陳 星，楊 宇，龔 萍，葉勝強，鄧 兵，凌明湖，杜康裕，王麗霞

（武漢市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430208）

鴨肉膽固醇含量低，不飽和脂肪含量高，是綠色健康的肉類產(chǎn)品，深受消費者喜愛。我國地方鴨品種豐富，其中原產(chǎn)于福建地區(qū)的連城白鴨呈現(xiàn)獨特的“烏嘴白羽”外貌特征，具有重要的滋補和藥用價值，被稱為我國“唯一藥用鴨”[1]；沔陽麻鴨是湖北優(yōu)秀地方鴨品種，該鴨耐粗飼，肉質(zhì)優(yōu)良，曾是湖北地區(qū)醬鹵鴨制品的重要原料[2]。目前，地方品種鴨被廣泛作為培育優(yōu)質(zhì)肉鴨的遺傳素材，如利用連城白鴨和快大型肉鴨雜交選育的肉用型連城白鴨品系[3-4]，利用地方麻鴨和快大型肉鴨雜交的優(yōu)質(zhì)肉鴨品系[5-6]。研究不同地方品種鴨的肉質(zhì)差異以及肉質(zhì)差異形成的分子機制，對于利用不同地方鴨品種進行鴨肉質(zhì)遺傳改良具有重要意義。隨著二代測序技術的不斷完善和廣泛使用，比較轉(zhuǎn)錄組學技術成為研究畜禽肉質(zhì)形成分子機制的重要工具[7-10]。本研究從轉(zhuǎn)錄組水平上探討連城白鴨與沔陽麻鴨肉質(zhì)的差異，為更細致深入了解不同地方鴨的肉質(zhì)特性提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 連城白鴨和沔陽麻鴨在相同條件下網(wǎng)床飼養(yǎng)至300 日齡，每個品種隨機挑選3 只母鴨，禁食6 h后活體稱重，屠宰取樣。

1.2 肉質(zhì)性狀測定 所有鴨取同側(cè)的胸肌組織進行肉質(zhì)性狀測定。參照張亞慧等[11]的方案，利用索氏抽提法對粗脂肪含量進行測定。參照吳瑩瑩等[12]的方案，利用高效液相色譜法對鴨胸肌組織肌苷酸含量進行測定。將鴨胸肉修剪成長2 cm、寬1 cm、厚1 cm 的長條形，剔除筋腱、脂肪和肌膜，利用FTC 公司食品物性分析儀（型號：TMS-PRO）測定胸肌剪切力。每個樣本測定3 次，計算平均值。

1.3 轉(zhuǎn)錄組高通量測序、組裝及功能注釋 采集鴨胸肌樣品3～5 g，利用Trizol 進行總RNA 提取。使用Illumina 公司Hiseq X Ten 高通量測序平臺對轉(zhuǎn)錄組文庫進行測序，獲得Raw data 后，用Cutadapt 軟件截取測序接頭引物并使用Trimmomatic 軟件過濾原始堿基序列的低質(zhì)量值數(shù)據(jù)后獲得Clean reads。利用Tophat2，調(diào)用bowtie2，將每個樣本質(zhì)控后的二代序列比對至北京鴨參考基因組序列。

1.4 表達水平分析及KEGG 通路富集分析 調(diào)用bowtie2的比對結(jié)果進行統(tǒng)計，得到每個樣品比對到每個轉(zhuǎn)錄本上的Reads 數(shù)目，并對其進行FPKM（Fragments Per Kilobase per Million bases）轉(zhuǎn)換，來自同一個fragment的paired-end Reads 計數(shù)為一個fragment，進而得到基因和轉(zhuǎn)錄本的表達水平。用R 語言包edgeR 進行基因表達差異分析，差異表達基因的篩選閾值為|LOG2（Fold Change）|＞1 或，使用Goseq（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html）和KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）軟件對差異表達基因（DEGs）進行GO 和KEGG 的富集分析。

1.5 差異表達基因熒光定量PCR 驗證 為驗證高通量測序結(jié)果的準確性，挑選6 個差異表達基因AFBP、AMPD1、PLIN2、AQP7、ATG1、EDNRB2，參照GenBank中公布的鴨基因序列，利用Primer Primier 5.0 軟件設計特異性引物（表1），引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。以1.3 中各樣品RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄后進行實時熒光定量PCR，測定差異表達基因相對表達量。

1.6 統(tǒng)計分析 肉質(zhì)性狀測定數(shù)據(jù)采用平均值± 標準誤來表示，數(shù)據(jù)利用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析比較差異顯著性。P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 300 日齡連城白鴨和沔陽麻鴨肉質(zhì)性狀比較 由表2 可知，300 日齡連城白鴨體重極顯著低于沔陽麻鴨。2個品種胸肌率、胸肌粗脂肪率、胸肌剪切力均無顯著差異，但連城白鴨胸肌肌苷酸含量顯著高于沔陽麻鴨。

