田毅，李巨波，張寶杰，魏紅星，張曉麗

1.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院核醫(yī)學科，北京 100029；2.中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，國家心血管病中心，阜外醫(yī)院動物實驗中心，北京 100037；3.中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，國家心血管病中心，阜外醫(yī)院核醫(yī)學科，北京 100037；*通訊作者 魏紅星 weihongxing@263.net

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后早期梗死區(qū)域可發(fā)生持續(xù)的炎癥反應，主要包括2個發(fā)展階段，第一階段的高峰在AMI后最初數(shù)小時到數(shù)天內，以中性粒細胞浸潤為主，主導壞死心肌的清除；第二階段的高峰在AMI后3～10 d，以巨噬細胞浸潤為主，主導心肌修復[1-3]。近年研究表明AMI后的炎癥反應，特別是第二階段的炎癥反應與左心室重構和預后有關[4-5]。因此，建立與人類接近的AMI 炎癥動物模型，通過分子顯像結合病理分析評估AMI后的炎癥反應進程，對于明確AMI后炎癥反應的潛在病理生理學機制、建立精準的臨床急性心肌梗死干預方法具有重要意義。

與小動物相比，大動物AMI后炎癥反應更強烈，持續(xù)時間更長，更接近患者的AMI 炎癥反應狀態(tài)[6]。在各種常見大動物中，豬的心臟解剖結構及心率、凝血因子和纖溶活性等心臟生理指標與人的心臟尤為接近，且在進行AMI 建模過程中心肌梗死面積大小具有較高的可控性。

在炎癥反應評價方面，由于活化后的炎癥細胞糖酵解速度和細胞膜表面的葡萄糖轉運體（glucose transporters，GLUTs）數(shù)量增加，因此炎癥反應部位葡萄糖代謝活性可以反映炎癥反應的程度，18F-FDG PET/CT 作為無創(chuàng)的葡萄糖代謝顯像技術，能夠較好地評價炎癥反應[7-9]。

本研究擬建立中華小型豬AMI 炎癥模型，并采用病理分析及18F-FDG PET/CT評價是否建模成功，以期提供用于AMI后炎癥反應臨床轉化研究的模型建立和評價的可靠方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康中華小型豬15只[天津市百農實驗動物繁育科技有限公司（合格證號：No.12002600000321）]，6月齡，體重25～30 kg，雌雄不限，飼養(yǎng)環(huán)境和實驗環(huán)境均為普通級。按簡單隨機抽樣法分為AMI組、正常對照組和假手術組，每組5只。實驗豬建模后，待麻醉恢復正常后送回適宜恒定溫度和濕度的飼養(yǎng)間，每只飼養(yǎng)在固定的籠具中，每天給予2次適量的常規(guī)飼料喂養(yǎng)，通過自動飲水系統(tǒng)自動飲水。本實驗根據赫爾辛基宣言使用動物并對動物進行護理。動物實驗倫理批準號ZH16002。嚴格遵守《北京實驗動物管理條例》及歐洲實驗動物監(jiān)護指南。

1.2 儀器 C 型臂X線機（OEC9900，通用電氣）；心電圖儀（BeneHeart R3A，深圳市邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；SPECT/CT（Symbia Intevo16，西門子）；冠狀動脈球囊擴張導管（NC Trek RX Coronary Dilatation Catheter）等。

自制栓子：將球囊于1/2 處截斷，取直徑適合的凝膠海綿置入球囊前段內，并檢查確定其穩(wěn)固性。凝膠海綿可于冠狀動脈內吸收血液形成血栓，達到充分且永久地封堵冠狀動脈的效果。

