王志恒, 楊秀柳, 鄒芳, 黃思麒, 周吳艷, 徐中偉, 魏玉清

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 國家民委生態(tài)系統(tǒng)模型及應(yīng)用重點試驗室， 銀川 750021)

土壤干旱和鹽漬化是農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要限制因子，嚴(yán)重威脅作物產(chǎn)量和農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展[1-2]。我國干旱和半干旱土地面積超過全國總土地面積的二分之一，其中鹽漬化土壤面積達到0.346×108hm2[3-4]。由于干旱和半干旱地區(qū)具有降雨量偏少、土壤鹽分含量高等特點，同時人類對環(huán)境破壞加劇以及不合理的耕作方式，導(dǎo)致土壤次生鹽漬化程度不斷加深，使得在這些地區(qū)生長的植物受到干旱-高鹽的復(fù)合逆境[5-6]。甜高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]又稱糖高粱、甜稈等，作為一種優(yōu)質(zhì)的飼料作物，具有適應(yīng)能力強、營養(yǎng)價值和生物產(chǎn)量高等特點，在干旱半干旱和鹽漬地區(qū)均適于種植[7]。種子萌發(fā)階段作為植物對外界環(huán)境最敏感的時期，極易受到外界環(huán)境的影響[8]。因此，研究旱鹽交叉脅迫對甜高粱種子萌發(fā)的影響，對干旱半干旱地區(qū)甜高粱生產(chǎn)具有重要意義。

目前，甜高粱種子萌發(fā)期響應(yīng)單一干旱或鹽脅迫方面已有大量研究。Patanè等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在受到水勢低于-0.6 MPa的水分脅迫時，甜高粱種子發(fā)芽率開始有所降低；在水勢等于-0.4 MPa時，初始發(fā)芽時間延遲。楊帆等[10]利用100 mmol·L-1的NaCl和等滲的甘露醇分別模擬鹽脅迫與干旱脅迫，結(jié)果表明，不同品種甜高粱萌發(fā)和幼苗生長都受到了不同程度的抑制。與干旱脅迫類似，鹽脅迫使甜高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等萌發(fā)指標(biāo)逐漸降低，同時顯著抑制干物質(zhì)轉(zhuǎn)移和早期幼苗的生長，對幼根的抑制高于幼芽[11]。在自然條件下，植物常常面臨多種外界脅迫，在遭受某種脅迫后，植物不僅增強對這種脅迫條件的耐受力，同時也會提高其他脅迫的耐受力，這種對外界環(huán)境不同脅迫間的相互適應(yīng)作用稱為植物的交叉適應(yīng)[12]。目前，有關(guān)旱、鹽脅迫對甜高粱的影響已有一些報道，但都是單因素脅迫，關(guān)于旱鹽交互脅迫尚未見報道。因此，本研究采用PEG-6000模擬干旱脅迫，采用NaCl模擬鹽脅迫，研究旱鹽交叉脅迫對甜高粱種子萌發(fā)以及生理生化特性的影響，以期為甜高粱響應(yīng)復(fù)合脅迫的生理機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試種子為甜高粱雜交品種遼甜1號，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 試驗處理

利用PEG-6000用蒸餾水配置成0(CK)、50(D1)、100 g·L-1(D2)的溶液；將NaCl配置成0(CK)、75(S1)、150 mmol·L-1(S2)鹽溶液；以及二者交互脅迫D1+S1、D2+S1、D1+S2、D2+S2，共計9個處理。

1.3 測定項目及方法

種子試驗處理及指標(biāo)計算公式[6]如下。

發(fā)芽率=萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢=第3 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽速度=∑G/t

式中，G為每天的發(fā)芽率，t為發(fā)芽總時間。

活力指數(shù)=∑Gt/t×S

式中，Gt為t天內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)，S為胚根平均長度。

干物質(zhì)轉(zhuǎn)移量=發(fā)芽前種子干質(zhì)量-發(fā)芽后種子殘留干質(zhì)量

干物質(zhì)轉(zhuǎn)運率=(芽干重+根干重/芽干重+根干重+種子殘留干重)×100%

1.4 生理指標(biāo)測定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定采用氮藍四唑光還原法[13]；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[14]；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測定采用紫外吸收比色法[15]；抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性測定參考孫云[16]的方法；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250法[17]；脯氨酸(proline，Pro)含量測定采用南京建成生物工程研究所的脯氨酸測試盒；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[17]；還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量測定參考孫群等[17]的方法。

