn)化的，這里無需進一步處理，但由于GSE113486及GSE85589非同批次測序結(jié)果，這里需要進一步去除批次效應(yīng)，以利進一步研究。批次效應(yīng)是指表示測序樣本在不同的批次處理和測量時引入的與生物狀態(tài)不相關(guān)的系統(tǒng)性的技術(shù)偏差。本研究采用sva R包的ComBat函數(shù)移除批次效應(yīng)，并使用主成分分析（principal component analysis，PCA）評估批次效應(yīng)移除前后的差異。

1.3 關(guān)鍵miRNA 的初步篩選

LASSO（least absolute shrinkage and selection operator）回歸是擬合高維廣義線性模型的一種流行的變量選擇方法，通過構(gòu)造懲罰函數(shù)以減少變量數(shù)并有效避免過度擬合，可以得到更精細的模型。為了篩選出用于鑒別腫瘤與非腫瘤樣本的關(guān)鍵miRNA，本研究通過R軟件中的glmnet軟件包，使用LASSO回歸分析篩選重要的miRNA。

1.4 決策樹的構(gòu)建及評價

R語言中的set.seed函數(shù)及sample函數(shù)可用于生成隨機數(shù)并用于隨機抽樣分組，本研究基于以上兩個函數(shù)，通過隨機抽樣，將247例樣本，隨機分為訓(xùn)練集（60%）和測試集（40%），LASSO回歸分析篩選的關(guān)鍵miRNA用于訓(xùn)練集中決策樹的構(gòu)建。本研究使用rpart R包實現(xiàn)決策樹算法，rpart函數(shù)用于決策樹的生成，選擇交叉驗證誤差最小的樹即最優(yōu)的樹。predict函數(shù)用于測試集中觀測點的分類，使用ROC曲線分析評價決策樹的預(yù)測效果，InformationValue R包的plotROC函數(shù)用于ROC曲線繪制。

1.5 關(guān)鍵miRNA 的組間差異

為了對比正常血清樣本和胰腺癌血清樣本中關(guān)鍵miRNA的表達差異，本研究利用Wilcoxon檢驗對比了關(guān)鍵miRNA分別在GSE113486 及GSE85589數(shù)據(jù)集中正常與腫瘤樣本的表達差異，以及在全部樣本中正常與腫瘤樣本的表達差異。

1.6 關(guān)鍵miRNA 的功能注釋

為進一步了解關(guān)鍵miRNA所涉及的功能，本研究利用miRDB、miRTarBsae及TargetScan3種數(shù)據(jù)庫，預(yù)測miRNA的靶向mRNA。其中，在3 種數(shù)據(jù)庫中均有預(yù)測到的靶向mRNA將被用于富集分析，注釋關(guān)鍵miRNA可能涉及的功能，clusterProfiler R包用于富集分析（enrichment analysis）[20]。

2 結(jié)果

2.1 去除批次效應(yīng)

去除批次效應(yīng)前，首先利用主成分分析評估兩數(shù)據(jù)集之前的批次效應(yīng)，分析結(jié)果如圖1 A所示，兩數(shù)據(jù)集呈現(xiàn)分別聚類，差異明顯。經(jīng)過ComBat函數(shù)移除批次效應(yīng)后的主成分分析結(jié)果如圖1B，兩數(shù)據(jù)集之間表達量沒有出現(xiàn)分別聚類。

圖1 PCA 圖 A：批次效應(yīng)校正前PCA；B：批次效應(yīng)校正后PCAFigure 1 PCA plots A:PCA before batch effect adjustment;B:PCA after batch effect adjustment

2.2 關(guān)鍵miRNA 的篩選

去除批次效應(yīng)后，納入研究的有247例樣本（119例健康對照和128例胰腺癌），共2526個miRNA。對2526個miRNA進行LASSO回歸分析，采用10倍交叉驗證，結(jié)果顯示最佳的λ=0.0272212（圖2），其對應(yīng)變量為33，即33個miRNA具有鑒別腫瘤樣本及正常樣本的潛力。

