鄭 潔，謝曉紅*，雷 岷，鄺良德，張翔宇，李叢艷，楊 超，唐 麗，張翠霞，郭志強(qiáng)

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066）

隨著全球氣候日益變暖，近年來(lái)許多地區(qū)出現(xiàn)夏季持續(xù)高溫天氣。夏季高溫引起的動(dòng)物熱應(yīng)激導(dǎo)致其新陳代謝受損，生產(chǎn)性能降低，在極端條件下甚至死亡，成為困擾畜牧生產(chǎn)的一大難題。四川省作為全國(guó)肉兔生產(chǎn)第一大省，夏季氣溫更是突破了40℃。研究表明，熱應(yīng)激對(duì)肉兔的影響包括呼吸速率加快、免疫系統(tǒng)受損、抗氧化系統(tǒng)下降和繁殖性能降低等[1]。與其他動(dòng)物相比，公兔由于其低效的體溫調(diào)節(jié)機(jī)制[2]，導(dǎo)致對(duì)環(huán)境溫度更為敏感。當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到28℃以上，會(huì)引起公兔性欲下降、精液量減少、精子活力降低及精子畸形率升高，甚至?xí)簳r(shí)性不育，間接導(dǎo)致母兔受胎率降低[3]，降低肉兔生產(chǎn)能力，給養(yǎng)兔業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已用于研究湖羊[4]、雞[5]、鴨[6]等動(dòng)物與熱應(yīng)激相關(guān)的差異表達(dá)基因。但公兔熱應(yīng)激相關(guān)候選基因和途徑的研究很少。睪丸在雄性生殖系統(tǒng)中起著核心作用，作為精子發(fā)生部位，其精子發(fā)生過(guò)程涉及許多雄性生殖細(xì)胞特異性基因產(chǎn)物。此外，睪丸也是雄性動(dòng)物對(duì)不同溫度反應(yīng)最敏感的器官。齊興肉兔是四川省自主培育的第一個(gè)肉兔專(zhuān)門(mén)化品系，其較好的耐濕熱性是優(yōu)良特性之一[7]。本研究以齊興肉兔的睪丸為測(cè)序材料，構(gòu)建急性熱應(yīng)激處理下的公兔睪丸轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，篩選差異表達(dá)基因，挖掘公兔耐熱相關(guān)的候選基因，探究公兔在高溫環(huán)境中相關(guān)基因的表達(dá)及響應(yīng)熱應(yīng)激的分子機(jī)制，為耐熱性家兔的育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)前期對(duì)周邊環(huán)境、實(shí)驗(yàn)室、兔舍和飼養(yǎng)設(shè)備等進(jìn)行徹底消毒。選擇100 只齊興肉兔成年公兔建立實(shí)驗(yàn)群體，所有公兔單籠飼養(yǎng)，在相同條件和營(yíng)養(yǎng)水平下由專(zhuān)人飼喂，自由采食、自由飲水51 d 后（一個(gè)精子生成周期），選擇20 只公兔作為熱應(yīng)激組，置于人工氣候?qū)嶒?yàn)室，通過(guò)10:00—14:00 提高環(huán)境溫度至（37±1）℃，溫濕指數(shù)（THI）＞30，模擬四川夏季高溫高濕氣候，建立為期14 d 的熱應(yīng)激公兔睪丸精子發(fā)生模型。另外20 只作為對(duì)照組飼養(yǎng)在（24±1）℃，THI ＜27.8 的環(huán)控兔舍。14 d 后每組隨機(jī)選取4 只公兔（轉(zhuǎn)錄組測(cè)序）和12 只公兔（實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證）進(jìn)行屠宰，迅速采集睪丸組織放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 環(huán)境THI 測(cè)定 在人工氣候?qū)嶒?yàn)室及環(huán)控兔舍中部距地面15 cm 處掛置Apresys 179-TH 溫濕度記錄儀，設(shè)10 min 為間隔記錄試驗(yàn)期間溫度和濕度，利用Marai等[8]提出的THI 公式測(cè)定環(huán)境THI 指數(shù)：THI=db-[（0.31-0.31RH）（db-14.4）]，db 為溫度（℃），RH為相對(duì)濕度。

