王子博，呂文娟，趙新顏，趙雨晴，李一珉，胡春紅*

1.天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，天津 300070；2.天津市胸科醫(yī)院，天津 300222；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；*通訊作者 胡春紅 chunhong_hu@hotmail.com

肝纖維化是肝臟對慢性損傷的一種愈合反應(yīng)，會導(dǎo)致纖維面積不斷增加，肝臟表面紋理和內(nèi)部血管結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化[1-4]。肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)、消退的動態(tài)過程，持續(xù)發(fā)展會演變?yōu)楦斡不踔粮伟?，引起門靜脈高壓、腹水等并發(fā)癥，很難再逆轉(zhuǎn)和治愈[5-6]。因此，研究肝纖維化的發(fā)展與逆轉(zhuǎn)過程中肝臟的膠原沉積和表面形變程度等顯微病理特征，有利于從形態(tài)學(xué)角度探究肝纖維化的病理機(jī)制。

目前，肝活檢等組織病理方法是研究肝纖維化微結(jié)構(gòu)變化的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該技術(shù)取樣面積小，存在取樣誤差，對組織有破壞性。X線、CT、超聲、MRI等影像學(xué)檢查的空間和襯度分辨率較低，無法反映肝組織內(nèi)的細(xì)微病理變化。X線相位襯度成像簡稱相襯成像，通過記錄X線穿透物體后相移信息的變化成像，解決了生物軟組織的微觀成像問題[7-8]。衍射增強(qiáng)成像（diffraction-enhanced imaging，DEI）是一種典型的相襯成像，其襯度機(jī)制主要來自于樣品對X 射線的吸收、折射和小角散射作用，能夠提高圖像的襯度分辨率和空間分辨率[9]。本研究擬利用DEI 的優(yōu)勢，對肝纖維化發(fā)展及逆轉(zhuǎn)不同階段的微觀結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，從而為肝纖維化的輔助分析和病理機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 肝纖維化動物模型制備和分組 54只清潔級BALB/c 小鼠，體重20～30 g。實驗前，小鼠按簡單隨機(jī)化方法分為正常組6只和實驗組48只。實驗組小鼠經(jīng)腹腔注射40% CCl4橄欖油渾濁液（CCl4∶橄欖油=2 ml∶5 ml）0.2 ml/100 g，每周2次，正常組僅注射相同劑量的橄欖油。所有小鼠均于20～25℃、40%～70%濕度的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，采取相同的喂養(yǎng)方式，自由飲水并飼喂標(biāo)準(zhǔn)飲食。實驗組小鼠注射CCl4橄欖油渾濁液42 d，并于停止注射后自發(fā)逆轉(zhuǎn)45 d。于0 d，注射后8、14、21、42 d 及逆轉(zhuǎn)8、18、35、45 d 各取6只小鼠肝臟組織固定于中性福爾馬林溶液中。成像前將樣品從福爾馬林溶液中取出，自然干燥12 h 行DEI，隨后將樣品放回福爾馬林溶液中待病理檢查。本實驗研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，樣品處理過程符合動物倫理委員會規(guī)則。

1.2 DEI 實驗裝置和數(shù)據(jù)采集 DEI 實驗在北京同步輻射裝置4W1A 形貌成像實驗站DEI 裝置上進(jìn)行。實驗裝置的主要元件單色器晶體和分析晶體均選用Si(111)晶面。本實驗所用X 射線探測器像素大小10.9 μm×10.9 μm，X 射線光能量15 keV，分析晶體轉(zhuǎn)臺旋轉(zhuǎn)角度精度為0.05 s，分析晶體角度旋轉(zhuǎn)步長為0.5°/s。