圖2 關(guān)鍵miRNA 的篩選 A：LASSO 篩選變量動態(tài)過程圖；B：交叉驗證參數(shù)λ 的選擇過程圖Figure 2 Screening process of the hub miRNAs A:Dynamic process variable screening by LASSO;B:Dynamic process of selection of cross validation parameter λ

2.3 決策樹的構(gòu)建及評價

為了通過血清miRNA中關(guān)鍵miRNA表達區(qū)分腫瘤與正?；颊撸狙芯考{入LASSO回歸篩選出的33個關(guān)鍵miRNA，構(gòu)建決策樹并驗證決策樹的預(yù)測效果。研究中將247例樣本按6:4的比例進行隨機分組，分為訓(xùn)練集（71例正常，77例腫瘤）和測試集（48例正常，51例腫瘤）。將rpart算法應(yīng)用于訓(xùn)練集，獲得了一個簡單的決策樹模型，模型包含兩個miRNA，分別是miR-4532和miR-4668-5p（圖3）。

圖3 決策樹模型Figure 3 The decision tree model

使用測試數(shù)據(jù)集（占總數(shù)據(jù)的40%）來測量分類樹的性能。然后通過曲線下的面積來評價該分類器的判別力。結(jié)果如圖4，在訓(xùn)練集中ROC曲線下面積（AUC）為0.9481，測試集中AUC為0.9024。即由miR-4532和miR-4668-5p構(gòu)成的決策樹在訓(xùn)練集及測試集中均表現(xiàn)出良好的區(qū)分腫瘤與正常樣本的能力。

2.4 關(guān)鍵miRNA 的組間差異

通過W i l c o x o n 檢驗對比了關(guān)鍵miRNA在胰腺癌血清樣本和正常血清樣本中的差異，結(jié)果表明，兩組樣本差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）（圖5）。

圖5 關(guān)鍵miRNA 胰腺癌血清樣本和正常血清樣本中差異Figure 5 Differences of the hub miRNAs in pancreatic and normal serum samples

2.5 富集分析

利用3 種數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測m i R-4532 和miR-4668-5p的靶向mRNA，結(jié)果顯示，miR-4532在3種數(shù)據(jù)庫中均預(yù)測到的mRNA有6個，miR-4668-5p在3種數(shù)據(jù)庫中均預(yù)測到的mRNA有73個。利用clusterProfiler R包進行GO（Gene Ontology）富集分析，及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集。GO富集主要包括細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）。結(jié)果如圖6所示，關(guān)鍵miRNA的靶基因可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物，核染色質(zhì)，轉(zhuǎn)錄阻遏物復(fù)合體，巨核細胞分化的調(diào)控，黏著劑組裝，細胞-底物連接組織，巨核細胞分化，黏著斑組裝的負調(diào)節(jié)等功能有關(guān)。其KEGG結(jié)果表明，關(guān)鍵miRNA的靶基因主要富集于癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)，F(xiàn)oxO信號通路，黏附連接，胰腺癌，乙型肝炎，肝細胞癌，TGF-β信號通路，MAPK信號通路等信號通路中。

圖6 GO 及KEGG 分析Figure 6 GO and KEGG enrichment analysis

3 討論

miRNA參與了發(fā)育和各種生理過程，其失調(diào)可能會導(dǎo)致多種疾病的進展[21]。有研究表明，miRNA可以反映病理過程，因而被認為可以用于診斷及鑒別不同的腫瘤類型，甚至是良性疾病的識別。例如，血清miRNA對用于高度準(zhǔn)確和特異性地篩查肉瘤[22]，Zou等[23]研究發(fā)現(xiàn)5 種血清miRNA可用作為鼻咽癌的潛在生物標(biāo)志物，Zarecki等[24]發(fā)現(xiàn)血清miRNA作為骨質(zhì)疏松性椎體骨折的新型生物標(biāo)志物等。

