郎倩倩，徐振強，張 燕，張德祥1,*

（1.華南農業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642；2.廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農業(yè)農村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東廣州 510640；3.廣東溫氏南方家禽育種有限公司，廣東新興 527400）

腹脂過度沉積已成為現(xiàn)代肉雞生產面臨的一個嚴峻問題[1]，對黃羽肉雞腹脂性狀的選擇方法目前主要有直接選擇、間接選擇和分子標記輔助選擇。研究顯示，腹脂重和腹脂率具有較高的遺傳力，對其進行直接選擇能夠取得較為理想的效果[2-3]，但直接選擇法測定難度大，較難推廣應用。間接選擇法主要是通過對與腹脂性狀相關性較強的其他性狀的選擇來達到間接選擇腹脂的目的，如體尺性狀、飼料報酬性狀等[4]。

雞的腹脂沉積是一個復雜的生理過程，與脂肪代謝有關的基因及其在脂肪沉積中的作用研究一直備受關注。在分子水平上挖掘與腹脂性狀相關的基因，找到一些分子標記，能為解決腹脂過度沉積問題提供一定依據。經過多年研究，學者們也發(fā)現(xiàn)了許多與腹脂性狀有關的基因。邵勇鋼等[5]研究表明A-FABP基因多態(tài)性與拜城油雞的腹脂性狀存在一定的相關性；李耀輝[6]研究發(fā)現(xiàn)，BMP6基因的2 個多態(tài)位點（g.64475440C＞T 和g.64474334G＞C）與試驗群體的腹脂重存在一定的相關性；薛倩等[7]研究表明甲狀腺激素應答蛋白Spot 14（THRSPα）基因中的C129T 和T160G 2 個突變位點與京海黃雞的腹脂性狀相關聯(lián)（P＜0.05 和P＜0.01）。以上研究發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點都能夠作為分子標記對腹脂性狀進行輔助選擇，進而為優(yōu)質雞的腹脂選擇提供相應的理論依據。

長鏈酯酰輔酶A 合成酶（ACSLs）是長鏈脂肪酸通過硫代酯化進而合成?；o酶A 衍生物所必需的酶，也是脂肪酸代謝的第一步[8]。哺乳動物ACSL 家族由ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5 和ACSL6 組成，其中ACSL1 是主要的異構體之一，主要存在于能量代謝組織中，在骨骼肌、肝臟和脂肪組織中都有表達，可以調節(jié)機體的能量代謝[9]。同時，ACSL1在脂肪酸的活化、轉運和降解以及脂類生成等過程中也至關重要[10]。有研究報道，ACSL1在心臟和脂肪組織β氧化過程中也發(fā)揮關鍵作用[11]。

綜合可知，ACSL1基因在脂類代謝中有著一定的作用[12]。故本研究在前人研究基礎上，采用PCR-直接測序技術對黃羽肉雞ACSL1基因（雞ACSL1基因位于4 號染色體上，全長37 027 bp，共有23 個外顯子）進行遺傳多態(tài)性分析，選出與腹脂性狀相關的SNP 位點，為黃羽肉雞腹脂性狀的分子標記選擇提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇1 日齡天露黃雞N409 品系共500只母雞，由廣東溫氏南方家禽育種有限公司提供。雞群飼養(yǎng)于廣東溫氏南方家禽育種有限公司肉雞試驗場，地面平養(yǎng)，飼養(yǎng)期105 d。全程按廣東溫氏南方家禽育種有限公司肉雞飼養(yǎng)模式進行。1～42 日齡飼喂黃小料，43～49 日齡由黃小料逐步向黃肉料過渡，50～105 日齡飼喂黃肉料。日糧營養(yǎng)水平見表1。飼養(yǎng)過程中淘汰僵雞、殘次雞，并記錄死淘雞只數(shù)量和翅號。

表1 日糧營養(yǎng)成分

1.2 實驗試劑 實驗試劑包括2×Easy Taq SuperMix，購自北京全式金生物技術有限公司；DEPC 處理水、離心管及槍頭購自上海生工生物工程技術服務有限公司；核酸染料，購自上海生工生物技術服務有限公司；DL 2000 DNA Ladder Marker，瓊脂糖（Agarose）購自普博生物技術有限公司；E.Z.N.ATM NRBC Blood DNA Kit 購自Omega 公司；無水乙醇購自廣州化學試劑廠。

50×TAE Buffer（pH 8.5）：稱量 242 g Tris，加ddH2O至約800 mL，充分溶解，加4 mL 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）和57.1 mL 冰醋酸，加ddH2O 至1 000 mL，貯存于室溫。

0.5mol/L EDTA（pH 8.0）：稱取168.1 g Na2EDTA·2H2O置于1L 的燒杯中；加入約800 mL 去離子水，充分溶解后用NaOH 調節(jié)pH 至8.0，然后加去離子水定容至1L 后高壓滅菌，室溫保存。

