劉繼升，劉河，劉浩，YU Xing，李浩

（1.湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院 肝膽外科，湖南 長沙 410005；2.浙江省溫州市中心醫(yī)院/上海大學(xué)附屬第二醫(yī)院 大腸外科，浙江 溫州 325000；3.湖南師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410005）

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）起源于肝內(nèi)二級分支以下的膽管上皮細(xì)胞，約占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的10%～15%，僅次于肝細(xì)胞癌，且發(fā)病率逐年升高[1-2]。目前ICC的治療主要依賴手術(shù)切除，但由于高度惡性的生物學(xué)行為，導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高，患者5年生存率僅為 15%～20%[3-5]。因此，研究ICC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制意義重大。

抑癌基因HIV-1 Tat相互作用蛋白2（HIV-1 Tat interactive protein 2，TIP30）是首個利用RNA差異表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[6]，其表達(dá)下調(diào)或缺失被發(fā)現(xiàn)與胃癌、肝癌、膽囊癌、結(jié)直腸癌和肺癌等多種惡性腫瘤有關(guān)[7-12]，但在ICC中未見明確報道。既往研究表明TIP30基因的作用受微小RNA（microRNA，miRNA）的調(diào)節(jié)，如血管平滑肌細(xì)胞高表達(dá)miR-10b可誘導(dǎo)TIP30表達(dá)水平下調(diào)，并啟動脯氨酸蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]；Ouyang等[14]也報道了miR-10b可抑制TIP30基因表達(dá)并促進(jìn)表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）的作用來增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲。本研究旨在探索TIP30在ICC中的表達(dá)及相關(guān)臨床意義，并探究在ICC中可能調(diào)控TIP30表達(dá)水平的miRNA，為ICC的診斷、治療及預(yù)后評估提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集我院2013年1月—2014年12月期間手術(shù)切除的51例ICC患者的癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm）。所收集病例均有詳細(xì)且完整的臨床病例資料；術(shù)前未行放化療等相關(guān)抗腫瘤治療；行手術(shù)切除，且切緣為陰性；經(jīng)病理確診為ICC；為首次確診且未合并其他腫瘤。術(shù)后通過門診或電話隨訪。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并取得每位患者或家屬的知情同意。

利用生物信息學(xué)方法，篩選TCGA（https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga）和SEER（https://seer.cancer.gov）數(shù)據(jù)庫中具有TIP30表達(dá)資料及隨訪資料的ICC病例，剔除其中臨床隨訪數(shù)據(jù)缺失或不全、年齡＞80歲或＜18歲、行放化療、合并其他腫瘤及非主動隨訪的患者，共納入94例患者，其中53例行根治性手術(shù)切除。所有患者均納入預(yù)后分析。

1.2 主要材料

人ICC系（ICC-9810、SSP-25和HuH-28）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。兔抗人TIP30抗體購自北京天根生物技術(shù)有限公司。羊抗兔第二抗體購自北京百奧萊博科技有限公司。免疫組化試劑購自北京中杉金橋公司。改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle's medium，DMEM）、胎牛血清、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司。Lipofectamine2000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。

1.3 免疫組化檢測

組織標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、切片后行免疫組化。免疫組化實驗步驟按試劑盒說明書步驟進(jìn)行。組織石蠟切片于67 ℃烘片2 h，經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟至水?？乖迯?fù)方法采用檸檬酸鹽緩沖液微波煮沸修復(fù)，自然冷卻后加入阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3次。3%牛血清蛋白封閉1 h 后直接滴加一抗稀釋液（1:100），4 ℃孵育過夜，漂洗3次。37 ℃孵育二抗1 h，PBS清洗3次。二氨基聯(lián)苯胺試劑染色。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比及染色深淺分級，表達(dá)強(qiáng)度用組織學(xué)評分（∑pi）表示：p代表陽性細(xì)胞百分率，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜10%為0，10%～30%細(xì)胞染色為1，30%～60%細(xì)胞染色為2，＞60%細(xì)胞染色為3；i代表染色深淺或染色強(qiáng)度，不染色或染色不清為0，淺黃色為1，棕黃色為2，深褐色為3。將所有ICC組織標(biāo)本按評分高低分為高表達(dá)組及低表達(dá)組，評分總和≤3分為低表達(dá)組，＞3分為高表達(dá)組。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人ICC細(xì)胞（ICC-9810、SSP-25和HuH-28）于含10%小牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞（ICC-9810、SSP-25和HuH-28）分別接種于六孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上，根據(jù)Lipofectamine 2000說明書分別轉(zhuǎn)染TIP30-shRNA及陰性對照、miR-124-3p模擬物及陰性對照序列。培養(yǎng)4 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h以備后續(xù)實驗。