1.3 齊興肉兔睪丸RNA 提取 利用Trizol 法提取樣品總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和純度，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)總RNA 質(zhì)量，所提取的總RNA置于超低溫冰箱（-80℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 齊興肉兔睪丸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的cDNA 文庫(kù)構(gòu)建 對(duì)檢測(cè)合格的RNA 使用試劑盒去除rRNA，并將mRNA隨機(jī)打斷，在M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA 第1 條鏈，加入dNTPs（除了dTTP）、RNase H、DNA polymerase I 和緩沖液合成cDNA 第2 條鏈，純化后的雙鏈cDNA 經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加A 尾并連接測(cè)序接頭。采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，通過(guò)PCR 構(gòu)建鏈特異性文庫(kù)，利用llumina HiseqTM測(cè)序平臺(tái)完成高通量測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理與分析 對(duì)獲得的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）使用Trimmomatic 消除接頭和低質(zhì)量reads，得到有效數(shù)據(jù)（Clean reads）用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。根據(jù)差異基因的表達(dá)量利用DESeq 進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以qValue＜0.05 且差異倍數(shù)|FoldChange|＞1.4 為闕值，篩選熱應(yīng)激組和對(duì)照組公兔睪丸組織的全部差異基因。通過(guò)GO 功能分析確定差異表達(dá)基因使用的主要生物學(xué)功能，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析，篩選出與本研究相關(guān)的信號(hào)通路。

1.6 差異基因的實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證 參照GenBank 中公布的家兔HSPB1、CDK6和RAB37基因序列，利用Primer Primier5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成（表1）。采用2-ΔΔCt法對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 RT-PCR 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境THI 國(guó)際上按THI 將家兔熱應(yīng)激分為4 個(gè)等級(jí)：THI＜27.8 為無(wú)熱應(yīng)激，27.8≤THI＜28.9 為中等熱應(yīng)激，28.9≤THI＜30 為重度熱應(yīng)激，THI＞30 為極重度熱應(yīng)激。如圖1 所示，試驗(yàn)期間人工氣候?qū)嶒?yàn)室每日平均THI 指數(shù)均在27.8 以上，其中00:40—09:50 處于中度熱應(yīng)激，10:00—16:40 處于極重度熱應(yīng)激，16:50 至次日00:30 處于重度熱應(yīng)激；環(huán)控兔舍每日平均THI 均在27.8 以下，該條件下肉兔沒(méi)有處于熱應(yīng)激狀態(tài)。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間THI 指數(shù)

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控 對(duì)獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，平均每個(gè)樣品產(chǎn)出65 501 572 bp 原始數(shù)據(jù)（Raw reads）。使用Trimmomatic 消除接頭和低質(zhì)量reads，平均每個(gè)樣本得到63 968 046 bp 的有效數(shù)據(jù)（Clean reads），有效數(shù)據(jù)所占比例為97.66%，質(zhì)量超過(guò)Q30的堿基占過(guò)濾后序列的96.00%，GC 含量在56.06%。說(shuō)明熱應(yīng)激組和對(duì)照組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量好，獲得有效數(shù)據(jù)數(shù)量多，測(cè)序質(zhì)量好，符合進(jìn)一步生物信息學(xué)分析要求，見(jiàn)表2。

表2 過(guò)濾后的數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

2.3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì) 利用RNA-seq 技術(shù)檢測(cè)肉兔睪丸熱應(yīng)激組和對(duì)照組間差異表達(dá)基因，使用DESeq 進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以qValue＜0.05 且差異倍數(shù)|FoldChange|＞1.4 為闕值，熱應(yīng)激組與對(duì)照組相比765 個(gè)基因顯著上調(diào)，37 個(gè)下調(diào)（圖2）。

圖2 肉兔睪丸差異表達(dá)基因volcano-plot 分布圖

2.4 差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析 對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因做聚類(lèi)分析（圖3），結(jié)果顯示熱應(yīng)激組與對(duì)照組各樣本中高低表達(dá)水平的基因分別聚類(lèi)在一起。