1.5 耐受性綜合評價

應(yīng)用隸屬函數(shù)法對不同脅迫條件下甜高粱種子萌發(fā)的傷害作用進行綜合評價。在綜合評價中，不同脅迫下的各個指標(biāo)以隸屬值來表示。若某一指標(biāo)與傷害作用為正相關(guān)，采用式(1)計算隸屬值；若為負(fù)相關(guān)，則采用式(2)計算隸屬值[18]。

X=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

X=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中，X為某一指標(biāo)測定值，Xmin某一指標(biāo)測定值的最小值，Xmax為該指標(biāo)中最小值。

最后將各個指標(biāo)隸屬值累加求平均值，平均值越大則傷害越小，根據(jù)平均隸屬值來比較其傷害大小。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，使用GraphPad Prism 5.0作圖，利用SPSS 21.0進行雙因素方差分析。圖表中參數(shù)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 旱鹽交叉脅迫對甜高粱種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

由圖1可知，單一脅迫下，甜高粱的萌發(fā)指標(biāo)均隨著脅迫濃度增大整體呈降低趨勢。D2+S2處理下,發(fā)芽速度和活力指數(shù)顯著低于CK處理(P<0.05)，并且隨著濃度增大呈減少趨勢。交互脅迫處理能夠抑制甜高粱種子的萌發(fā)指標(biāo)，其中D2+S2處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著低于CK處理(P<0.05)。低濃度的旱鹽交互作用可以提高發(fā)芽速度和活力指數(shù)，同一S2處理下，通過添加50 g·L-1的PEG-6000可以提高發(fā)芽速度和活力指數(shù)；過高的PEG-6000濃度會降低種子發(fā)芽速度和活力指數(shù)。但在S1處理下，不同濃度的PEG-6000處理均可降低種子的發(fā)芽速度和活力指數(shù)。以上結(jié)果表明，在特定的NaCl處理下，低濃度的PEG-6000處理能提高甜高粱種子對鹽環(huán)境的耐受力，而PEG-6000濃度過高則會產(chǎn)生相反的效應(yīng)。雙因素方差分析(表1)表明，對于發(fā)芽率和發(fā)芽勢，從D、S及D+S處理所占總平方和的百分比(PP)來看，D處理貢獻度較高，D+S處理次之，S處理最?。粚τ诎l(fā)芽速度和活力指數(shù)，D處理對其的貢獻度較高，S處理次之，D+S處理最小。因此，D處理對萌發(fā)指標(biāo)的影響較大。

2.2 旱鹽交叉脅迫對甜高粱種苗轉(zhuǎn)化的影響

由圖2可知，單一脅迫均可抑制甜高粱種苗轉(zhuǎn)化指標(biāo)。除D1處理外，其余單一脅迫均可顯著抑制甜高粱早期幼苗的芽長、根長、總長及側(cè)根數(shù)(P<0.05)，并隨著處理濃度的增大呈逐漸減小趨勢，其中D處理對芽長的抑制大于根長。交互脅迫處理能夠抑制甜高粱種苗轉(zhuǎn)化指標(biāo)，當(dāng)PEG-6000濃度為50 g·L-1時，甜高粱的芽長、根長及總長隨著NaCl濃度的增大呈逐漸減小趨勢；當(dāng)PEG-6000濃度達到100 g·L-1時，甜高粱的芽長隨著NaCl濃度的增大呈先增大后減小趨勢，根長和總長則呈逐漸減小趨勢。而對于芽干重+根干重、種子殘留干重、干物質(zhì)轉(zhuǎn)移量及干物質(zhì)轉(zhuǎn)運率均隨著單一脅迫的程度加深而逐漸抑制，交叉脅迫下，這四類指標(biāo)同樣隨著脅迫程度的加深逐漸被抑制。雙因素方差分析(表2)表明，從D、S及D+S處理所占總平方和的百分比(PP)來看，對于芽長、總長、種子殘留干重和干物質(zhì)轉(zhuǎn)移量，S處理的貢獻度較高，D處理次之，D+S處理最小；對于根長、芽干重+根干重和干物質(zhì)轉(zhuǎn)運率，D處理的貢獻度較高，S處理次之，D+S處理最?。粚τ趥?cè)根數(shù)，D+S處理的貢獻度較高，S處理次之，D處理最小。因此，旱鹽交叉脅迫對甜高粱種苗轉(zhuǎn)化指標(biāo)的影響各有不同。