1.5 軟瓊脂克隆形成實驗

取對數(shù)生長期TIP30-shRNA轉(zhuǎn)染后的ICC細(xì)胞（ICC-9810、SSP-25和HuH-28）及其陰性對照組細(xì)胞，以每組103個細(xì)胞接種至頂層含0.3%、底層含0.6%瓊脂糖的軟瓊脂上，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，收集各組細(xì)胞，于顯微鏡下觀察，統(tǒng)計克隆形成數(shù)?？寺⌒纬陕?（形成的克隆數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.6 調(diào)控TIP30 表達(dá)的miRNA 預(yù)測

從美國國家生物信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫檢索到人類TIP30 的Gene ID 為“10553”。在miRBD數(shù)據(jù)庫（http://www.mirdb.org）中，選定檢索類型為“Search by gene target”，輸入TIP30的Gene ID，得到相關(guān)檢索結(jié)果。在Ensembl 75數(shù)據(jù)庫（http://feb2014.archive.ensembl.org/index.html）中，查詢到TIP30的Ensembl ID為“ENSG00000109854”，在TargetScan（http://www.targetscan.org）數(shù)據(jù)庫中利用該Ensembl ID檢索到多個轉(zhuǎn)錄本，選取最具代表性的一個，得到檢索結(jié)果。根據(jù)兩數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果，取二者交集，選定目標(biāo)miRNA。

1.7 qRT-PCR 檢測

使用TRIzol試劑從標(biāo)本組織和培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)制造商說明書進(jìn)行cDNA合成和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，TIP30及其內(nèi)參照β-actin、miR-124-3p及其內(nèi)參照U6的正向和反向引物根據(jù)NCBI基因文庫用Primer Premier 5.0 軟件自行設(shè)計。TIP30引物序列，正向：5'-GTG TTG GGT TCT GTT GCC-3'，反向：5'-TCA TAG TTG AGT TCC CTT CG-3'；內(nèi)參照β-actin引物序列，正向：5'-GAT TGC CTC AGG ACA TTT CTG-3'，反向：5'-GAT TGC TCA GGA CAT TTC TG-3'。miR-124-3p引物序列，正向：5'-CGT AAG GCA CGC GGT GAA-3'，反向：5'-AGT GCA GGG TCC GAG GTA TT-3'；內(nèi)參照U6引物序列，正向：5'-GTA GAT ACT GCA CTA CG-3'，反向：5'-ACT GCA TGA CGT ACC TGA GC-3'。采用2-ΔΔCT 法計算相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計處理采用獨立t檢驗對組間進(jìn)行比較；計數(shù)資料采用χ2檢驗。患者總生存率和累積復(fù)發(fā)率均采用Kaplan-Meier分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIP30 在ICC 和癌旁組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，TIP30蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)。TIP30蛋白在癌組織與癌旁組織中均有表達(dá)，相對比癌旁組織，TIP30在ICC組織中表達(dá)降低（圖1）。同時，根據(jù)51對ICC組織及對應(yīng)癌旁組織的免疫組化結(jié)果構(gòu)建的熱圖亦反應(yīng)了這種表達(dá)差異（圖2）。

圖1 免疫組化檢測TIP30 的表達(dá)（×400） A：癌旁組織；B：癌組織Figure 1 Immunohistochemical staining for the expression of TIP30 (×400) A:Adjacent tissue;B:Cancer tissue

2.2 TIP30 表達(dá)與ICC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

分析我院51 例ICC患者的臨床病理參數(shù)，發(fā)現(xiàn)TIP 30的低表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P=0.008），而與患者性別（P=0.543）、年齡（P=0.351)、TNM分期（P=0.513）、分化程度（P=0.221）、腫瘤大?。≒=0.061）、腫瘤數(shù)目（P=0.112）、CA19-9水平（P=0.306）無關(guān)（表1）。

圖2 TIP30 在ICC 組織及癌旁組織中的表達(dá)熱圖（紅色：表達(dá)上調(diào)；綠色：表達(dá)下調(diào)）Figure 2 Heat map of TIP30 expression in ICC tissues and adjacent tissues (red:up-regulated expression;green:down-regulated expression)

表1 TIP30 表達(dá)與ICC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of TIP30 expression with clinicopathologic variables of ICC patients[n (%)]

