吳 磊，劉瑞莉，柏學(xué)進(jìn)，劉賢勛，呂娟娟，肖超柱，董雅娟,3*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物胚胎工程中心，山東青島 266109；2.山東省黑牛繁育工程技術(shù)研究中心，山東青島 266109；3.山東布萊凱特黑?？萍脊煞萦邢薰?，山東淄博 256306）

CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄共激活因子家族（CREB Regulated Transcription Coactivator Family，CRTCs）是由基因組高通量篩選出的一種保守的真核蛋白家族，包含CRTC1、CRTC2、CRTC3 3 個(gè)成員。CRTCs家族的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（Coiled-coil Domain）高度保守，與CREB的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（Basic Leucine Zipper，bZIP）相結(jié)合，調(diào)控CREB的轉(zhuǎn)錄[1]。CRTC1在大腦中主要通過調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived Neurophic Factor，BDNF）來調(diào)節(jié)樹突的生長發(fā)育和糖代謝過程[2-3]，此外，β-淀粉樣蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）可能通過影響CRTC1的活性來干擾與記憶相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，從而在神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。CRTC3基因廣泛分布于各組織細(xì)胞中，在棕色脂肪中CRTC3 蛋白通過兒茶酚胺信號通路影響脂肪代謝。可見，CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄共激活因子家族參與多種生理調(diào)控，對機(jī)體生長發(fā)育具有重要作用。

本研究以布萊凱特黑牛為研究對象，通過克隆測序檢測其CRTC1、CRTC3基因的CDS 序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；運(yùn)用熒光定量檢測CRTC1、CRTC3基因mRNA 相對表達(dá)量；并用免疫組化技術(shù)檢測CRTC1、CRTC3 蛋白的表達(dá)位點(diǎn)，探討CRTC1、CRTC3基因與肉牛肌肉生長發(fā)育的關(guān)系，以期為布萊凱特黑牛品種繁育提供基因儲備，并為進(jìn)一步研究CRTC1、CRTC3基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 氨芐、IPTG、X-Gal 購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；T 載體連接試劑盒購自上海生工生物股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自青島擎科生物有限公司；iTaqUniwersal SYBR Green Supermix 5 mL（5×1 mL Vials）購自青島鑫宇恒一科技有限公司。PCR 儀購自德國Eppendorf 公司；凝膠成像系統(tǒng)購自Alpha Innotech 公司；熒光定量儀購自Bio-Rad 公司；Leica RM2235 切片機(jī)購自德國萊卡公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與樣品采集 實(shí)驗(yàn)動物來自布萊凱特黑牛科技股份公司，是通過體細(xì)胞克隆、胚胎移植等技術(shù)培育而成的優(yōu)良種質(zhì)[6]。選取飼養(yǎng)環(huán)境相同的2、6、10、18 月齡的布萊凱特黑牛和魯西黃牛各3 頭，采集脂肪、睪丸、甲狀腺、肺臟、背最長肌、心臟、胰臟、肝臟、脾臟、腎臟10 種組織置于液氮中保存，采集背最長肌置于4%多聚甲醛中保存。

1.3 布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3基因的克隆測序 根據(jù)NCBI 網(wǎng)站上的牛CRTC1（登錄號：XM_010816996.2）、CRTC3（登錄號：XM_010816996.2）基因序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1 所示。提取黑牛和黃牛背最長肌總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測OD 值處于1.8～2.0 后，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以背最長肌組織cDNA 為模板，依次加入2×T5 Super Mix 12.5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、cDNA模板1 μL，置于離心機(jī)中混勻后進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳后將得到的目的片段進(jìn)行膠回收，并采用T 載體連接試劑盒將目的片段連接到pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)化并篩選陽性菌落，提取目的基因重組克隆質(zhì)粒后送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測序。