2.3 旱鹽交叉脅迫對甜高粱早期幼苗生理指標(biāo)的影響

2.3.1旱鹽交叉脅迫對甜高粱早期幼苗抗氧化物酶活性的影響 圖3顯示，在PEG-6000或NaCl單一脅迫下，甜高粱早期幼苗的幼芽和幼根SOD、POD、CAT、APX活性隨脅迫濃度的增大呈先升后降趨勢，說明低濃度的干旱或鹽脅迫可以提高甜高粱早期幼苗抗氧化酶活性。但在D2+S2處理下，甜高粱的幼芽和幼根抗氧化物酶活性顯著低于CK處理(P<0.05)，這可能是因為該脅迫程度超過了甜高粱早期幼苗過氧化防御系統(tǒng)的閾值。相比于單一脅迫，交叉脅迫下，甜高粱早期幼苗的抗氧化物酶活性呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，說明低濃度交叉脅迫可以提高抗氧化物酶活性，而高濃度的交叉脅迫則明顯抑制抗氧化物酶活性。雙因素方差分析(表3)表明，從D、S及D+S處理所占總平方和的百分比(PP)來看，甜高粱早期幼苗中幼芽和幼根的SOD、POD、CAT、APX活性，D處理的貢獻度較高，S處理次之，D+S處理最小。因此，干旱脅迫對甜高粱幼苗抗氧化物酶活性的影響較大。

2.3.2旱鹽交叉脅迫對甜高粱早期幼苗可溶性蛋白、Pro、MDA和GSH含量的影響 圖4顯示，在PEG-6000或NaCl單一脅迫下，甜高粱早期幼苗的幼芽和幼根的可溶性蛋白、Pro含量隨脅迫濃度的增大呈先升高后降低趨勢。D2+S2處理下，甜高粱的幼芽和幼根可溶性蛋白、Pro含量顯著低于CK處理(P<0.05)。而MDA、GSH含量隨著脅迫濃度的增大呈升高趨勢。相比于單一脅迫，交叉脅迫下，甜高粱早期幼苗的可溶性蛋白、Pro含量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，說明低濃度交叉脅迫可以提高可溶性蛋白、Pro含量，而高濃度的交叉脅迫則降低可溶性蛋白、Pro含量。交叉脅迫下,甜高粱早期幼苗的MDA、GSH含量隨著脅迫程度的加深呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。雙因素方差分析(表4)表明，從D、S及D+S處理所占總平方和的百分比(PP)來看，甜高粱早期幼苗中可溶性蛋白含量，D+S處理的貢獻度較高，S處理次之，D處理最小；而D處理對Pro含量的貢獻度較高，S處理次之，D+S處理最小；S處理對MDA和GSH含量的貢獻度較高，D處理次之，D+S處理最小。因此，旱鹽交叉脅迫對可溶性蛋白含量的影響較大，干旱脅迫對Pro含量的影響較大，鹽脅迫是影響MDA和GSH含量的主要因子。

表2 旱鹽交叉脅迫對甜高粱種子種苗轉(zhuǎn)化指標(biāo)影響的雙因素方差分析Table 2 Two-factor ANOVA of the effect of drought salt cross stress on seed-seedling transformation of sweet sorghum

表3 旱鹽交叉脅迫對甜高粱早期幼苗抗氧化物酶活性影響的雙因素方差分析Table 3 Two-factor ANOVA of the effect of drought salt cross stress on antioxidant enzyme activity of sweet sorghum at early seedling