1.3 病理檢查 DEI 實驗后，肝臟樣品行常規(guī)脫水、石蠟包埋、4 μm 厚切片，隨后行天狼星紅染色，于光學(xué)顯微鏡下采集病理圖像。每組分別隨機(jī)選取不重疊的20 張切片作為感興趣區(qū)，使用Image Pro Plus 6.0軟件計算切片的膠原面積比，即膠原面積與整張切片中肝臟樣品總面積的比值。由1名具有10年以上臨床經(jīng)驗的肝臟病理科副主任醫(yī)師采用盲法分析病理圖像。

1.4 肝臟表面紋理分析 纖維化肝臟由于受到膠原沉積影響，不僅血管形態(tài)結(jié)構(gòu)及數(shù)量發(fā)生改變，肝臟表面形態(tài)也會發(fā)生改變，表現(xiàn)為肝表面粗糙度增加并分布不均。為了定量分析肝纖維化動態(tài)發(fā)展和逆轉(zhuǎn)不同階段的肝表面粗糙程度，每組隨機(jī)挑選24個大小為100×100 像素的肝臟表面圖像作為感興趣區(qū)，然后對感興趣區(qū)進(jìn)行灰度共生矩陣紋理分析。選取的紋理參數(shù)包括慣量、逆差矩、差的均值、差的熵。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用成組資料t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料比較采用K檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化病理表現(xiàn) 正常肝臟中可見清晰的肝小葉結(jié)構(gòu)（圖1A），肝組織紋理均勻，僅在匯管區(qū)有少量膠原纖維沉積。隨著纖維化加劇，中央靜脈周圍膠原纖維開始增多，間質(zhì)細(xì)胞增多，肝細(xì)胞發(fā)生脂變，并發(fā)生再生，炎癥細(xì)胞逐漸集中在鈣化處，有一定的鈣鹽沉積現(xiàn)象，肝纖維化程度逐漸增加（圖1B～E）。肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中可以觀察到纖維隔逐漸減少，膠原逐漸變細(xì)，呈斷續(xù)形態(tài)，肝纖維化程度隨逆轉(zhuǎn)時間增加逐漸下降（圖1F～I(xiàn)）。正常組膠原纖維僅少量存在于匯管區(qū)周圍且比較纖細(xì)。實驗組中，隨著CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)展，膠原纖維向肝實質(zhì)內(nèi)不斷延伸，肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，膠原變粗，膠原纖維大量沉積在增生的脈管周圍，停止誘導(dǎo)后，膠原纖維逐漸被降解而變細(xì)，肝細(xì)胞出現(xiàn)再生。

圖1 肝纖維化發(fā)展及逆轉(zhuǎn)不同時期天狼星紅病理切片及膠原面積比的比較。正常肝臟無膠原沉積出現(xiàn)（×40，A）；造模8、14、21、42 d肝臟病理鏡下示膠原沉積隨時間不斷增加（×40，B～E）；逆轉(zhuǎn)8、18、35、45 d肝臟病理鏡下示膠原沉積開始逐漸減少（×40，F(xiàn)～I(xiàn)）；J為不同時期膠原面積比的比較

為了定量表征膠原纖維隨著肝纖維化程度的動態(tài)變化，對不同組別的切片進(jìn)行膠原面積比分析（圖1J），結(jié)果顯示正常組膠原面積比為（0.12±0.04）%，造模8 d、14 d、21 d、42 d 膠原面積比逐漸升高，分別為（0.51±0.20）%、（1.28±0.07）%、（1.73±0.21）%、（3.35±0.87）%；而逆轉(zhuǎn)8 d、18 d、35 d、45 d 膠原沉積情況減輕，膠原面積比逐漸減少，分別為（2.77±0.49）%、（2.13±0.60）%、（1.65±0.17）%、（1.16±0.17）%。逆轉(zhuǎn)45 d 時膠原面積比未降低到正常水平。造模42 d 和逆轉(zhuǎn)8 d、逆轉(zhuǎn)8 d 和逆轉(zhuǎn)18 d膠原面積比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余不同組間膠原面積比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 肝臟表面紋理分析 肝纖維化樣本受膠原增生的影響，肝臟除血管發(fā)生形態(tài)學(xué)改變及血管數(shù)量改變外，肝臟表面也表現(xiàn)為粗糙不平，呈現(xiàn)波浪狀或花邊狀（圖2）。