使用來自健康個體，胰腺癌和胰腺炎患者的胰腺組織的活檢樣品進行的比較miRNA表達譜差異的研究，清楚地表明了與正常細胞相比，各種miRNA在癌細胞中的差異表達，預(yù)示了miRNA在胰腺癌診斷，預(yù)后和抗癌治療中的潛在作用[25]。Hong等[26]研究發(fā)現(xiàn)與鄰近的正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中共發(fā)現(xiàn)了158個miRNA差異表達，例如miR-200，miR-96和miR-217。在胰腺癌患者中，除了胰腺細胞和組織中miRNA的異常表達外，在全身循環(huán)中也觀察到miRNA失調(diào)。例如，一些研究報告了miR-18a，miR-21，miR-22，miR-24，miR-25，miR-99a，miR-155，miR-185，miR-191，miR-196a在胰腺癌血液中的差異表達[27]，miR-486-5p通過作用于體內(nèi)多種信號通路參與胰腺腺癌的發(fā)生發(fā)展[28]，胰腺癌細胞中miR-519d減低，且對于胰腺癌細胞增殖和侵襲能力有所增強[29]。

在本研究中，通過LASSO回歸發(fā)現(xiàn)了33個具有鑒定胰腺癌腫瘤潛力的血清miRNA，并通過機器學(xué)習(xí)的方法構(gòu)建了決策樹，用于區(qū)分胰腺癌腫瘤患者和正常對照，其中miR-4532和miR-4668-5p這兩個血清miRNA被認為是有效觀測點。同樣的，在本研究的訓(xùn)練集和測試集中，該決策樹表現(xiàn)出了良好的預(yù)測效果，即AUC值分別為0.9481和0.9024，miR-4532和miR-4668-5p在腫瘤和正常樣本中也表現(xiàn)出了明顯差異，即腫瘤樣本血清中表達相對較高。實際上，已經(jīng)有研究表明hsamiR-4532在腫瘤中發(fā)揮重要作用，hsa-miR-4532下調(diào)癌癥中的高甲基化可能促進乳腺癌細胞中的阿霉素抗性[30]，攜帶hsa-miR-4532的急性髓樣白血病細胞衍生的外泌體可以通過激活LDOC1依賴性STAT3信號通路抑制正常的造血干細胞的造血作用等[31]。也有研究表明miR-4668-3p參與結(jié)直腸癌的細胞增殖，遷移，侵襲和上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[32]，miR-4668-5p在預(yù)測舒尼替尼治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌反應(yīng)方面具有預(yù)測潛力[33]。

決策樹在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已經(jīng)頗為廣泛，例如，用于肝癌肝切除手術(shù)方式選擇的決策樹[34]，基于MRI的決策樹用于黃疸型嬰兒的膽道閉鎖診斷中[35]。隨著基因組學(xué)的發(fā)展和二代測序的成本降低，越來越多的測序可供我們進一步研究，將基因組學(xué)數(shù)據(jù)和決策樹結(jié)合起來，將是一個很好的思路，用于癌癥研究。Sherafatian等[18]基于數(shù)據(jù)庫中miRNA表達數(shù)據(jù)構(gòu)建決策樹進行肺癌診斷和亞型分型。本研究發(fā)現(xiàn)miR-4532和miR-4668-5p在胰腺癌患者的血清中相對表達較高，并通過構(gòu)建決策樹，用于區(qū)分正常血清樣本和胰腺癌患者血清樣本。這將有益于胰腺癌患者的早期診斷，甚至有可能通過進一步研究，取代傳統(tǒng)的診斷方法，為胰腺癌的診斷提供一個簡單準(zhǔn)確的策略。同時，miR-4532和miR-4668-5p的預(yù)測作用也顯示出了其在胰腺癌進程中的重要作用，有可能作為潛在的治療靶點，值得進一步研究。