圖3 差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析

2.5 差異表達(dá)基因GO 分析 對(duì)肉兔熱應(yīng)激組和對(duì)照組上調(diào)差異表達(dá)基因使用topGO 進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果見(jiàn)表3。按照GO 功能分類(lèi)方式分為3 大類(lèi)，包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能。上調(diào)差異基因富集到生物過(guò)程621 個(gè)基因，細(xì)胞組分682 個(gè)基因，分子功能560 個(gè)基因，就生物過(guò)程而言，其中生物過(guò)程類(lèi)中細(xì)胞過(guò)程（Cellular Process）所占比例最高，有538 個(gè)，其次是生物調(diào)節(jié)（Biological Regulation）（圖4）；在細(xì)胞組分類(lèi)中細(xì)胞（Cell）所占比例最高，有600 個(gè)，其次是細(xì)胞部分（Cell Part）；在分子功能類(lèi)中結(jié)合（Binding）所占比例最高，有531 個(gè)，其次是離子結(jié)合（Ion Binding）。

下調(diào)差異基因富集到生物過(guò)程26 個(gè)基因，細(xì)胞組分29 個(gè)基因，分子功能23 個(gè)基因，其中在生物過(guò)程類(lèi)中同樣是細(xì)胞過(guò)程（Cellular Process）所占比例最高，有20 個(gè)，其次也是細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)（Regulation of Cellular Process）、調(diào)節(jié)生物過(guò)程（Regulation of Biological Process）和生物調(diào)節(jié)（Biological Regulation）；細(xì)胞組分類(lèi)中細(xì)胞（Cell）和細(xì)胞部分（Cell Part）所占比例最高，各有26 個(gè)，其次是細(xì)胞內(nèi)（Intracellular）；在分子功能類(lèi)中同樣是結(jié)合（Binding）所占比例最高，有17 個(gè)，其次也是離子結(jié)合（Ion Binding）（圖5）。

表3 注釋到該GO 下的差異表達(dá)基因數(shù)目

2.6 差異表達(dá)基因KEGG 分析 使用clusterProfiler 對(duì)差異顯著基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得到511 條通路，其中主要富集于細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、胞吞作用、PI3K-Akt 信號(hào)通路、核糖體、細(xì)胞黏附分子（CAMs）、MAPK 信號(hào)通路等通路（圖6）。

2.7 熱應(yīng)激下精子發(fā)生差異表達(dá)基因的RT-PCR 初步驗(yàn)證 通過(guò)對(duì)表達(dá)基因篩選、功能注釋和富集分析后，篩選出HSPB1、CDK6和RAB37等3 個(gè)與參與應(yīng)激反應(yīng)、精子生成有關(guān)的基因進(jìn)行熒光定量PCR 檢驗(yàn)（圖7）。其中HSPB1為上調(diào)差異表達(dá)基因，CDK6、RAB37為下調(diào)差異表達(dá)基因，且定量結(jié)果與RNA-seq 結(jié)果趨勢(shì)一致。證明轉(zhuǎn)錄組在篩選差異表達(dá)基因方面的可靠性。

3 討 論

圖4 上調(diào)差異表達(dá)基因GO 富集分析

圖5 下調(diào)差異表達(dá)基因GO 富集分析

哺乳動(dòng)物為獲得最佳的精子發(fā)生，通常睪丸溫度需要比體溫低2～5℃[9]。適宜的溫度是精子發(fā)生的必要條件。當(dāng)外界環(huán)境溫度過(guò)高時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的熱量超過(guò)散發(fā)的熱量就會(huì)產(chǎn)生熱應(yīng)激。Nizza 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激導(dǎo)致公兔性欲降低（射精時(shí)間從23.6 s 延長(zhǎng)至25.3 s），并對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生負(fù)面影響。Maria 等[11]研究表明，熱應(yīng)激條件下，精子活力、精子曲線速度、精子平均速度以及代謝活性顯著低于常溫組。郭振慧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激導(dǎo)致公兔睪丸組織萎縮，曲細(xì)精管生精上皮細(xì)胞明顯減少，中央管腔增大，初級(jí)精母細(xì)胞排列疏松，空間增大，精子數(shù)量明顯減少。唐良美[13]報(bào)道，齊興兔精子活力在6—10 月仍保持在0.8 以上，而外血親本兔的精子活力則隨氣溫升高而下降，且精子密度一直低于齊興兔。

