張雨晴，武玉欽，袁建敏

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

在現(xiàn)代畜禽生產(chǎn)中，養(yǎng)殖場常通過提高飼養(yǎng)密度來降低成本，導(dǎo)致家禽發(fā)生高密度氧化應(yīng)激[1]。高密度氧化應(yīng)激會導(dǎo)致家禽血清中皮質(zhì)酮水平升高[2]，生產(chǎn)性能、胴體品質(zhì)下降[3]，產(chǎn)生炎性介質(zhì)致使細(xì)胞死亡[4]。核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）信號通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路，可轉(zhuǎn)錄大量炎性因子[5]。研究發(fā)現(xiàn)，煙酰胺（NAM）可通過磷酸戊糖途徑改善細(xì)胞氧化還原平衡[6]，提高免疫細(xì)胞的增殖潛能[7]。丁酸鈉可通過改善線粒體功能，提高機體抗氧化能力，維持小鼠腸道屏障完整性[8]。

目前，飼糧中添加煙酰胺和丁酸鈉能否緩解高密度應(yīng)激導(dǎo)致的肉雞炎癥、改善畜禽健康，還未見報道。本試驗旨在研究煙酰胺和丁酸鈉對高密度籠養(yǎng)肉雞生產(chǎn)性能、血清及肝臟中抗氧化指標(biāo)、盲腸扁桃體炎癥因子的影響，為改善高密度飼養(yǎng)肉雞的營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及動物 試驗動物為AA+雄性肉雞，1 日齡雛雞購于北京某公司；煙酰胺（99%）購于江西兄弟醫(yī)藥有限公司；包被丁酸鈉（有效成分30%）購于杭州康德權(quán)飼料有限公司。

1.2 試驗設(shè)計與飼糧 1 日齡肉雞在相同的環(huán)境和飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)至26 日齡后，選擇342 只體重相近約為1.2 kg 的肉雞隨機分為5 組，分別為正常密度組（12.9 只/m2）、高密度組（17.1 只/m2）、高密度+煙酰胺組（50 mg/kg）、高密度+丁酸鈉組（500 mg/kg）和高密度+復(fù)合添加劑組（50 mg/kg 煙酰胺+500 mg/kg 丁酸鈉）。每組6個重復(fù)，正常密度組每個重復(fù)9 只，高密度組每個重復(fù)12 只，飼養(yǎng)至46 日齡?；A(chǔ)飼糧參考NRC（1994）肉雞營養(yǎng)需要配制玉米-豆粕型顆粒飼料，飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州養(yǎng)殖基地進(jìn)行，試驗期20 d。采用籠養(yǎng)（籠底面積0.7 m2），低密度9 只/籠（12.9 只/m2），高密度12 只/籠（17.1 只/m2），飼養(yǎng)管理參照AA+肉雞飼養(yǎng)管理手冊執(zhí)行，自動化控制雞舍溫度、濕度和通風(fēng)，并進(jìn)行消毒、免疫。

1.4 樣品采集和測定指標(biāo) 46 日齡時，雞只空腹12 h 后，以重復(fù)為單位進(jìn)行稱重，記錄采食量，計算26～46 日齡體增重、采食量、耗料增重比。從每個重復(fù)選擇1 只接近平均體重的雞，翅靜脈采血，2 500 r/min 離心10 min得到血清，置于-20℃儲存待測。之后靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉劑將肉雞處死，迅速打開腹腔，采集肝臟、盲腸扁桃體分子樣品，迅速放液氮中，而后置-80℃冰箱待測。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 血清氧化還原酶活性 取待測血清，使用南京建成生物工程研究所試劑盒按照說明書測定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，cat#A005）、超氧化物歧化酶（SOD，cat#A001-3）活性。