1.3 實驗儀器 Bio-Rad S1000 PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；Eppendorf 微量移液器，購自德國Eppendorf公司；電子分析天平購自德國Sartorius 公司；Rios 純水系統(tǒng)購自美國Millipore 公司；高壓滅菌鍋HV-85 購自HIR AYAMA 公司；微波爐購自廣州格蘭仕生活電器有限公司；小型高速離心機購自Eppendorf 公司；凝膠電泳儀購自BIO-RAD 公司；4℃冰箱購自SIEMENS 公司；-20℃低溫冰箱購自日本SANYO 公司；制冰機購自日本SANYO 公司；一次性注射器購自廣州竺祥生物科技有限責任公司；恒溫水浴鍋購自浙江臨海市東方儀器廠；XW-80 型漩渦混合器購自上海第一醫(yī)學院儀器廠；GDS-8000PC 凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP 公司。

1.4 測定方法 在105 日齡，測定500 只母雞的體重、體尺性狀（胸寬、骨盆寬、體斜長、脛長）。與此同時，用一次性醫(yī)用1.5 mL 注射器于翅下靜脈采血，將采得的1 mL 血樣裝入放有2%EDTA 的離心管中，與翅號對應，充分搖勻，并于-20℃冰箱中保存。采血完成后，進行屠宰實驗，測定全凈膛重、腹脂重、皮脂厚。所有指標的屠宰測定方法均根據《家禽生產性能名詞術語和度量統(tǒng)計方法》（NY/T 823-2004）執(zhí)行[12]。

1.5 血樣DNA 抽提 根據OMEGA 試劑盒血樣DNA提取說明書抽提DNA，并放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 引物設計合成 根據NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的紅色原雞ACSL1基因的序列（Gene ID：422547），利用Oligo7.0 軟件設計多對引物，用于擴增ACSL1基因的外顯子區(qū)（Exon），并送至北京六合華大基因科技股份有限公司合成引物。引物信息如表2 所示。

1.7 DNA 混池組建以及SNP 位點篩選 選取腹脂重兩尾的72 個個體，其中高腹脂的36 個個體隨機分成6 組，每組均為高腹脂，低腹脂的36 個個體也隨機分成6 組，每組均為低腹脂，總共有12 組混池。

對PCR 產物直接測序以檢測每組混池中的SNP 位點。所用試劑為2×Easy Taq SuperMix 和ddH2O，引物信息見表2，40 μL 混池擴增反應體系：2×Easy Taq SuperMix 20 μL、DNA 模板1 μL（50 ng/μL）、上下游引物各0.4 μL（0.1 μmol/L），ddH2O 補充至40 μL。

PCR 反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s；退火30 s；72℃延伸Y s（產物長度不同，延伸時間也不同，1 kb/min），36 個循環(huán)；72℃再延伸5 min；最后4℃保存，所有擴增反應均在S1000TM Thermal Cycler PCR儀中進行。

將擴增成功的產物送于測序公司進行測序，根據PCR 產物的測序結果，利用DNAStar 中的SeqMAN 程序進行序列和峰圖對比，篩選出SNP 位點，選取SNPs較豐富的片段進行SNPs 分型。

表2 引物信息

1.8 實驗群體SNP 位點的分型 根據1.7 的篩查結果，對引物ACSL1-17-18 擴增片段的SNPs 進行全部樣品篩查，實驗雞群反應體系與1.7 混池的擴增反應體系相同。

PCR 擴增程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s；55.3 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，36 個循環(huán)；72℃再延伸5 min；最后4℃保存，所有擴增反應均在S1000TM Thermal Cycler PCR 儀中進行。

將擴增成功的樣品送至測序公司進行測序，根據PCR 產物的測序結果，利用DNAStar 軟件的SeqMAN程序進行序列和峰圖對比，并記錄好分型結果。

1.9 基因與基因型頻率的計算和哈代-溫伯格檢驗 使用下列公式計算SNP 位點的等位基因頻率：

其中，F(xiàn)i表示SNP 位點等位基因I 的頻率，Aii和Aij分別表示各個品種內SNP 位點為純合（ii）和雜合（ij）的個體數(shù)，n 表示某個品種的個體數(shù)。哈代-溫伯格平衡檢驗采取卡方檢驗，使用Excel 軟件進行計算。

2 結果與分析

2.1 實驗群體基因組抽提結果 對500 只個體的血樣全部抽提DNA，所有DNA 經Thermo 核酸儀檢驗，最終將條帶清晰明亮、質量較好，濃度和純度均達到實驗要求的DNA 用于后續(xù)實驗。

2.2ACSL1基因SNPs 位點的篩選 初篩結果表明，第17～18 外顯子區(qū)域（1 295 bp）SNPs 位點較豐富，且測序結果較好，易于分型，故對這段區(qū)域進行全部樣品篩查。最終檢測到3 個SNP 突變位點（表3）。

