高鳳祥，胡發(fā)文，菅玉霞，李莉，王雪，王曉龍，潘雷，郭文

(山東省海洋生物研究院 青島市海洋生物種質(zhì)資源挖掘與利用工程實(shí)驗(yàn)室，青島淺海底棲漁業(yè)增殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266104)

魚(yú)類的繁殖策略是為了適應(yīng)其生活的水環(huán)境棲息地。魚(yú)卵是魚(yú)類的雌性生殖細(xì)胞，其產(chǎn)出后黏性程度因種類的不同有較大差異，Rizzo等[1]通過(guò)對(duì)魚(yú)卵的宏觀評(píng)估，將魚(yú)卵按黏性程度分為黏性卵、弱黏性卵和非黏性卵3類。其中，緊密黏附在一起形成黏性卵塊的魚(yú)卵為黏性卵，彼此黏附但在輕微攪動(dòng)下可自由移動(dòng)的卵為弱黏性卵，而完全自由游離的卵為非黏性卵。產(chǎn)黏性卵的代表魚(yú)類有大瀧六線魚(yú)Hexagrammosotakii、松江鱸Trachidermusfasciatus、絨杜父魚(yú)Hemitripterusvillosus等，這類魚(yú)卵卵膜表層遇水后表現(xiàn)出極高黏性，呈團(tuán)塊狀附著于水草、海藻或巖礁等產(chǎn)卵基質(zhì)上，一般具有黏性強(qiáng)、孵化時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)；產(chǎn)弱黏性卵的代表種類有西伯利亞鱘Acipenserbaerii等；還有一些魚(yú)類所產(chǎn)的卵無(wú)黏性，卵粒分離，能自由浮動(dòng)[2]，代表性種類有大菱鲆Scophthalmusmaximus等。

魚(yú)卵有無(wú)黏性與魚(yú)的生活史和繁殖策略有重要關(guān)系。在自然條件下，遷徙魚(yú)種的卵通常無(wú)黏性，會(huì)自由地漂向下游。定居魚(yú)種的卵通常具有黏性，會(huì)附著在產(chǎn)卵地附近不同的底層物質(zhì)上[3]。因此，卵的黏性特征可能有助于理解不同種類硬骨魚(yú)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[4]。黏性魚(yú)卵遇水后，表面黏性物質(zhì)即被激活，魚(yú)卵或黏附在基質(zhì)上或互相黏連成團(tuán)，不同魚(yú)類卵的黏性成因和黏度各有不同。經(jīng)長(zhǎng)期大量的試驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐，科研人員研發(fā)了多種黏性魚(yú)卵人工授精和孵化方法。本研究中，綜述了黏性魚(yú)卵表面黏性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分及黏連機(jī)制，綜合對(duì)比多種黏性卵人工授精及孵化方法，分析了這些方法的原理及優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)今后的研究方向進(jìn)行了思考且提出相應(yīng)建議，以期為產(chǎn)黏性卵魚(yú)類的人工繁育提供參考。

1 魚(yú)卵黏性的生物學(xué)功能

魚(yú)卵的黏性是為適應(yīng)生活環(huán)境而發(fā)展出的繁殖策略。許多硬骨魚(yú)類會(huì)產(chǎn)下黏性卵，卵子遇水后迅速出現(xiàn)的黏性是防止卵從最佳棲息地漂移到次等棲息地的重要機(jī)制[5]。魚(yú)卵的黏性有助于其附著在基質(zhì)上，或與其他卵相互黏附，以防止魚(yú)卵被水流、海浪沖散或被捕食者捕食。魚(yú)卵沉降附著在固定的領(lǐng)地內(nèi)有助于親魚(yú)護(hù)卵，提高存活率[6]。在上層和底棲魚(yú)類中，魚(yú)卵的附著方式和黏附程度各不相同，這種繁殖策略的變化反映了不同魚(yú)類對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性。