表4 旱鹽交叉脅迫對甜高粱早期幼苗可溶性蛋白、Pro、MDA和GSH含量影響的雙因素方差分析Table 4 Two-factor ANOVA of the effect of drought salt cross stress on soluble protein, Pro, MDA and GSH content of sweet sorghum at early seedling

注：不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有顯著性。Note: Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.圖3 旱鹽交叉脅迫對甜高粱早期幼苗抗氧化物酶活性的影響Fig.3 Effects of drought salt cross stress on antioxidant enzyme activity of sweet sorghum early seedling

注：不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有顯著性。Note: Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.圖4 旱鹽交叉脅迫對甜高粱早期幼苗可溶性蛋白、Pro、MDA和GSH含量的影響Fig.4 Effects of drought salt cross stress on soluble protein, Pro, MDA and GSH content of sweet sorghum early seedling

2.4 相關(guān)性分析

20個指標(biāo)的相關(guān)分析(表5)表明，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽速度及活力指數(shù)之間，芽長、根長、總長、側(cè)根數(shù)、芽干重+根干重、干物質(zhì)轉(zhuǎn)移量及干物質(zhì)轉(zhuǎn)移率之間均呈極顯著正相關(guān)；種子殘留干重與干物質(zhì)轉(zhuǎn)移率、干物質(zhì)轉(zhuǎn)移率呈極顯著負(fù)相關(guān)；SOD活性、POD活性、CAT活性、APX活性、可溶性蛋白含量、Pro含量之間均呈極顯著正相關(guān)；MDA含量、GSH含量與SOD活性、POD活性及可溶性蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。從20個指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣可以看出，所有指標(biāo)間都存在著相關(guān)性，從而使得它們所提供的信息發(fā)生重疊。因此，直接利用這些單個指標(biāo)進行傷害作用評價可能具有不可靠性。

2.5 單一脅迫與交互脅迫差異比較及綜合評價

本研究為探究甜高粱對單一脅迫與交互脅迫條件的差異比較，采用隸屬函數(shù)法分別對單一脅迫及交互脅迫處理下的傷害作用進行全面、綜合的評價。由表6可知，隸屬函數(shù)結(jié)果分析評價出各個處理對甜高粱種子萌發(fā)期的傷害作用大小依次為：D2+S2>S2>D2+S1>D2>D1+S2>D1+S1>S1>D1>CK。通過以上種子萌發(fā)情況及幼苗生理指標(biāo)的變化分析及隸屬函數(shù)法綜合評價發(fā)現(xiàn)，甜高粱種子萌發(fā)階段具有植物的交叉適應(yīng)特點。

3 討論

種子萌發(fā)期是植物生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，決定植物群體在逆境條件下能否建植成功。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是評價種子活力的常用指標(biāo)，可以反映出種子的萌發(fā)能力[19]。植物從種子轉(zhuǎn)化到幼苗過程中所需的物質(zhì)及能量是由種子中貯藏的有機物提供，因而種子萌發(fā)期的總長、芽長、根長、側(cè)根數(shù)、種子殘留干重、芽干重+根干重和干物質(zhì)轉(zhuǎn)運率能體現(xiàn)出植物種苗轉(zhuǎn)化狀況，當(dāng)植物早期幼苗胚芽和胚根生長均衡時，可以表現(xiàn)出更好的生長狀況[6]。干旱和鹽脅迫對植物體均能造成滲透效應(yīng)，除此之外，鹽脅迫可造成植物體內(nèi)離子平衡失調(diào)、有毒物質(zhì)積累等，從而抑制植物生長發(fā)育，脅迫條件下植物的發(fā)芽率及外部形態(tài)脅迫影響的直接體現(xiàn)，受影響越大，發(fā)芽率越低，導(dǎo)致出苗不齊，從而影響作物產(chǎn)量[20]。張宇君等[21]對燕麥的研究指出，中低濃度的單一脅迫及交互脅迫均有利于促進燕麥種子萌發(fā)和增強幼苗SOD、POD、CAT活性以及提高GSH含量，當(dāng)脅迫程度較高時，原本的促進作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔谩Ｔ诒狙芯恐?，單一及交互脅迫下甜高粱種子的萌發(fā)指標(biāo)隨著脅迫加重呈現(xiàn)抑制作用，然而在高濃度的NaCl處理下，一定濃度的PEG-6000處理能提高甜高粱種子的萌發(fā)指標(biāo)和種苗轉(zhuǎn)化指標(biāo)，而PEG-6000濃度過高則會產(chǎn)生相反的效應(yīng)，這與趙麗麗等[22]在二色胡枝子的研究結(jié)果一致。