1.5.2 肝臟、盲腸扁桃體 mRNA 相對表達(dá)量 肝臟、盲腸扁桃體RNA 使用Trizol 試劑（TaKaRa，日本）進(jìn)行提取，用核酸測定儀（Nano-drop2000）測定RNA的純度和濃度。當(dāng)OD260nm/OD280nm在1.8～2.0 說明RNA 質(zhì)量較好，用于下一步試驗。參照TaKaRa Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa，日本）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（RR420A，TaKaRa，日本）說明書進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)儀器為7500 熒光檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems），PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s 后，進(jìn)行95℃變性5 s，60℃復(fù)性34 s，40 個循環(huán)反應(yīng)。引物DNA 由上海生工生物工程公司合成。PCR擴增完成后觀察熔解曲線，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增基因片段是否符合設(shè)計長度，驗證擴增產(chǎn)物的特異性。肝臟抗氧化基因所用引物序列見表2，盲腸扁桃體免疫相關(guān)基因所用引物序列見表3，基因表達(dá)的結(jié)果采用2-ΔΔCT進(jìn)行分析比較，以β-肌動蛋白（β-actin）作為參照基因校準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS（v.20.0，SPSS Institute，Chicago，IL）的ANOVA 進(jìn)行組間單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan's 多重比較，P＜0.05 時表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對肉雞生產(chǎn)性能的影響如表4 所示，飼養(yǎng)密度對肉雞采食量、末重和體增重均有顯著影響，高密度組采食量、末重和體增重均低于低密度對照組（P＜0.05）。高密度單獨添加煙酰胺或丁酸鈉對采食量、體增重和耗料增重比均沒有緩解效果，但高密度添加煙酰胺有提高末重的效果，高密度聯(lián)合添加煙酰胺和丁酸鈉可緩解高密度造成的末重和體增重下降，達(dá)到正常密度效果。

2.2 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對肉雞血清抗氧化酶活的影響 由表5 可知，高密度組添加丁酸鈉和煙酰胺對肉雞血清中GSH-Px、SOD 活性沒有顯著性影響。

表2 肝臟抗氧化相關(guān)基因 Real-time PCR 引物序列

表3 盲腸扁桃體免疫相關(guān)基因 Real-time PCR 引物序列

表4 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對肉雞生產(chǎn)性能的影響

表5 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對肉雞血清抗氧化酶活的影響

2.3 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對高密度飼養(yǎng)肉雞肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響 如表6 所示，與正常密度組相比，高密度組的肝臟HO-1mRNA 表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）；高密度組單獨添加丁酸鈉、復(fù)合添加煙酰胺和丁酸鈉后進(jìn)一步上調(diào)了肝臟HO-1mRNA 表達(dá)（P＜0.05）；高密度降低了肝臟GSH-PxmRNA 的表達(dá)（P＜0.05），高密度組添加煙酰胺和丁酸鈉后可以提高GSH-PxmRNA 表達(dá)（P＜0.05），達(dá)到正常密度的效果。

2.4 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對高密度飼養(yǎng)肉雞盲腸扁桃體炎癥相關(guān)基因表達(dá)量的影響 如表7 所示，高密度組的盲腸扁桃體促炎因子TNF-αmRNA 低于正常密度組（P＜0.05），促炎因子IL6、抑炎因子IL10mRNA高于正常密度組（P＜0.05）；高密度組單獨添加煙酰胺或丁酸鈉均可提高TNF-αmRNA 表達(dá)（P＜0.05），但高密度添加丁酸鈉導(dǎo)致TNF-αmRNA 表達(dá)高于正常密度組，高密度添加煙酰胺+丁酸鈉可以提高TNF-αmRNA 表達(dá)（P＜0.05），達(dá)到正常密度的效果。

高密度組單獨添加煙酰胺或丁酸鈉以及復(fù)合添加組均可以降低IL6mRNA 表達(dá)（P＜0.05），達(dá)到正常密度效果。高密度復(fù)合添加煙酰胺和丁酸鈉組可降低盲腸IL10mRNA 表達(dá)（P＜0.05），達(dá)到正常密度組一致的效果。