表3 ACSL1 基因SNPs 突變位點

2.3ACSL1基因各位點的哈代-溫伯格平衡檢驗 對T32126C、C32013T、A31958G 這3 個位點進行分型，統(tǒng)計出這3 個SNPs 的基因型數(shù)量、等位基因頻率，并進行哈代-溫伯格平衡檢驗，結果如表4 所示，3 個SNPs 經檢驗后的P值都大于0.05，因此其基因頻率符合哈代-溫伯格平衡，說明該實驗群體足夠大且滿足隨機交配，并未發(fā)生突變、選擇和遷移。

表4 各SNPs 的基因型數(shù)、等位基因頻率和哈代-溫伯格平衡檢驗

2.4ACSL1基因SNPs 位點與各性狀的相關性分析 表5結果顯示，A31958G 位點與各個性狀都不相關（P＞0.05），但GG 型群體的全凈膛重顯著高于AG 型群體，與AA型群體差異不顯著。

表5 ACSL1 基因A31958G 位點與各性狀關聯(lián)分析

表6 結果顯示，T32126C 位點與活體重顯著相關，且該位點TC 型群體的活體重顯著高于TT 型群體與CC型群體，而TT 型群體與CC 型群體則差異不顯著。

由表7 可知，C32013T 位點與腹脂重和腹脂率存在很強的相關性（P＜0.01），且該位點TT 型群體的腹脂重與腹脂率都極顯著低于TC 型群體與CC 型群體，而TC 型群體與CC 型群體差異不顯著。

3 討 論

本研究以雞ACSL1基因為研究對象，通過擴增其外顯子區(qū)域并對其多態(tài)性進行研究，最終在第17～18 外顯子區(qū)域（1 295 bp）檢測到了T32126C、C32013T、A31958G 3 個SNP 突變位點。目前ACSL1基因在有關家畜育種中的研究多為基因多態(tài)性的檢測[13]，且在雞上的研究不多。岳碧娥等[14]通過檢測和測序證實ACSL1基因存在的2 個SNP 位點，可作為朗德鵝分子遺傳標記位點；本研究發(fā)現(xiàn)T32126C 突變位點對實驗群體的活體重有一定影響，C32013T 突變位點對實驗群體的腹脂重與腹脂率有顯著影響，而關于這2 個位點能否作為遺傳標記對黃羽肉雞的活體重與腹脂進行選擇，仍有待進一步驗證。

表6 ACSL1 基因T32126C 位點與各性狀關聯(lián)分析

表7 ACSL1 基因C32013T 位點與各性狀關聯(lián)分析

Li 等[15]研究表明ACSL1可能與豬的脂肪沉積能力和肉質有關。Widmann 等[16]研究表明ACSL1基因是牛骨骼肌脂肪酸組成的功能候選基因，且該基因可能在調節(jié)牛肉脂質組成中起著重要作用。這些研究結果都表明，ACSL1基因在脂肪代謝中起重要作用，本實驗首次發(fā)現(xiàn)的C32013T 位點與腹脂重和腹脂率存在很強的相關性，能夠為選擇低脂的優(yōu)質雞提供一定依據。曹陽[17]以綿羊ACSL1基因的序列信息為參考序列，對ACSL1基因多態(tài)性檢測結果表明，第2 外顯子的突變位點對部分脂肪酸及氨基酸含量有影響，而本研究首次發(fā)現(xiàn)的C32013T 位點位于ACSL1基因的第18 外顯子區(qū)域，為同義突變，并未造成氨基酸改變，該突變可能會改變mRNA 的剪切效率或準確性導致基因的轉錄活性發(fā)生變化，進而影響個體性狀。

李慶崗等[18]研究發(fā)現(xiàn)ACSL1基因的T 等位基因為該大白豬的優(yōu)勢基因，將TT 型個體留作種用能顯著減少豬的背膘厚度。本研究發(fā)現(xiàn)C32013T 位點中，TT型群體的腹脂重與腹脂率都極顯著低于TC 型群體與CC 型群體，而TC 型群體與CC 型群體差異不顯著，故將TT 型個體留作種用可能有助于減少黃羽肉雞的腹脂含量；T32126C 位點則與實驗群體的活體重呈顯著相關，且該位點TT 型群體與CC 型群體的活體重均顯著高于TC 型群體，但TT 型群體與CC 型群體差異不顯著，故將TT 型群體與CC 型群體留作種用可能會利于黃羽肉雞的增重。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)，黃羽肉雞ACSL1基因第17～18 外顯子區(qū)域（1 295bp）SNPs 位點較豐富，T32126C、C32013T、A31958G 這3 個位點的等位基因頻率符合哈代-溫伯格平衡，且A31958G 突變位點、T32126C 突變位點與腹脂重、腹脂率不相關，C32013T 突變位點對雞的腹脂重與腹脂率有顯著影響。故可以嘗試利用C32013T 突變位點對黃羽肉雞腹脂重進行分子標記輔助選擇。另外，雞ACSL1基因T32126C 突變位點對活體重有顯著影響，故該位點也能夠嘗試作為分子標記用于優(yōu)質雞的活體重選擇。