2.2 測序數(shù)據(jù)評估及對比分析 經(jīng)過文庫質(zhì)量檢測和測序質(zhì)量控制，各樣品均符合測序要求。6 個樣品共得到40.6 Gb Clean Data，各樣品Clean Data 均達到6.2 Gb以上，獲得Clean reads 22 193 765～26 261 968 條。測序數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量值Q30 為93.4%～94.2%，堿基GC 含量為51.3%～52.3%，各堿基質(zhì)量穩(wěn)定在20%～30%，低質(zhì)量堿基比例小，表明文庫構建質(zhì)量和測序質(zhì)量高，測序數(shù)據(jù)準確可靠，滿足后續(xù)分析條件。將獲得的Clean reads 與北京鴨參考基因組進行對比分析，結(jié)果表明各樣品的Clean reads 與參考基因組的比對效率在68.65%～72.17%。

表1 實時熒光定量PCR 引物信息

表2 連城白鴨和沔陽麻鴨肉質(zhì)指標比較

2.3 DEGs 的篩選、功能注釋和GO 富集分析 根據(jù)差異基因篩選標準，獲得了連城白鴨與沔陽麻鴨胸肌的DEGs 2 333 個，其中麻鴨高表達基因1 060 個，連城白鴨高表達基因1 273 個。部分差異表達基因信息見表3。

篩選出的2 333 個差異表達基因中，2 024 個基因能被GO 數(shù)據(jù)庫注釋，GO 分類結(jié)果見圖1。被注釋的DEGs 分別參與了生物學過程（Biological Process）、細胞組分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）的27、17、11 個功能亞分類。在生物學過程分類中，細胞過程、單一的生物過程和代謝過程參與的DEGs 最多。在細胞組分分類中，參與細胞、細胞部分、細胞器的差異表達基因數(shù)量最多。在分子功能分類中，DEGs 主要參與了結(jié)合和催化活性等功能。

2.4 差異表達基因的KEGG 注釋 經(jīng)過分析，1 060 個基因在麻鴨中表達較高，1 273 個基因在連城白鴨中表達較高。這些差異表達基因共富集到280 條信號通路，差異顯著的67 條，部分通路見圖2。差異表達基因富集到的代謝通路方面，脂質(zhì)代謝有15 條，氨基酸代謝有12 條，碳水化合物代謝有14 條，維生素代謝有12 條。蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和氨基酸等是肌肉的重要組成，這些物質(zhì)代謝差異直接影響了肌肉物質(zhì)的構成和品質(zhì)。

連城白鴨中高表達基因主要富集到雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、免疫調(diào)節(jié)相關的一些信號通路，如細胞壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、TPR 通道炎癥介導調(diào)節(jié)通路（Inflammatory Mediator Regulation of TRP Channels）以及凋亡自噬相關的一些信號通路（表4）；麻鴨高表達基因主要富集到與蛋白質(zhì)消化吸收（Protein Digestion and Absorption）、維生素和氨基酸代謝相關的信號通路，如酪氨酸代謝通路（Tyrosine Metabolism）、維生素B5代謝通路（Vitamin B6 Metabolism）以及視黃醇代謝通路（Retinol Metabolism）等（表5）。

2.5 Real-time PCR 驗證測序 6 個基因（轉(zhuǎn)錄本）的qRT-PCR 驗證結(jié)果見表6。選擇的目的基因在2 個鴨品種間表達變化與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致，表明本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序獲得的差異表達基因較為準確。

3 討 論

地方品種鴨肉質(zhì)鮮嫩、無腥味。本研究結(jié)果顯示，300 日齡連城白鴨體型較沔陽麻鴨小，但二者胸肌率無顯著差異；2 個品種鴨胸肌剪切力無顯著差異；2 個品種300 日齡肌內(nèi)脂肪均在3.8%左右，無顯著差異。有報道顯示，連城白鴨肌苷酸含量顯著高于大型肉鴨[13]，本研究測定發(fā)現(xiàn)，連城白鴨肌苷酸含量也顯著高于沔陽麻鴨，提示連城白鴨在風味物質(zhì)沉積方面具有顯著優(yōu)勢。這可能是連城白鴨適合煲湯的重要原因。從2 個品種鴨差異表達基因富集到的通路進一步比較其物質(zhì)沉積方面的差異，有助于尋找影響地方鴨風味和藥用價值形成的營養(yǎng)物質(zhì)。

表3 連城白鴨與沔陽麻鴨胸肌組織部分差異表達基因

圖1 差異表達基因GO 注釋

3.1 連城白鴨和沔陽麻鴨脂肪代謝相關信號通路比較脂肪細胞脂類分解調(diào)節(jié)信號通路（Regulation of lipolysis in adipocyte）中，PLIN1、FABP4等脂類轉(zhuǎn)運相關的基因在沔陽麻鴨中顯著高于連城白鴨，F(xiàn)ABP4基因多態(tài)性與鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量以及其中硬脂酸、亞油酸和亞麻酸的含量呈顯著相關[14]。雖然本實驗測定的連城白鴨和沔陽麻鴨胸肌粗脂肪含量無顯著差異，但不同類型脂肪酸含量還需更細致的比較。腺苷酸活化蛋白激酶信號通路（AMPK Signaling Pathway）是肌肉能量代謝的關鍵信號通路，能被脂聯(lián)素激活。脂聯(lián)素基因多態(tài)性和鴨脂肪沉積顯著相關[15]。本研究中，脂聯(lián)素基因ACDC在沔陽麻鴨中表達顯著高于連城白鴨，但脂聯(lián)素受體基因ADIPOR2僅在連城白鴨胸肌組織中檢測到表達，沔陽麻鴨中脂聯(lián)素是否通過其他受體發(fā)揮作用還需進一步研究。