2.5 煙酰胺和丁酸鈉對高密度飼養(yǎng)肉雞 Keap1-Nrf2-ARE 抗氧化應(yīng)激信號通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響 由表8 可知，在Keap1-Nrf2-ARE 通路中，與正常密度組相比，高密度組盲腸扁桃體Nrf2mRNA 上調(diào)（P＜0.05），高密度組單獨添加丁酸鈉或復(fù)合添加煙酰胺+丁酸鈉進(jìn)一步上調(diào)了Nrf2mRNA 表達(dá)（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 煙酰胺和丁酸鈉對高密度飼養(yǎng)肉雞生產(chǎn)性能的影響 高飼養(yǎng)密度可降低肉雞采食量、體增重和出欄重。Piva 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在高飼養(yǎng)密度下，高劑量煙酰胺（150 mg/ kg）可使24 日齡和40 日齡肉雞體重分別提高6.8%和2.4%；Song 等[10]研究表明，丁酸是腸細(xì)胞首選的能量來源，日糧補充丁酸鈉會降低肉雞的平均日采食量、耗料增重比和死亡率。本試驗中，高密度組的采食量、末重和體增重均顯著低于低密度組，生產(chǎn)性能下降；單獨添加煙酰胺和復(fù)合添加組均可改善高密度造成的肉雞末重下降，復(fù)合添加劑組還可緩解高飼養(yǎng)密度引起體增重的降低，說明丁酸鈉和煙酰胺具有協(xié)同效應(yīng)，并且可以達(dá)到正常密度的效果。

3.2 煙酰胺和丁酸鈉對肉雞抗氧化功能的影響 肉雞產(chǎn)業(yè)中，高飼養(yǎng)密度會對動物生產(chǎn)健康造成許多負(fù)面影響[11]。越來越多的證據(jù)表明，家禽生產(chǎn)中的大部分問題都與氧化應(yīng)激有關(guān)[12]，導(dǎo)致機體代謝紊亂，產(chǎn)生大量活性氧[13]。氧化應(yīng)激還會產(chǎn)生大量應(yīng)激蛋白（如CRP、熱休克蛋白）并激活機體氧誘導(dǎo)的限速酶（如HO-1）加速組織氧化損傷[14]。CAT、SOD 和 GSH-Px 是機體最主要的酶促抗氧化系統(tǒng)，其主要作用是清除自由基和活性氧、防止過氧化物產(chǎn)生。Wu 等[15]試驗表明，日糧添加丁酸鈉可提高血清SOD 和CAT 活性，降低血清MDA 水平，還可提高肉雞空腸黏膜的總抗氧化能力，降低空腸和回腸黏膜的MDA 含量。Choi 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，添加煙酰胺可抑制ROS 生成，降低脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化水平，提高線粒體還原水平。盡管本研究發(fā)現(xiàn)高密度添加煙酰胺+丁酸鈉并沒有改善血清中GSH-Px、SOD 含量，但肝臟的抗氧化基因GSH-PxmRNA 表達(dá)發(fā)生顯著性差異，說明高密度添加煙酰胺和丁酸鈉對肝臟的抗氧化能力產(chǎn)生了調(diào)節(jié)效應(yīng)。本試驗中添加丁酸鈉和煙酰胺對高密度組肝臟中血紅素加氧酶具有顯著性調(diào)控作用，但對應(yīng)激蛋白沒有顯著影響，有待于進(jìn)一步研究。

表6 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對高密度飼養(yǎng)肉雞肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響

表7 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對高密度飼養(yǎng)肉雞盲腸扁桃體炎癥相關(guān)基因表達(dá)量的影響