1.4 布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3基因熒光定量PCR檢測 提取睪丸、肺臟、肝臟、脾臟、腎上腺、甲狀腺、心臟、胰臟、脂肪、背最長肌的cDNA，以及2 月齡、6 月齡、10 月齡、18 月齡背最長肌的cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。選取GAPDH基因（登錄號：NM_001034034.2）為內(nèi)參基因，根據(jù)上述序列設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1），將96 孔板置于冰上，按滴加10 μL SYBR Green 預(yù)混液，7.8 μL RNA-free Water，上下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，1 μL cDNA 模板。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，40 個(gè)循環(huán)。檢測數(shù)據(jù)采用2-△△CT值法計(jì)算。

1.5CRTC2基因免疫組化檢測 取出在4%多聚甲醛中固定的背最長肌進(jìn)行修剪。在PBS 緩沖液中浸泡10 h，用不同濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟1 h，待蠟塊完全凝固后對背最長肌進(jìn)行修整，用切片機(jī)切成5 μm厚度。置于58℃烘箱中12 h，取出后再依次用二甲苯、不同濃度的乙醇、枸櫞酸鈉緩沖液浸泡，用PBS 緩沖液沖洗3 次，每次7 min。用濾紙吸凈玻片上的液體，滴加山羊血清，然后置于濕盒中，放在37℃的恒溫箱中靜置30 min。取出后拭去玻片上的血清，滴加一抗，小心置于4℃冰箱中過夜。PBS 緩沖液洗3 次后繼續(xù)滴加二抗（辣根過氧化物酶），放置在濕盒中，錫紙包裹后放于37℃恒溫箱中30 min，PBS 緩沖液洗4 次，每次10 min。滴加DAPI，完全覆蓋組織片即可，放在濕盒中，然后置于37℃恒溫箱中靜置5 min。輕甩PBS緩沖液洗4 次，最后用抗熒光衰減封片劑進(jìn)行封片處理，繼而熒光顯微鏡檢查以及拍片。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1CRTC1、CRTC3基因克隆測序及生物信息學(xué)分析 以布萊凱特黑牛背最長肌為模板，克隆測序發(fā)現(xiàn)CRTC1、CRTC3基因CDS區(qū)分別為1 773 bp和1 725 bp（圖1），分別編碼590、575 個(gè)氨基酸，CRTC1 和CRTC3蛋白的總平均親水性分別為-0.577、-0.559，等電點(diǎn)pI分別為5.50 和6.17（表2）。進(jìn)化樹（圖2）顯示與牛、瘤牛、山羊和綿羊的同源性高（＞80%），二級結(jié)構(gòu)（圖3）顯示CRTC1、CRTC3基因不規(guī)則卷曲均高于60%，其次為α-螺旋，并含有少量的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）顯示CRTC1、CRTC3基因與鹽誘導(dǎo)激酶、AMPK家族基因、FOXO1、FOXO3、AKT1、AKT2、AKT3、TP53、CITED2、CREBBP、CRTB1、ATF3、IRF3、RELA等基因相互作用。

2.2CRTC1、CRTC3、GAPDH基因的PCR 擴(kuò)增 由圖5 可知，擴(kuò)增產(chǎn)物CRTC1、CRTC3、GAPDH基因分別為63、130、104 bp，產(chǎn)物與預(yù)期一致，條帶清晰無雜質(zhì)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果 由圖6 可知，布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3、GAPDH基因擴(kuò)增結(jié)果良好，特異性強(qiáng)，無雜亂峰，數(shù)據(jù)可用于下一步分析。

圖1 布萊凱特黑牛CRTC1（A）、CRTC3（B）基因CDS 擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 CRTC1、CRTC3 蛋白基本性質(zhì)

圖2 CRTC1（A）、CRTC3（B）cDNA 序列構(gòu)建的UPGMA 系統(tǒng)發(fā)生樹

2.4CRTC1、CRTC3基因在不同組織中的表達(dá)分析 由圖7 可知，CRTC1、CRTC3基因在各組織中均有表達(dá)，CRTC1基因在睪丸中的mRNA 相對表達(dá)量最高，均極顯著高于胰臟、腎上腺、脾臟等其他組織；其次在胰臟中表達(dá)，顯著高于胰臟和腎上腺組織，極顯著高于肝臟、甲狀腺等其他組織；在心臟中的表達(dá)量最低。CRTC3在脂肪組織中的表達(dá)量最高，極顯著高于睪丸、甲狀腺、心臟、肺臟等其他組織；其次在睪丸和甲狀腺中表達(dá)，且極顯著高于肺臟、心臟和胰臟等其他組織；在腎臟中表達(dá)量最低。