1.3 動物模型制作 使用經皮冠狀動脈球囊結合凝膠海綿聯(lián)合栓塞法制作AMI模型。具體操作步驟：實驗豬禁食12 h后，肌注舒泰1.25 mg/kg 行誘導麻醉。于耳緣靜脈建立靜脈通路，行氣管插管，連接呼吸機及心電監(jiān)護儀，全程監(jiān)測心率、血壓、脈搏血氧、呼吸頻率等生命體征。通入異氟烷維持麻醉。將豬仰臥位置于實驗臺上，給予肝素200 μl/kg 抗凝，右側腹股溝備皮，常規(guī)消毒后鋪巾，動脈穿刺后置入6F下肢鞘管。采用左前斜位（45°），在C 型臂X線機透視下經鞘管將指引導管插入動脈，通過造影導絲導引指引導管至升主動脈，退出導絲，再次導引指引導管依次進入左冠狀動脈竇、左主干、左前降支（left anterior descending artery，LAD）開口處，使導管開口與冠狀動脈開口同軸。注入碘普羅胺注射液行冠狀動脈造影，定位第一對角支，將指引導絲通過指引導管小心插入冠狀動脈左前降支遠端，再沿導絲推送自制球囊至第一對角支以下約1～2 mm 處。退出導絲及球囊，留置前半部自制栓子于此位置。5 min后造影確認阻斷血流后，再依次退出導管及鞘管，按壓主動脈止血后結束手術。假手術組除不使用栓子進行血流阻斷外，其余操作均與AMI組一致。正常對照組不做特殊處理。

1.4 心肌灌注顯像 采用99Tcm-MIBI 心肌灌注顯像評價實驗豬手術前后心肌血流灌注情況，驗證AMI模型是否成功，并明確心肌梗死部位。采用Siemens Symbia T16 型雙探頭SPECT/CT 儀。顯像前禁食、禁水 12 h，常規(guī)麻醉實驗豬后，經耳緣靜脈注射99Tcm-MIBI 370 MBq，45 min后取仰臥位置于檢查床上，采集斷層圖像。采集條件：低能高分辨準直器，兩探頭夾角90°，能峰140 keV，窗寬±20%，采集時間35 s/幀，6°/幀。采用Butterworth 濾波器（截止頻率0.35 cycles/cm 和階數(shù)5.0）進行濾波反投影圖像重建，圖像矩陣大小128×128，放大倍數(shù)1.45。

1.518F-FDG 顯像 采用高脂低碳餐+禁食+肝素的方法抑制實驗豬心肌生理性攝取[10]。顯像前1 d 給實驗豬喂食高脂低碳餐，隨后禁食12 h。常規(guī)麻醉后，靜脈注射肝素50 IU/kg，15 min后靜脈注射18F-FDG 6～8 MBq/kg，1 h后仰臥位置于PET/CT檢查床（Siemens Biograph 64 型PET/CT 儀）。采集胸部CT用于衰減校正（CT 采集參數(shù)，管電壓120 kV、管電流10 mA）和解剖定位，隨后進行心臟PET 采集，時長10 min。采用3D-OSEM（子集個數(shù)21，迭代次數(shù)2）方法對PET/CT圖像進行重建。用MedEx 軟件對PET/CT圖像進行定量分析。在心肌前壁（AMI組梗死區(qū)）勾畫感興趣區(qū)，獲取最大標準化攝取值（SUVmax）。假手術組和AMI組實驗豬于術后第5天行PET/CT檢查（圖1）。

圖1 實驗流程。AMI組和假手術組分別于術前1 d 行99Tcm-MIBI 心肌灌注顯像，術后5 d 行99Tcm-MIBI 心肌灌注顯像和18F-FDG PET/CT 代謝顯像，正常對照組在AMI組和假手術組術后5 d 行 99Tcm-MIBI 心肌灌注顯像和 18F-FDG PET/CT 代謝顯像，顯像完成后即刻在麻醉狀態(tài)下處死實驗豬