隨著動(dòng)物抗性育種的發(fā)展，耐熱性被認(rèn)為是能遺傳的。篩選與鑒定耐熱性相關(guān)的候選基因?qū)⒂兄谶x育抵御熱應(yīng)激的優(yōu)良品種[14]。本研究對(duì)齊興肉兔睪丸組織熱應(yīng)激組和對(duì)照組的cDNA 文庫(kù)進(jìn)行分析，共檢測(cè)到已注釋765 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，37 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選、功能注釋和富集分析后發(fā)現(xiàn)，參與熱應(yīng)激反應(yīng)和精子生成的基因熱休克蛋白B1（HeatshockproteinB1，HSPB1）在熱應(yīng)激組表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)型激酶6（Cyclin-Dependent Kinase 6，CDK6）和RAB37 在熱應(yīng)激組表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。

圖6 差異表達(dá)基因KEGG 富集分析

圖7 差異表達(dá)基因RT-PCR 驗(yàn)證分析

HSPB1 又稱(chēng)HSP25/HSP27，是第1 個(gè)在哺乳動(dòng)物中被證實(shí)的小分子熱休克蛋白[15]。HSPB1 活化后與肌節(jié)的結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞骨架結(jié)合，可增加對(duì)熱應(yīng)激的耐受性[16]。熱休克蛋白是否能被正常激活取決于其對(duì)熱應(yīng)激的耐受性是否形成。在雄性生殖系統(tǒng)中，HSPB1 廣泛存在于支持細(xì)胞、精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞[17-18]，參與生精細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的增殖、分化及凋亡等調(diào)控作用[19-20]。睪丸受到熱應(yīng)激壓力時(shí)，使HSPB1 過(guò)表達(dá)從而使精子細(xì)胞凋亡受到抑制，起到保護(hù)作用[21]。當(dāng)HSPB1 受到抑制，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化性降低[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，齊興肉兔熱應(yīng)激組睪丸組織中HSPB1 高于對(duì)照組，說(shuō)明其在熱應(yīng)激環(huán)境中激活了抗熱應(yīng)激的防御體系。

以往研究發(fā)現(xiàn)，CDK6 表達(dá)量降低會(huì)影響精子發(fā)生過(guò)程，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1 期，導(dǎo)致精子數(shù)量減少、精子活力降低和精子畸形率增加[23-24]。本研究中齊興肉兔睪丸組織熱應(yīng)激組中CDK6 顯著降低，這說(shuō)明熱應(yīng)激過(guò)程中CDK6 受到抑制，可能阻止了G 期到S 期轉(zhuǎn)換，引起細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡。

哺乳動(dòng)物精子在精卵結(jié)合前必須要經(jīng)過(guò)獲能和頂體反應(yīng)過(guò)程。頂體反應(yīng)的發(fā)生標(biāo)志著精子獲能過(guò)程的完成。RAB37 屬于分泌蛋白，位于各種分泌細(xì)胞的囊泡和分泌顆粒中，對(duì)胞吞過(guò)程有直接的調(diào)控作用[25]。Peddinti 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，RAB37 蛋白存在于精子蛋白質(zhì)組，參與牛的精子頂體反應(yīng)。本研究中齊興肉兔睪丸組織熱應(yīng)激組中RAB37 顯著低于對(duì)照組，推測(cè)RAB37 在齊興肉兔精子頂體反應(yīng)中起重要作用。

此外，核糖體、細(xì)胞黏附分子（CAMs）等通路檢測(cè)到一些差異表達(dá)基因，其在睪丸生理生殖活動(dòng)中的作用還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)齊興肉兔睪丸組織熱應(yīng)激組和對(duì)照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，檢測(cè)基因表達(dá)的差異及相關(guān)的信號(hào)通路，篩選出HSPB1、CDK6 和RAB37 與熱應(yīng)激反應(yīng)、精子生成有關(guān)的基因，為豐富齊興肉兔睪丸組織轉(zhuǎn)錄組信息提供數(shù)據(jù)，為改善肉兔耐熱性及耐熱性家兔的育種提供理論基礎(chǔ)。