圖3為肝纖維發(fā)展及逆轉(zhuǎn)過程中樣品DEI 感興趣區(qū)圖像。隨著病變加劇，肝臟表面逐漸粗糙不均勻，有明顯凹凸不平現(xiàn)象，其中，造模42 d 凸起之間出現(xiàn)溝壑最明顯，界限清晰。隨著肝纖維化逆轉(zhuǎn)，肝臟表面粗糙程度下降，表面凹凸不平現(xiàn)象逐漸改善。利用灰度共生矩陣對肝臟表面進(jìn)行分析，定量結(jié)果見圖4，正常、纖維化、逆轉(zhuǎn)樣品的紋理特征參數(shù)慣量、逆差矩、差的均值及差的熵等均有顯著差異（表1）。從正常樣品到造模8 d、14 d、21 d、42 d 樣品，逆差矩值逐漸變小，慣量、差的均值及差的熵均逐漸變大，從造模42 d 到逆轉(zhuǎn)8 d、18 d、35 d、45 d，逆差矩值逐漸變大，慣量、差的均值及差的熵均逐漸變小。正常組和造模8 d、逆轉(zhuǎn)35 d 和逆轉(zhuǎn)45 d組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其他各組間灰度共生矩陣數(shù)值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），紋理特征分析結(jié)果與DEI 圖像直觀紋理觀察一致。

圖2 肝纖維發(fā)展及逆轉(zhuǎn)不同時間DEI 圖像。正常肝臟示肝組織紋理結(jié)構(gòu)均勻，血管壁光滑，走行自然，血管樹狀結(jié)構(gòu)清晰，分支清楚有層次，血管由粗漸細(xì)結(jié)構(gòu)勻稱（A）；造模8 d DEI 顯示組織紋理結(jié)構(gòu)改變不明顯，但血管的變形清晰可見（B）；造模14 d、21 d 可見組織紋理結(jié)構(gòu)粗糙，血管形變清晰，小血管的膨脹或收縮變化尤為顯著（C、D）；造模42 d 圖像呈極不規(guī)則的紋理結(jié)構(gòu)，大血管和小血管的變形均更加明顯（E）；逆轉(zhuǎn)8、18、35、45 d 肝臟示紋理逐漸清晰，血管變形程度不斷減輕（F～I(xiàn)）

圖3 肝纖維化發(fā)展及逆轉(zhuǎn)不同時間點(diǎn)肝臟表面紋理。正常肝臟表面光滑（A）；造模8、14、21、42 d肝臟，隨著病變加劇，肝臟表面逐漸粗糙不均勻（B～E）；逆轉(zhuǎn)8、18、35、45 d肝臟，肝臟表面隨著逆轉(zhuǎn)變得逐漸光滑均勻（F～I(xiàn)）

3 討論

肝纖維化的發(fā)展和逆轉(zhuǎn)均是動態(tài)的，整個過程中伴隨膠原纖維沉積和降解、微血管數(shù)量增多和減少、血管形態(tài)扭曲和緩解等[10-11]。目前，臨床上觀察肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”是病理切片分析，如通過狼紅染色可以清晰地觀察膠原沉積情況，但對于肝臟表面病理僅能顯示線狀輪廓。臨床常用的影像學(xué)方法可以實現(xiàn)肝臟成像，但是由于分辨率等局限性，很難觀察到肝纖維化的微觀病變[12-13]。DEI基于相位信息的改變進(jìn)行成像，可以顯示肝臟組織的微觀結(jié)構(gòu)。另外，結(jié)合計算機(jī)輔助圖像分析，利用相應(yīng)指標(biāo)可以對肝臟內(nèi)病變進(jìn)行定量評估。