1.6 組織學分析 顯像完成后即刻在麻醉狀態(tài)下處死實驗豬，快速取出心臟，并用生理鹽水沖洗。在左心室靠近中間的部位取前壁（AMI組梗死區(qū)）心肌組織，用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成5 μm 厚切片。用HE 染色和馬松染色觀察心肌組織形態(tài)學改變，采用免疫組化法鑒別CD68+巨噬細胞及GLUT-1、GLUT-3和GLUT-4 的表達。使用光學電子顯微鏡觀察切片。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0 軟件，計量資料經Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗均符合正態(tài)分布，以±s表示。3組18F-FDG 攝取值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物模型驗證 AMI組實驗豬造模前后心電圖、血管造影及心肌灌注顯像見圖2。造模術前心電圖正常，術后心電圖顯示對應胸部導聯(lián)均產生AMI 典型改變，包括前壁導聯(lián)ST 段弓背型抬高、對側心室壁導聯(lián)ST段壓低等。血管造影示術前冠狀動脈血流正常，術后前降支栓塞部位遠端無造影劑通過。心肌灌注圖像顯示術前左心室各壁心肌示蹤劑分布均勻，未見示蹤劑攝取減低或缺損區(qū)，提示左心室各壁心肌血流灌注正常。術后圖像顯示前降支支配區(qū)域心尖和前壁呈示蹤劑攝取缺損區(qū)，提示左心室心尖和前壁心肌梗死。

HE 和馬松染色顯示正常對照組和假手術組心肌細胞結構完整，排列整齊。AMI組梗死區(qū)顯示大量心肌細胞壞死，細胞排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤及膠原蛋白沉積（圖3）。

圖2 AMI組實驗豬球囊擴張術前和術后心電圖、血管造影及心肌灌注顯像圖。術前心電圖正常（A），術后心電圖示前壁導聯(lián)ST 段弓背型抬高，對側心室壁導聯(lián)ST 段壓低（B）；血管造影示術前冠狀動脈血流正常（C）；術后前降支栓塞部位（箭）遠端無造影劑通過（D）；心肌灌注圖像示術前左心室各壁心肌血流灌注正常（E）；術后心尖和前壁呈示蹤劑攝取缺損區(qū)，提示左心室心尖和前壁心肌梗死（箭，F(xiàn)）

2.218F-FDG 攝取 通過禁食聯(lián)合高脂低碳餐和靜脈注射肝素的方法，15只實驗豬正常心肌的生理性攝取均被充分抑制。18F-FDG PET/CT圖像和對應的半定量分析見圖4。PET/CT圖像示正常對照組和假手術組均未見明顯18F-FDG 攝取。AMI組心尖和前壁（圖2所示的血流灌注減低區(qū)）18F-FDG 攝取明顯增高。AMI組SUVmax為4.32±0.58，明顯高于正常對照組的1.10±0.10 及假手術組的1.08±0.08，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.3 巨噬細胞浸潤和GLUT表達 免疫組化結果顯示，與正常對照組和假手術組比較，AMI組梗死區(qū)有大量CD68+巨噬細胞浸潤（圖5）。AMI組梗死區(qū)GLUT-1 和GLUT-3表達強度明顯高于正常對照組和假手術組。3組GLUT-4 均僅有微弱表達（圖6）。

圖3 實驗豬HE（A～C）和馬松染色圖（D～F）。正常對照組和假手術組心肌細胞結構完整，排列整齊，無炎癥細胞浸潤（×100，A、B）和膠原沉積（×100，D、E）；AMI組梗死區(qū)心肌細胞大片壞死，大量炎癥細胞浸潤（×100，C）和膠原沉積（×100，F(xiàn)）

圖4 實驗豬 PET/CT圖（A）及SUVmax（B）比較。AMI組梗死區(qū)FDG 攝取（箭）明顯高于正常對照組及假手術組，SUVmax 4.3

圖5 實驗豬心肌組織CD68+免疫組化染色。正常對照組（×400，A）和假手術組（×400，B）未見巨噬細胞浸潤，AMI組梗死區(qū)大量巨噬細胞浸潤（×400，C）