2.3 TIP30 表達(dá)與ICC 患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)患者的隨訪資料構(gòu)建累積復(fù)發(fā)率和總生存率Kaplan-Meier曲線。結(jié)果顯示在行根治性手術(shù)治療的104例患者中，TIP30高表達(dá)組患者5年累計復(fù)發(fā)率低于TIP30低表達(dá)組患者（P=0.0374）；在所有行TIP30檢測的145例ICC患者中，TIP30高表達(dá)組患者的5年總生存率高于TIP30低表達(dá)組患者（P=0.0412）（圖3）。

圖3 Kaplan-Meier 曲線分析 A：總生存率曲線；B：累積復(fù)發(fā)率曲線Figure 3 Kaplan-Meier curves analysis A:Overall survival curves;B:Cumulative relapse curves

2.4 TIP30 對ICC 細(xì)胞增殖的影響

實驗結(jié)果表明，與陰性對照組（NC）相比，由TIP30-shRNA轉(zhuǎn)染的ICC細(xì)胞（ICC-9810、SSP-25和HuH-28）形成的集落數(shù)明顯增加（均P＜0.001）（圖4），表明TIP30表達(dá)降低在體外可促進(jìn)ICC細(xì)胞增殖。

圖4 軟瓊脂克隆形成實驗Figure 4 Soft agar colony formation assay

2.5 調(diào)控TIP30 的miRNA 預(yù)測

根據(jù)TargetScan、miRDB數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果構(gòu)建Venn圖，兩數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能調(diào)控TIP30表達(dá)水平的miRNA分別有10個、33個，取二者交集得出miR-124-3p調(diào)控TIP30的表達(dá)可能性較大（圖5）。

2.6 miR-124-3p 對TIP30 表達(dá)的潛在調(diào)控

運用qRT-PCR檢測我院51對ICC組織和癌旁組織中miR-124-3p的含量，結(jié)果顯示m i R-124-3 p 在癌組織中的相對含量高于癌旁組織（P＜0.001）（圖6）。在miR-124-3p轉(zhuǎn)染的ICC細(xì)胞系（9810、SSP-25和HuH-28）中TIP30的表達(dá)水平明顯低于各自的陰性對照組（均P＜0.05）（圖7）。初步推斷ICC中TIP30的表達(dá)水平可能受miR-124-3p的負(fù)向調(diào)控。

圖5 調(diào)控TIP30 的miRNA 的預(yù)測與分析Figure 5 Prediction and analysis of the miRNAs regulating TIP30

圖6 miR-124-3p 在ICC 和癌旁組織中的表達(dá)Figure 6 The expressions of miR-124-3p in ICC tissue and tumor-adjacent tissue

圖7 轉(zhuǎn)染miR-124-3p 后ICC 細(xì)胞中TIP30 的表達(dá)Figure 7 Expression of TIP30 in ICC cells transfected with miR-124-3p

3 討論

ICC是5年存活率最低的惡性腫瘤之一，手術(shù)切除是首選治療方式，但由于早期難于診斷、疾病進(jìn)展迅速等特點，只有10%～15%的患者適合手術(shù)治療[15]，因此迫切需要尋找早期診斷及預(yù)后判斷指標(biāo)并發(fā)展有效的靶向治療手段。

TIP30基因是一種公認(rèn)的抑癌基因，定位于人類第11號染色體短臂上（11p15.1），包括6個外顯子，編碼242個氨基酸殘基的開放讀碼框架，其可以特異性地作用于Tat蛋白活化區(qū)域而對基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)[16-17]。既往研究認(rèn)為，TIP30抑癌效應(yīng)主要包括以下方面：⑴通過上調(diào) p53基因表達(dá)來阻滯腫瘤細(xì)胞周期自G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長[18]；⑵誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞瘤2基因相關(guān)凋亡促進(jìn)因子（Bcl-2 associated death promoter，Bad）和凋亡誘導(dǎo)因子p53基因依賴性活化，與核膜物質(zhì)運輸相關(guān)蛋白結(jié)合調(diào)控核內(nèi)外信號交流，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]；⑶在肝細(xì)胞癌中下調(diào)骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的轉(zhuǎn)錄和翻譯，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子依賴性腫瘤轉(zhuǎn)移和新生血管生成[20]。此外，在參與DNA損傷修復(fù)[21]、參與腫瘤細(xì)胞能量代謝[22]等方面亦發(fā)揮重要作用，同時TIP30還能協(xié)同其他藥物發(fā)揮抗癌作用[23]。