鱘的魚(yú)卵在與水接觸后的幾分鐘內(nèi)便會(huì)產(chǎn)生黏性，具體時(shí)間因種類而異，如俄羅斯鱘Acipensergueldenstaedti為8～19 min，歐洲鰉Husohuso為4～6 min，閃光鱘Acipenserstellatus為5～12 min[7]。鱘類中有5種產(chǎn)出弱黏性卵，有22種產(chǎn)出黏性卵，其中有3種卵黏性極強(qiáng)。大多數(shù)種類的鱘卵是沉黏性卵，產(chǎn)在水底的泥灘、沙地或巖石上的沙礫、鵝卵石這類基質(zhì)上[8-9]。所有種類的鱘均會(huì)產(chǎn)出具有黏性的卵，使得魚(yú)卵可以附著在基質(zhì)上。Vorob’eva等[10]推測(cè)，鱘卵黏性的作用很可能是將卵固著在潔凈的基質(zhì)上以便助其受精，進(jìn)而提高自然條件下鱘的存活率和孵化率。

魚(yú)卵的黏性也有助于親魚(yú)護(hù)卵。一些魚(yú)類通過(guò)親魚(yú)的護(hù)卵行為以提高受精卵存活率，如大瀧六線魚(yú)、絨杜父魚(yú)等。大瀧六線魚(yú)由雄性選擇環(huán)境適宜受精卵孵化的水域筑巢，雌性將卵產(chǎn)在魚(yú)巢內(nèi)，卵粒遇水硬化后，具有極強(qiáng)的黏性，牢固的黏附在基質(zhì)上，這種繁殖策略有利于雄魚(yú)護(hù)卵，降低受精卵被捕食風(fēng)險(xiǎn)，提高其存活率[11]。

在無(wú)筑巢護(hù)卵習(xí)性的魚(yú)類中，卵的黏性有助于在整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中將魚(yú)卵固著在最佳孵化位置，對(duì)維持孵化率水平具有重要意義[12]。如歐洲白鮭Coregonuslavaretus既不護(hù)卵也不筑巢，卵粒和精子均撒播在選定的產(chǎn)卵場(chǎng)上，由于它們?cè)谒魍募钡乃虍a(chǎn)卵，所以幾乎不會(huì)存在卵沉積，受精卵孵化水環(huán)境中含氧量較高，有利于提高受精卵孵化率[13]。如果卵無(wú)黏性，受精卵可能會(huì)受到水流沖擊造成物理傷害，或被沖上岸邊因干燥而死亡，或被拖入含氧量較低、沉積物負(fù)荷較重的深水區(qū)，導(dǎo)致孵化率和存活率降低。有研究表明，歐洲白鮭受精卵死亡的主要原因是魚(yú)卵被水流從產(chǎn)卵場(chǎng)沖到不適合的發(fā)育區(qū)域[14]。

2 黏性卵的結(jié)構(gòu)特征及其黏性機(jī)制

2.1 黏性卵的結(jié)構(gòu)特征

大多數(shù)魚(yú)類的卵母細(xì)胞和卵被一層厚蛋白質(zhì)膜所包覆[15]，稱為卵膜。卵膜可以保護(hù)魚(yú)卵免受環(huán)境變化(如干燥、機(jī)械力)影響造成的器質(zhì)性損傷[16-18]，以及水流[19]、捕食者和病原體(如細(xì)菌和真菌)感染[20-21]的影響。卵膜可作為受精卵內(nèi)部與外部環(huán)境污染物間隔離的屏障，在環(huán)境急劇變化時(shí)(如干燥)起到一定的保護(hù)作用，卵膜還有促進(jìn)發(fā)育中胚胎氣體交換的功能[22]。