3.3 煙酰胺和丁酸鈉對機體炎癥反應(yīng)的影響 細(xì)胞因子雖在機體內(nèi)含量較低，但作用高效，在機體免疫防御過程中發(fā)揮重要作用。Yarahmadi 等[17]研究表明，密度應(yīng)激能夠提高促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的釋放，促炎因子可以介導(dǎo)炎癥發(fā)生，但是有研究發(fā)現(xiàn)適量的TNF-α增加能夠增強機體的抗感染能力[18]。這解釋了本試驗中高密度組TNF-αmRNA 表達(dá)低于正常密度組，說明密度應(yīng)激后抗感染能力下降，復(fù)合添加丁酸鈉和煙酰胺可以提高TNF-αmRNA 表達(dá)，細(xì)胞因子的增加激活了機體第二道免疫防線。Lappas 等[19]研究表明，煙酰胺（NAM）可降低LPS 刺激的胎盤中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6以及炎性介質(zhì)前列腺素PGE2等基因的表達(dá)。Yanez 等[20]研究其抗炎機制發(fā)現(xiàn)NAM 可通過抑制核因子κB，激活二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP1）生成，減少促炎因子IL8 的產(chǎn)生。丁酸鈉不但可調(diào)節(jié)肉雞盲腸扁桃體中免疫相關(guān)基因的表達(dá)，降低十二指腸黏膜中促炎因子水平以及NF-κB 的活化水平[21]，還可降低雞血清中抑炎因子IL10 的水平[22]。本試驗中高密度單獨添加煙酰胺或丁酸鈉以及復(fù)合添加劑組均降低了促炎因子IL6mRNA 表達(dá)，只有復(fù)合添加劑組IL10mRNA 表達(dá)顯著降低。因為促炎因子和抑炎因子具有協(xié)同作用，炎癥早期，機體向促炎性免疫一端傾斜，加速免疫細(xì)胞進(jìn)行病原體清除，說明營養(yǎng)調(diào)控對早期的炎癥起了作用。IL10 是潛在抗炎因子，在炎癥后期分泌，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受，此結(jié)果說明煙酰胺和丁酸鈉有助于恢復(fù)后期過度的炎癥反應(yīng)。

3.4 煙酰胺和丁酸鈉對Keap1-Nrf2-ARE 通路的調(diào)控Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）-核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）-抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路，其調(diào)控下游相關(guān)代謝酶和抗氧化蛋白酶的合成[23]?？寡趸窌绊懷装Y反應(yīng)通路，活性氧在NF-κB 炎癥信號通路中可以激活巨噬細(xì)胞表面上的Toll 樣受體（TLR4），增加炎性因子IL6、IL8、TNF-α的基因表達(dá)，同時iNOS 會被激活[24]。另一方面，當(dāng) NF-κB 分子在信號通路被激活時，會引起一系列的級聯(lián)反應(yīng)和泛素化修飾，啟動促炎因子的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[25]。iNOS 是體內(nèi)生成NO 的主要催化酶之一，在正常情況下并不表達(dá)，但受促炎因子和LPS 等刺激后會大量產(chǎn)生[26]。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加煙酰胺和丁酸鈉后，Keap1-Nrf2-ARE 通路中Nrf2基因表達(dá)具有顯著性變化。Nrf2 的化學(xué)組分是堿性亮氨酸，可以加速清除體內(nèi)多余氧自由基。本試驗中高密度組Nrf2基因表達(dá)明顯升高，說明Nrf2 是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，機體出現(xiàn)了應(yīng)激反應(yīng)。營養(yǎng)調(diào)控后進(jìn)一步升高了Nrf2基因表達(dá)，說明活化的Nrf2 從Keap1 解離后進(jìn)入細(xì)胞核，與Maf 蛋白結(jié)合為異二聚體后再同ARE 序列結(jié)合，啟動下游抗氧化蛋白基因轉(zhuǎn)錄[27]?？寡趸分蠯eap-1 沒有顯著性變化，可能是Nrf2 的氨基酸有6 個保守的功能區(qū)，有的區(qū)域有絲氨酸殘基，對Nrf2 的調(diào)節(jié)不依賴于Keap-1。另外，Nrf2本身含有氧化應(yīng)激感受器，在氧化還原不平衡狀態(tài)下較為敏感。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，在高密度籠養(yǎng)條件下，家禽飼糧中添加煙酰胺和丁酸鈉可以提高肉雞的生產(chǎn)性能，緩解高密度氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肉雞炎癥基因表達(dá)。Keap1-Nrf2-ARE 信號通路可能參與了煙酰胺和丁酸鈉對肉雞抗氧化能力的調(diào)控。