TIP30在多種腫瘤中存在表達(dá)下調(diào)或缺失，并且與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。樊麗偉等[10]發(fā)現(xiàn)TIP30在正常結(jié)直腸黏膜組織中表達(dá)明顯高于結(jié)直腸腺瘤與結(jié)直腸癌組織，且在不同病理類型的腺瘤中，隨著結(jié)直腸腺瘤絨毛成分的增加，腺瘤惡變率增加，TIP30的表達(dá)也隨之降低。Li等[24]發(fā)現(xiàn)TIP30的過表達(dá)能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并有研究認(rèn)為TIP30表達(dá)下調(diào)可能是膀胱癌預(yù)后標(biāo)志物，與預(yù)后不良相關(guān)[25]。Xu等[26]開展的一項納入多種腫瘤的Mata分析顯示，在具有良好總體生存率的腫瘤患者中，TIP30的高表達(dá)與較高的無復(fù)發(fā)生存率之間存在顯著相關(guān)性，認(rèn)為TIP30的高表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后良好相關(guān)。

本研究通過免疫組化發(fā)現(xiàn)TIP30在ICC中的表達(dá)較癌旁組織低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并且這與TIP30在人體多種腫瘤中的表達(dá)情況一致。分析TIP30的表達(dá)水平與ICC患者臨床病理因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TIP30的低表達(dá)與性別、年齡、TNM分期、分化程度、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、CA19-9水平無關(guān)（P＞0.05），與患者淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P=0.008），而淋巴轉(zhuǎn)移是ICC主要的轉(zhuǎn)移方式，這說明TIP30的表達(dá)差異對患者預(yù)后產(chǎn)生影響。在預(yù)后分析中，本研究利用生信分析挖掘了公共腫瘤數(shù)據(jù)庫的部分病例來擴(kuò)大研究樣本量，結(jié)果顯示 TIP30的低表達(dá)與患者更低的總生存率及更高的累積復(fù)發(fā)率相關(guān)。

本研究通過軟瓊脂克隆形成實驗初步探討了TIP30對ICC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。通過將TIP30-shRNA轉(zhuǎn)染到正常生長的ICC（ICC-9810、SSP-25和HuH-28）細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)與對照組細(xì)胞相比，實驗組各ICC細(xì)胞系形成的集落數(shù)均較對照組明顯增加（所有P＜0.001），這表明TIP30表達(dá)降低在體外可促進(jìn)ICC細(xì)胞增殖。

miRNA是一類由17 ～25 個堿基組成的單鏈RNA分子，廣泛存在于生物體內(nèi)，通過堿基互補(bǔ)配對原則與mRNA特異性結(jié)合來降解靶基因或抑制其翻譯，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等生物學(xué)過程[27-28]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-124-3p在多種腫瘤中發(fā)揮了重要的作用。在肝細(xì)胞癌中，miR-124-3p水平與40 kD大小的富含Akt底物蛋白（prolin-rich Akt substrate of 40 kD，PRAS40）蛋白和磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)，miR-124-3p缺失引起的PRAS40高表達(dá)有助于PRAS40的過度磷酸化和肝癌的發(fā)生[29]；另有研究表明，miR-124-3p在口腔舌鱗狀細(xì)胞癌中可以靶向高遷移率族蛋白A2（high mobility group protein A2，HMGA2）以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[30]，miR-124-3p可以靶向p62抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[31]。本研究利用生信方法預(yù)測miR-124-3p可能是TIP30的上游調(diào)控因子，并通過qRT-PCR檢測了51對ICC組織與癌旁組織中miR-124-3p的相對表達(dá)量,結(jié)果表明miR-124-3p在癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯升高（P＜0.001）；同時，與陰性對照組相比，經(jīng)miR-124-3p轉(zhuǎn)染的各細(xì)胞系中，TIP30的表達(dá)均下調(diào)。研究推斷ICC中TIP30的表達(dá)下調(diào)可能與miR-124-3p有關(guān)，但仍需通過進(jìn)一步抑制或過表達(dá)細(xì)胞株中miR-124-3p表達(dá)后檢測TIP30的變化，使結(jié)論更可靠。

綜上所述，TIP30在ICC組織中表達(dá)下調(diào)且與患者不良預(yù)后相關(guān)，該基因可能用于ICC的預(yù)后評估并為臨床診治提供新思路。此外，TIP30在ICC中的表達(dá)可能受miR-124-3p的調(diào)控，但有待后續(xù)進(jìn)一步研究。