袁標(biāo) 鄧珊珊 張海 藺俐仲 袁林 羅登蕎 景書(shū)灝 徐春志 楊源 劉艷

（1，貴州省貴陽(yáng)市息烽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 551100；2，貴州省貴陽(yáng)市清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 551400；3，貴州省貴陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 550081；4，貴州省貴陽(yáng)市草地站 550081）

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌引起的以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎為主要臨床特征的急性、敗血性、接觸性傳染病，又稱為鴨傳染性漿膜病。該病的易感動(dòng)物有雞、鴨、火雞等，其中對(duì)2～3 周齡雛鴨最易感染[1]。Riemer 等1904 年首次報(bào)道鴨疫里默氏桿菌，隨后相繼在世界各國(guó)都有發(fā)生。我國(guó)郭玉璞等[2]1982 首次在北京郊區(qū)鴨場(chǎng)中分離到鴨疫里默氏桿菌，全國(guó)都有相關(guān)報(bào)道，如今已成為危害養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。

貴州省某鴨場(chǎng)購(gòu)進(jìn)雛鴨11000 只，6 日齡引種于四川省隆昌市，飼養(yǎng)至11 日齡時(shí)開(kāi)始發(fā)病死亡，鴨群16 日齡時(shí)已死亡8000 余只。病鴨臨床癥狀以神經(jīng)癥狀為主，出現(xiàn)搖頭晃腦、行動(dòng)遲緩、站立不穩(wěn)、精神沉郁、被毛凌亂等，部分患鴨頭頸歪斜、臥地不起。剖檢病死鴨可見(jiàn)腦組織水腫、心臟表面有灰白色包膜、病鴨脾臟腫大腹內(nèi)有黃色纖維素性滲出物、附關(guān)節(jié)腫大等大體病變。初步懷疑為鴨疫里默氏桿菌感染，為進(jìn)一步確診該養(yǎng)鴨場(chǎng)雛鴨異常死亡的病因，采用了細(xì)菌分離鑒定、PCR檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室診斷方法，為后期防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料

選擇患病雛鴨5 只，無(wú)菌采集心包液、肝臟組織。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL2000、細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；新生牛血清（購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司）；試驗(yàn)所用的抗菌藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；巧克力培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

分別無(wú)菌接種5 只受檢鴨的心包液、肝臟組織于巧克力瓊脂平板，置于燭缸中37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24h。

1.4 細(xì)菌PCR 檢測(cè)

挑取純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落到5%新生牛血清的液體培養(yǎng)物中，震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌總DNA。根據(jù)鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A (OmpA) 基因設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物：5’ -AGCCAACTATTTGAGACACG-3’；下游引物：5’-ATACCCTTTAATGCTCCTG-3’，預(yù)擴(kuò)增片段663 bp。采用25 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)入95℃變性45s、54℃退火45s 和72℃延伸45s 的35 次循環(huán)，最后72℃再延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察是否有特異性目的條帶。

1.5 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按NCCLS2010 年標(biāo)準(zhǔn)，作出結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)

巧克力瓊脂平板生長(zhǎng)出表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、半透明呈露滴狀菌落，見(jiàn)圖1。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢顯示分離菌為革蘭氏陰性短小桿菌，見(jiàn)圖2。初步判斷為鴨疫里默氏桿菌。

圖1 分離菌的菌落形態(tài)

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢圖

2.2 細(xì)菌PCR 鑒定

取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物8μl，于1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，結(jié)果顯示，鴨疫里默氏桿菌陽(yáng)性對(duì)照和分離菌樣本在663bp 處均出現(xiàn)特異性條帶，結(jié)果見(jiàn)圖3，可得本次厭氧分離得到的細(xì)菌為鴨疫里默氏桿菌。

2.3 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

圖3 分離菌PCR 擴(kuò)增結(jié)果

選取分離得到的鴨疫里默氏桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果為分離菌對(duì)頭孢呋辛、頭孢唑啉、氨芐西林、羧芐西林、克林霉素、麥迪霉素、萬(wàn)古霉素、慶大霉素、新霉素和丁胺卡那等9 種抗菌藥物均呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，而對(duì)頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢拉定、頭孢他啶、哌拉西林、氧氟沙星、諾氟沙星和米諾環(huán)素等8 種抗菌藥物呈現(xiàn)良好的敏感性，部分結(jié)果如圖4 所示。

圖4 部分藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

采用細(xì)菌分離鑒定、PCR 檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室診斷方法，確診該養(yǎng)鴨場(chǎng)雛鴨異常死亡的病因?yàn)轼喴呃锬蠗U菌感染。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌對(duì)頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢拉定、頭孢他啶、哌拉西林、氧氟沙星、諾氟沙星和米諾環(huán)素等8 種抗菌藥物呈良好的敏感性。

4 討論

鴨疫里默氏桿菌世界上公認(rèn)的血清型有21 個(gè)，國(guó)內(nèi)流行的是1 型和2 型[3]，其他血清型也常常伴隨發(fā)生，且不同血清型直接無(wú)交叉免疫保護(hù)，這給疫苗免疫預(yù)防帶來(lái)了困難。在臨床上主要采用抗生素藥物進(jìn)行治療，但由于大量抗生素藥物的濫用，造成不同程度的耐藥。因此，選擇合適的敏感藥物對(duì)治療和預(yù)防鴨疫里默氏桿菌病顯得至關(guān)重要。同時(shí)要加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生清潔和消毒，注意交替使用消毒藥物，避免產(chǎn)生耐藥性影響消毒效果[4]。對(duì)鴨群還要注意保暖，較少應(yīng)激，做好禽流感和鴨瘟等疫病的免疫工作，加強(qiáng)免疫抗體監(jiān)測(cè)。