卵膜的結(jié)構(gòu)包括一個(gè)較厚內(nèi)層放射帶(zona radiata interna，ZRI)和一個(gè)較薄外層放射帶(zona radiata externa，ZRE)[23]。大多數(shù)魚(yú)類的卵均具有這種通用結(jié)構(gòu)，然而，卵膜的形態(tài)可以根據(jù)物種和環(huán)境表現(xiàn)出修正[24]。非黏性魚(yú)卵通常具有較薄的卵泡上皮細(xì)胞層和放射帶，而黏性魚(yú)卵則被較厚的卵泡上皮細(xì)胞層和相對(duì)較復(fù)雜的卵膜包覆[25]。

覆蓋卵的放射帶是一個(gè)復(fù)雜的、充滿孔道的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，孔道中填充著卵母細(xì)胞微絨毛和卵泡細(xì)胞突觸。放射帶通常分成兩層，每層均具有不同的形態(tài)特征[26]。內(nèi)層主要由蛋白質(zhì)組成，碳水化合物較少，與哺乳動(dòng)物透明帶相似，其在受精和胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能在進(jìn)化中得到了保留[27]；外層由特定的大分子組成，除糖蛋白外，還可能含有羧酸和硫酸多糖及少量唾液酸[28]，主要負(fù)責(zé)卵與水環(huán)境的相互作用。魚(yú)類產(chǎn)卵后，放射帶經(jīng)歷了廣泛的分子修飾，最終形成了卵膜。卵膜結(jié)構(gòu)反映了對(duì)不同環(huán)境條件的適應(yīng)性，無(wú)黏性卵通常具有較薄的卵膜，外層結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單；黏性卵具有較厚和更復(fù)雜的卵膜，放射帶外層的附屬結(jié)構(gòu)遇水會(huì)產(chǎn)生物理和化學(xué)變化，使其能夠黏附在不同的基質(zhì)上[29]。

Rizzo等[1]對(duì)23個(gè)脂鯉目Cypriniformes和8個(gè)鲇形目Siluriformes魚(yú)卵進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)分析，并研究了卵的黏性及卵表面結(jié)構(gòu)模式的相互關(guān)系，結(jié)果表明，脂鯉目魚(yú)類中，無(wú)黏性卵的放射帶表面呈孔道或纖絲網(wǎng)，弱黏性卵的放射帶表面僅為孔道，而高黏性卵的放射帶表面則為球狀、絲狀、絨毛狀或蜂窩狀的孔道；鲇形目魚(yú)類的卵表面結(jié)構(gòu)均較相似，呈現(xiàn)常見(jiàn)的“膠狀層”結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)的魚(yú)卵是否具有黏性主要取決于膜卵表面的生化成分。

2.2 黏性卵的黏性機(jī)制

目前，對(duì)黏性魚(yú)卵表面的黏性物質(zhì)成分及成因研究較少，據(jù)推測(cè)，卵表面黏性可能與生殖模式和系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)[30]，黏性魚(yú)卵的黏性機(jī)制研究目前也尚未完全清楚，現(xiàn)有的研究成果僅限具體試驗(yàn)中魚(yú)類黏性機(jī)制的探討。黏性卵黏性機(jī)制的研究主要從形態(tài)學(xué)和生化兩方面入手，形態(tài)學(xué)方面運(yùn)用電子顯微鏡對(duì)卵表面進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析，研究卵表面特征性結(jié)構(gòu)在遇水即呈現(xiàn)出黏性前后的變化；生化方面通常使用凝膠電泳法進(jìn)行成分分析，探討卵膜表面大分子成分如糖蛋白等遇水化合后所產(chǎn)生的黏性物質(zhì)成分及成因等?，F(xiàn)有研究成果顯示，黏性卵的黏性機(jī)制根據(jù)魚(yú)的種類不同而有所差異。如香魚(yú)科和胡瓜魚(yú)科，包覆著魚(yú)卵的動(dòng)物半球的黏性卵膜反轉(zhuǎn)，形成黏性膜[31-32]；在雀鯛科Pomacentridae[33]、青鳉屬Oryziinae[34]、底鳉屬Fundulus[35]及蝦虎魚(yú)科Gobiidae[36]，魚(yú)卵被卵膜上的長(zhǎng)纖絲附著在基質(zhì)上；另外，在很多種類的魚(yú)卵表面發(fā)現(xiàn)的黏性物質(zhì)也使魚(yú)卵產(chǎn)生黏性，如鯡形目Clupeiformes、鯉形目Cypriniformes、鲇形目Siluriformes[37]、刺魚(yú)目Gasterosteiformes[38]、鱸亞目Percoidei[39]、鲉形目Scorpaeniformes[40]和鰈形目Pleuronectiformes[41]。