2.5CRTC1、CRTC3基因在不同月齡的表達(dá)分析 由圖8 可知，布萊凱特黑牛和魯西黃牛背最長肌CRTC1、CRTC3基因在4 個(gè)時(shí)期中均有表達(dá)，并隨著年齡的增長表達(dá)量逐漸降低。布萊凱特黑牛CRTC1基因在2 月齡表達(dá)量最高，極顯著高于6、10、18 月齡，在18 月齡表達(dá)量最低。CRTC3基因在6 月齡表達(dá)量最高，極顯著高于10、18 月齡。魯西黃牛CRTC1基因在2 月齡表達(dá)量最高，極顯著高于10、18 月齡，顯著高于6月齡；CRTC3基因在6 月齡表達(dá)量最高，高于2 月齡，極顯著高于10、18 月齡。

2.6 CRTC1、CRTC3 蛋白表達(dá)分析 由圖9 可知，CRTC1、CRTC3 蛋白在背最長肌中呈區(qū)域性分布，主要在肌漿內(nèi)的肌原纖維中表達(dá)，橫切呈橢圓形，縱切呈紡錘形。

3 討 論

圖3 CRTC1（A）、CRTC3（B）蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3.1CRTC1、CRTC3基因CDS 序列分析 本實(shí)驗(yàn)利用普通PCR 法克隆了布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3基因序列，結(jié)果顯示，CRTC1、CRTC3基因CDS 區(qū)分別為1 773 bp 和1 728 bp，分別編碼575 個(gè)和590 個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CRTC1 和CRTC3 蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)分別為63.80 和68.23，均大于40，推斷CRTC1和CRTC3 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差。蛋白質(zhì)的總平均親水性分別為-0.577、-0.559，推斷CRTC1 和CRTC3 蛋白為水溶性蛋白，表現(xiàn)為親水性。CRTC1 和CRTC3 蛋白的等電點(diǎn)pI 分別為5.50 和6.17，均小于7，推斷2種蛋白質(zhì)都是偏酸性蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，CRTC1和CRTC3 蛋白的不規(guī)則卷曲含量最高，其次為α-螺旋，并含有少量的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，表明該蛋白為非常規(guī)蛋白。為揭示CRTC1、CRTC3基因在物種間的親緣關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了CRTC1、CRTC3基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3基因均顯示與牛、瘤牛、山羊和綿羊相距最近，與野豬、家犬等物種相距較近，與樹袋熊相距最遠(yuǎn)。推斷CRTC1、CRTC3基因序列在反芻動物中具有高度的保守性，進(jìn)而發(fā)揮相同的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRTC基因家族與鹽誘導(dǎo)激酶（SIK1、SIK2）、AMPK家族基因（PRKAA1、PRKAA2、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2）、FOXO1、FOXO3等基因互作，在與CRTC1、CRTC3互作的基因中，PRKAA1和PRKAA2是調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪含量、背膘厚和眼肌面積等生長性狀的基因[7-9]，F(xiàn)oxO基因家族通過多種方式調(diào)節(jié)骨骼肌的生長發(fā)育[10-12]。推測CRTC1、CRTC3基因是調(diào)控動物肌肉生長發(fā)育的候選基因，具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4 CRTC1（A）、CRTC3（B）蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 CRTC1（A）、CRTC3（B）和GAPDH（C）基因PCR 擴(kuò)增

圖6 CRTC1、CRTC3 和GAPDH 基因熒光定量擴(kuò)增曲線（A、C）和熔解曲線（B、D）

圖7 CRTC1（A）、CRTC3（B）基因在不同組織的表達(dá)水平

圖8 CRTC1（A）、CRTC3（B）基因mRNA 在4 個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)水平