3.2 連城白鴨和沔陽麻鴨胸肌鮮味物質(zhì)代謝通路比較本實驗測定結(jié)果顯示連城白鴨胸肌肌苷酸含量較沔陽麻鴨高。肌苷酸在動物體內(nèi)可從頭合成，也可由游離嘌呤或嘌呤核苷經(jīng)簡單步驟合成。轉(zhuǎn)錄組未發(fā)現(xiàn)肌苷酸相關代謝通路在2 個品種間存在差異，僅發(fā)現(xiàn)肌苷酸合成相關的酶基因AMPD1在2 個品種間表達有顯著差異。AMPD1 是動物肌肉中由ATP 經(jīng)AMP 生成IMP 的關鍵酶。報道顯示，AMPD1易發(fā)生變異[16-18]，但其與鴨肉肌苷酸含量相關性還未見報道，值得進一步研究。

圖2 差異表達基因KEGG 信號通路富集散點圖

表4 連城白鴨高表達基因顯著富集的15 條信號通路

3.3 連城白鴨和沔陽麻鴨胸肌黑色素合成信號通路比較 連城白鴨呈現(xiàn)出“烏嘴烏腳”的外貌特征。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，連城白鴨和麻鴨胸肌黑色素合成通路（Melanogenesis）呈現(xiàn)顯著差異。連城白鴨胸肌中多個黑色素合成關鍵基因表達顯著高于沔陽麻鴨，如EDNRB2、MITF、KITLG基因。MITF是調(diào)控黑色素細胞發(fā)育的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，最近發(fā)現(xiàn)其變異可能是導致北京鴨白羽性狀的關鍵[19]，MITF在連城白鴨中差異表達可能導致不同部位的黑色素含量呈現(xiàn)顯著差異[20-21]。EDNRB2基因變異也會影響鴨羽毛中黑色素沉積[22]。KITLG編碼cKIT 激酶配體介導KITLG/cKIT，人KITLG基因突變會引起皮膚色素沉積異常[23]，表明連城白鴨體內(nèi)存在更多的黑色素沉積，連城白鴨烏嘴烏腳外觀特征可能和這些基因高表達有關。藥物本草中記載，烏骨雞藥用價值與皮膚和肌肉等組織中黑色素相關，連城白鴨中藥用價值是否與黑色素含量相關還需要進一步研究。

表5 麻鴨高表達基因顯著富集的15 條信號通路

表6 測序結(jié)果的qRT-PCR 驗證

3.4 連城白鴨和沔陽麻鴨藥類物質(zhì)代謝通路比較 連城白鴨藥物代謝相關通路（Drug metabolism-cytochrome P450）中MAOA、AOX、GST等基因表達顯著低于麻鴨，表明連城白鴨對體內(nèi)藥類物質(zhì)代謝能力較弱，有助于藥類物質(zhì)在體內(nèi)沉積。

?；撬峋哂星鍩峤舛镜淖饔肹24]，與連城白鴨的藥用價值較符合。陶正清[25]測定了鴨肉中19 種游離氨基酸，其中?；撬岷孔罡?。動物體內(nèi)牛磺酸一部分來自外源食物攝入，一部分在肝臟中通過蛋氨酸和半胱氨酸代謝的中間產(chǎn)物合成。本實驗中雖然2 種鴨胸肌組織中?；撬岽x通路（Taurine and Hypotaurine Metabolism）差異不顯著，但?；撬嵘锖铣申P鍵限速酶半胱亞磺酸脫羧酶基因CSAD在連城白鴨中表達顯著高于麻鴨，而牛磺酸分解相關的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因GGT在連城白鴨中表達顯著低于麻鴨，提示牛磺酸可能更容易在連城白鴨體內(nèi)沉積。有報道顯示連城白鴨牛磺酸含量達1.151%[1]，遠高于報道的豬牛雞肉0.03%～0.38% 的?；撬岷縖26]。因此，連城白鴨中?；撬岷铣纱x規(guī)律值得進一步研究。

4 結(jié) 論

連城白鴨和沔陽麻鴨都屬于優(yōu)質(zhì)地方鴨品種，本研究通過比較連城白鴨和沔陽麻鴨胸肌肉質(zhì)指標和轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)2 個品種肉質(zhì)存在一定差異。2 個品種胸肌脂肪、肌苷酸、氨基酸（賴氨酸、酪氨酸等）、維生素（A、B6等）、黑色素等信號通路都存在顯著差異，重要的物質(zhì)合成和代謝相關基因，如ACDC、FABP4、AMPD1、MITF、MAOA、CSAD作為地方鴨品種風味營養(yǎng)物質(zhì)沉積相關候選基因值得進一步研究。