非生物脅迫下，植物會產(chǎn)生大量活性氧自由基，大量的活性氧會影響蛋白質(zhì)的合成、破壞膜系統(tǒng)，造成植物細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p壞甚至死亡，SOD、POD、CAT和APX是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的主要保護酶，這4種酶彼此協(xié)調(diào)的綜合結(jié)果是整個保護酶系統(tǒng)防御能力的體現(xiàn)[23]。本研究中，在單一及交互脅迫下，甜高粱早期幼苗的SOD、POD、CAT和APX活性隨著濃度增大呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，抗氧化物酶活性的升高有利于清除植物遭受脅迫后產(chǎn)生活性氧自由基，而當(dāng)脅迫傷害較大時，這4種抗氧化物酶已經(jīng)不能完全清除活性氧自由基，因此活性降低。這與姚海梅等[20]對玉米的研究結(jié)論相似。

逆境脅迫下植物體內(nèi)可溶性蛋白含量的增加使植物維持更低的滲透勢，從而增強抗逆性，Pro通常被認(rèn)為是植物在鹽脅迫下用于調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)和液泡滲透勢平衡的一種主要的滲透物質(zhì)，GSH是植物細(xì)胞中重要的抗氧化劑之一，其含量與膜脂過氧化程度呈正相關(guān)，而葉片MDA含量則反映其細(xì)胞氧化損傷程度[17,24]。在本研究中，單一脅迫條件下，隨著脅迫濃度的增加可溶性蛋白和Pro含量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，MDA和GSH含量呈現(xiàn)升高趨勢；150 mmol·L-1的NaCl處理顯著降低可溶性蛋白和Pro含量，顯著提高MDA和GSH含量，在加入50 g·L-1的PEG-6000后，甜高粱幼苗、幼根中的相應(yīng)指標(biāo)顯著升高，說明適量干旱條件可以清除ROS的積累，從而減輕膜脂過氧化程度，維持了細(xì)胞膜的完整性，并且可以提高可溶性蛋白含量，減輕氧化脅迫，從而保證生理生化活動的進行。由此表明，適度干旱可以減輕鹽脅迫對甜高粱早期幼苗的傷害，陳成升等[25]的研究指出，小麥幼苗的可溶性蛋白和Pro含量隨著干旱脅迫的加重呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，在干旱脅迫的條件下加入適量的鹽分可以提高可溶性蛋白和Pro含量，這與本研究結(jié)果類似。

本研究分析了甜高粱對干旱、鹽單一脅迫及二者交互脅迫的萌發(fā)和生理響應(yīng)特征，發(fā)現(xiàn)特定條件的交互脅迫可以促進種子萌發(fā)及增強抗氧化物酶活性，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化劑含量。萌發(fā)指標(biāo)、種苗轉(zhuǎn)化指標(biāo)及生理指標(biāo)在雙因素方差分析結(jié)果中，干旱脅迫顯著影響甜高粱種子的萌發(fā)指標(biāo)；對于種苗轉(zhuǎn)化指標(biāo)，干旱和鹽以及二者交互作用的影響各不相同；而對于生理指標(biāo)，干旱脅迫是影響抗氧化物酶活性、MDA和GSH含量的主要因子，鹽脅迫則是影響可溶性蛋白含量的主要因子。隸屬函數(shù)法結(jié)果表明：相比于單一脅迫，特定條件下交叉脅迫的平均隸屬函數(shù)值更小，并且在交叉脅迫下甜高粱能通過干旱、鹽交互作用來提高自身對外界環(huán)境的適應(yīng)性，表現(xiàn)出植物的交叉適應(yīng)，從而提高自身耐受性。

表5 各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of each index

表6 旱鹽交叉脅迫下甜高粱耐受性綜合評價Table 6 Comprehensive evaluation of sweet sorghum tolerance under drought salt cross stress