魚(yú)卵彼此黏附及魚(yú)卵黏附在基質(zhì)上的方式隨環(huán)境條件[42]和魚(yú)卵表面結(jié)構(gòu)的不同而變化。綜合分析，黏性的產(chǎn)生機(jī)制主要分為以下兩類。

2.2.1 形態(tài)學(xué)與生化雙重黏附機(jī)制 卵特殊的表面結(jié)構(gòu)(如蜂巢結(jié)構(gòu)、各種形態(tài)的突起、黏著絲等)與卵的黏度有重大關(guān)聯(lián)，這種特殊表面結(jié)構(gòu)的魚(yú)卵通常具有形態(tài)學(xué)與生化雙重黏附機(jī)制。

研究表明，歐洲白鮭卵與水接觸30 s后開(kāi)始產(chǎn)生黏性，且在與水接觸后幾分鐘內(nèi)魚(yú)卵即完全黏附在一起[14]。對(duì)其卵膜超微結(jié)構(gòu)觀察表明，與水接觸后，卵膜表面形態(tài)發(fā)生了顯著變化，絨毛狀突起附著在卵表面的結(jié)締絲上，通過(guò)這些突起的互相鎖定產(chǎn)生黏性，也可通過(guò)在卵表面與卵落入的基質(zhì)間產(chǎn)生摩擦來(lái)促進(jìn)黏附。這種絨毛狀突起與文鳊Vimbavimba卵的絨毛狀突起相類似，不過(guò)文鳊卵的黏附結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度為4 μm，而歐洲白鮭卵上的突起更短且長(zhǎng)度不一(1～3 μm)[43]。生化機(jī)制方面的分析顯示，與水接觸后的卵膜上存在一種水解蛋白酶(Chain A，RNase ZF-3e)，而未與水接觸的卵則未發(fā)現(xiàn)該種水解蛋白酶的存在。歐洲白鮭卵的卵膜組織學(xué)檢測(cè)顯示，阿爾新藍(lán)和PAS染色反應(yīng)均呈陽(yáng)性，印證了糖蛋白及中性和酸性黏多糖的存在，此結(jié)果與在其他種類硬骨魚(yú)卵外部放射帶中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致[19]。由此可見(jiàn)，歐洲白鮭卵的黏性源自卵膜，具有形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)雙重黏附機(jī)制。

2.2.2 生化黏附機(jī)制 有些魚(yú)類具有相對(duì)平滑的卵表面結(jié)構(gòu)(如放射帶孔道和膠狀外套層)，此類魚(yú)卵是否具有黏性及黏性強(qiáng)弱則與具體魚(yú)的種類有關(guān)。此類卵黏性機(jī)制主要是通過(guò)生化機(jī)制實(shí)現(xiàn)黏附，即卵表面的化學(xué)物質(zhì)，以及排卵后這些化學(xué)物質(zhì)與水發(fā)生化合反應(yīng)后產(chǎn)生的黏性物質(zhì)，使魚(yú)卵黏附在基質(zhì)上或相互黏附。