在肝纖維化發(fā)展過程中，肝臟內(nèi)部最明顯的改變是膠原沉積。通過病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化的發(fā)展，膠原面積比增大，并逐漸分割肝小葉形成假小葉結(jié)構(gòu)。逆轉(zhuǎn)后，膠原面積下降，膠原纖維開始降解并表現(xiàn)出斷續(xù)的狀態(tài)，但無法恢復(fù)到正常狀態(tài)。膠原纖維的改變對肝臟表面的形變會產(chǎn)生比較大的影響，肝實質(zhì)被增生的膠原擠壓，牽拉肝臟表面使其變得凹凸不平。肝臟表面粗糙程度隨著肝纖維化發(fā)展和逆轉(zhuǎn)發(fā)生巨大變化，正常肝臟表面光滑，隨著肝纖維化發(fā)展，肝臟表面呈現(xiàn)結(jié)節(jié)狀起伏，與正常組織有明顯區(qū)別，發(fā)生逆轉(zhuǎn)后表皮粗糙程度改善，最終恢復(fù)到接近中度纖維化的狀態(tài)。紋理分析結(jié)果表明，肝纖維化發(fā)展及逆轉(zhuǎn)不同階段的肝臟表皮的粗糙程度有顯著差異，肝臟表面的粗糙程度與肝纖維化的發(fā)展關(guān)系緊密，可作為肝纖維化發(fā)展程度的潛在評價指標(biāo)。

圖4 各組肝纖維化樣品慣量、逆差矩、差的均值、差的熵隨疾病進(jìn)程的變化趨勢

表1 各組肝表面紋理特征參數(shù)（±s）

表1 各組肝表面紋理特征參數(shù)（±s）

組別只數(shù)慣量逆差矩差的均值差的熵正常組 6 1.4416±0.1594 0.6187±0.0334 0.8735±0.0801 0.7815±0.0369造模組6造模8 d 1.5854±0.2623 0.6032±0.0251 0.9216±0.0822 0.8124±0.0679 0.8696±0.0760造模21 d 2.1937±0.4016 0.5454±0.0278 1.1150±0.1084 0.9480±0.0786造模14 d 1.8312±0.3311 0.5762±0.0249 1.0061±0.0926 1.2480±0.0933逆轉(zhuǎn)組 6造模42 d 4.1962±0.7984 0.4480±0.0269 1.5642±0.1487 1.1262±0.0620逆轉(zhuǎn)18 d 2.6246±0.6807 0.5145±0.0374 1.2335±0.1633 1.0241±0.1068逆轉(zhuǎn)8 d 3.2154±0.4170 0.4827±0.0233 1.3741±0.1005 0.9190±0.1127逆轉(zhuǎn)45 d 1.8235±0.6248 0.5834±0.0592 0.9916±0.1967 0.8522±0.1556逆轉(zhuǎn)35 d 2.0946±0.5609 0.5611±0.0349 1.0697±0.1395

本研究重點(diǎn)利用DEI 技術(shù)，以病理切片為輔助手段，對肝纖維化發(fā)展和逆轉(zhuǎn)過程中的膠原面積和表面形態(tài)進(jìn)行動態(tài)觀察，為肝纖維化病變特點(diǎn)提供了更加全面的認(rèn)識。然而，本研究也存在一定的局限性，實驗樣品是小鼠離體組織，如果使用活體組織則能更接近生理狀態(tài)。盡管對實驗結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，肝臟表面粗糙程度和膠原纖維沉積狀態(tài)呈相同的發(fā)展趨勢，但肝臟表面變化和膠原增生之間的相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究基于CCl4肝纖維化模型，在不加造影劑的情況下，利用DEI 清楚地展現(xiàn)了肝纖維化正常、發(fā)展及逆轉(zhuǎn)不同時期的病理變化，并對肝臟表面紋理變化和粗糙程度進(jìn)行相應(yīng)的定量分析。因此，DEI可以作為評估肝纖維化程度的一種新方法，有望在肝臟疾病的早期診斷和治療中發(fā)揮重要作用。