3 討論

AMI 激發(fā)炎癥反應，炎癥因子的釋放使大量炎癥細胞向梗死區(qū)募集浸潤。AMI后的炎癥反應與左心室重構和預后有關，其細胞類型、時間進程、強度和范圍均影響組織修復過程，炎癥反應過激或不足均會對左心室重構和預后產生不良影響[11-12]。建立AMI 炎癥動物模型有助于研究炎癥反應機制。本研究用中華小型豬建立AMI 炎癥反應模型，并通過18F-FDG PET/CT評估炎癥反應，為AMI 炎癥反應相關的臨床轉化研究提供可靠的建模和評價方法。

AMI后的血液生化檢查僅能提供系統(tǒng)性炎癥信息，無法評估心臟局部的炎癥情況。CT檢查主要提供心臟和血管的解剖學信息，無法評價心臟局部的炎癥情況。近年較多研究使用18F-FDG PET顯像評價炎癥反應，但由于正常心肌生理性攝取的不可預測性，給顯像前準備和圖像解讀帶來很大挑戰(zhàn)。目前，部分抑制心肌生理性攝取的方法應用于動物及臨床研究，如長時間禁食[13]、高脂低碳餐[14-15]或靜脈注射肝素[16-17]，這些方法在大多數(shù)臨床研究中均有效。然而，由于大多數(shù)麻醉劑會影響大鼠或小鼠心肌葡萄糖代謝，以致這些抑制心肌攝取的方法在小動物體內效果不顯著[18]。因此，嚙齒類動物并非研究AMI后炎癥反應的最佳選擇。Manabe 等[10]采用高脂低碳餐+禁食+肝素的組合方法抑制結節(jié)病患者的心肌生理性攝取，其有效抑制率高達100%。本研究采用相同的方法緩解了麻醉劑對心肌葡萄糖攝取的干擾，實驗豬心肌生理性攝取的有效抑制率高達100%，獲得了良好的圖像質量，為圖像解讀提供了便捷。

圖6 實驗豬GLUT-1、GLUT-3 和GLUT-4 免疫組化染色。正常對照組（A、D）和假手術組（B、E）GLUT-1和GLUT-3表達微弱（×400）；AMI組梗死區(qū)有明顯的 GLUT-1 和GLUT-3表達（×400，C、F）；正常對照組、假手術組和AMI組GLUT-4均僅有微弱表達（×400，G～I）

炎癥細胞主要通過GLUT-1 和GLUT-3 攝取葡萄糖[18]。本研究免疫組化結果顯示梗死區(qū)有大量CD68+巨噬細胞聚集。與正常對照組和假手術組比較，梗死區(qū)GLUT-1 和GLUT-3表達強度明顯增加。PET/CT顯示梗死區(qū)18F-FDG 攝取明顯增加，免疫組化和PET結果表明梗死區(qū)18F-FDG 信號主要反映炎癥細胞的葡萄糖攝取。另外，正常心肌細胞主要表達GLUT-4，GLUT-4 由細胞內向細胞膜的轉位過程是限制心肌葡萄糖攝取的關鍵步驟。本研究中，3組GLUT-4 均僅有微弱表達。GLUTs 的表達驗證了高脂低碳餐+禁食+肝素的方法抑制心肌生理性攝取的有效性，并在一定程度上揭示了心肌生理性攝取抑制的機制，也進一步證實梗死區(qū)18F-FDG 信號與AMI后梗死區(qū)的炎癥反應有關。然而，本研究根據既往報道選擇AMI后的炎癥高峰時點進行研究，并未對AMI后的炎癥反應進行動態(tài)觀察；另外，18F-FDG 信號雖然能夠反映炎癥水平，但其并非炎癥的特異性顯像劑。未來需要使用新型的炎癥細胞特異性顯像劑通過動態(tài)觀察，進一步研究不同亞型炎癥細胞在AMI后不同階段的作用特點。

總之，本研究證明中華小型豬模型適用于AMI后炎癥反應的評估和臨床前研究。18F-FDG PET/CT可以無創(chuàng)地評價AMI后心臟局部的炎癥反應，并可在梗死大小、心臟幾何容積和功能之外提供有價值的信息。