圖9 背最長肌中CRTC1（A）、CRTC3（B）蛋白的表達(dá)特征

3.2CRTC1、CRTC3基因各組織、年齡分析 qRT-PCR結(jié)果顯示，CRTC1基因在睪丸中表達(dá)量最高，在胰臟、甲狀腺、脾臟、背最長肌等組織中表達(dá)量較高；在心臟中的表達(dá)量最低。推測CRTC1基因在睪丸中起較強(qiáng)的調(diào)控作用，在背最長肌等其他組織中也發(fā)揮一定作用。目前，CRTC1基因除在大腦的機(jī)制研究較為清晰外，脊髓水平CREB/CRTC1 信號活化通過啟動其靶基因轉(zhuǎn)錄在骨癌痛的維持中也發(fā)揮重要作用[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CRTC1基因在肌肉組織中也有表達(dá)，推測CRTC1在肌肉組織中也發(fā)揮一定的調(diào)控作用，具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。CRTC3基因在脂肪組織中的表達(dá)量最高，在背最長肌、肺臟等其他組織中表達(dá)量較高；在腎臟中表達(dá)量最低。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除CRTC3基因的小鼠脂肪細(xì)胞會變小[14]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明CRTC3基因?qū)χ窘M織具有調(diào)控作用。qRT-PCR 結(jié)果顯示CRTC3基因在脂肪組織中的表達(dá)量高于肌肉組織，這與約克夏豬中的研究結(jié)果相一致[15]。Lee 等[15]研究發(fā)現(xiàn)CRTC3基因p.V515F 位點(diǎn)的突變影響瘦肉產(chǎn)量、肌肉總面積。也有研究者對牛的CRTC1、CRTC3基因進(jìn)行了SNP 檢測，發(fā)現(xiàn)CRTC1基因單倍型組合H3H3(GGAA)、CRTC3基因單倍型組合H1H1（AACCCCTT）對肉牛的生長性狀和胴體性狀有顯著影響[16]。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)CRTC1、CRTC3基因在肌肉組織中有表達(dá)，進(jìn)而推測CRTC1、CRTC3基因在肌肉組織中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。

肥育期肌肉的發(fā)育是影響屠宰牛等級和肉質(zhì)的一個(gè)重要因素，在肥育階段肌肉的生長占主要地位[17]。本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測2 個(gè)品種4 個(gè)不同時(shí)期的CRTC1、CRTC3基因mRNA 表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個(gè)品種的CRTC1、CRTC3基因的mRNA 相對表達(dá)量都隨著年齡的增長逐漸降低。有研究者發(fā)現(xiàn)，在動物早期階段，肌纖維的生長速度隨著月齡增長逐漸減緩[18]，進(jìn)而推測CRTC1、CRTC3基因參與肌肉生長發(fā)育相關(guān)調(diào)節(jié)。

3.3 CRTC1、CRTC3 蛋白定位 本研究發(fā)現(xiàn)，CRTC1、CRTC3 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，在肌漿內(nèi)的肌原纖維中表達(dá)，預(yù)示著CRTC1、CRTC3 蛋白對肌原纖維的生長發(fā)育具有調(diào)控作用。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)，肌肉組織中的CRTC3 結(jié)合到CREB 增加線粒體中呼吸鏈和三羧酸循環(huán)中下游目的基因表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了能量代謝[19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，CRTC3 具有調(diào)控小鼠骨骼肌發(fā)育和肌纖維重構(gòu)的作用[20]。這與上述的免疫組化和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，均表明CRTC1、CRTC3 蛋白在肌肉組織中具有調(diào)控肌纖維生長發(fā)育的作用。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRTC1、CRTC3基因在布萊凱特黑牛的各組織中均有表達(dá)，在背最長肌中的表達(dá)隨著月齡的增加表達(dá)量逐漸降低，背最長肌中的CRTC1、CRTC3 蛋白在肌原纖維中表達(dá)。綜上表明，CRTC1、CRTC3基因調(diào)控肌纖維生長發(fā)育，進(jìn)而參與肌肉生長發(fā)育相關(guān)調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果可為布萊凱特黑牛新品種培育提供分子方面理論依據(jù)。