在有些魚(yú)類中，魚(yú)卵的黏性由外層放射帶ZRE的糖蛋白介導(dǎo)[43]。如鯉Cyprinuscarpio卵的黏性是蛋白質(zhì)通過(guò)外層放射帶ZRE從卵黃周隙擴(kuò)散而引起的[44]。在許多魚(yú)類中，黏性層來(lái)自卵泡上皮細(xì)胞，如歐鲇Silurusglanis，在卵黃生成作用中，卵泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成結(jié)構(gòu)不規(guī)則厚實(shí)的由黏性卵泡細(xì)胞組成的膠狀外套層。該膠狀外套層由黏多糖和黏蛋白組成，遇水膨脹成為飽滿富有彈性的黏性層，將魚(yú)卵附著在基質(zhì)或魚(yú)巢中。這些黏性物質(zhì)可以被蛋白酶分解，這表明這些黏性物質(zhì)的基本成分是蛋白質(zhì)[45]。

鱘魚(yú)卵的黏性成因仍然知之甚少。鱘魚(yú)卵受精后吸收水分形成卵黃周隙空間，從而引發(fā)卵膜膨脹并導(dǎo)致卵黏附[46-48]。卵泡上皮細(xì)胞的分泌物轉(zhuǎn)化形成了黏性層，這一層被認(rèn)為是另一個(gè)卵泡上皮細(xì)胞層，但其更接近于放射帶。目前，這一黏性外層的存在已在多個(gè)鱘類中得到證實(shí)[49-53]。黏性層的主要成分是含有唾液酸的相對(duì)分子質(zhì)量為110 000的糖蛋白 ，因此，使用蛋白水解酶可以有效地分解黏性層中的蛋白質(zhì)。不同種的鱘類形成的黏性層厚度也有所不同[54]，高首鱘Acipensertransmontanus的黏性層厚度為0.30～0.64 μm，西伯利亞鱘Acipenserbaerii為0.5～0.9 μm[55]。當(dāng)卵子遇水后，外層在水中非生物因子的影響下產(chǎn)生黏性，如滲透壓、pH、溫度和離子含量(NaCl、KCl、CaCl2、Mg2SO4)等外部因素均會(huì)影響魚(yú)卵黏附的分子機(jī)制。

3 產(chǎn)黏性卵魚(yú)類人工授精及孵化技術(shù)

魚(yú)類人工繁育成功與否的主要因素是能否獲得高質(zhì)量的受精卵。產(chǎn)黏性卵的魚(yú)類，由于卵的黏性特質(zhì)導(dǎo)致在人工授精和孵化過(guò)程中存在較多困難，例如，卵膜表層結(jié)構(gòu)遇水反應(yīng)導(dǎo)致黏性卵在短時(shí)間內(nèi)失去受精能力，受精卵黏連結(jié)塊致使內(nèi)部氣體交換困難，進(jìn)一步導(dǎo)致孵化率下降等。因此，產(chǎn)黏性卵的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類人工授精及孵化方法是生產(chǎn)過(guò)程中延續(xù)至今的研究課題，主要研究思路為兩個(gè)方向： ① 黏性魚(yú)卵的脫黏授精孵化法，使用簡(jiǎn)便易操作的物理或化學(xué)方法使受精卵失去黏性，如利用黃泥漿水進(jìn)行機(jī)械脫黏和利用水解蛋白酶進(jìn)行化學(xué)脫黏，脫黏后再進(jìn)行受精卵的孵化；② 人工魚(yú)巢接卵孵化法，此方法模擬自然環(huán)境中產(chǎn)黏性卵魚(yú)類的孵化條件，將受精卵接卵并附著在人工魚(yú)巢上進(jìn)行孵化。常用的有棕櫚、水草為代表的傳統(tǒng)材料魚(yú)巢，聚乙烯網(wǎng)片為代表的新材料魚(yú)巢等。

3.1 脫黏孵化法

脫黏法是在人工催產(chǎn)的基礎(chǔ)上，先授精后脫黏，之后流水孵化的技術(shù)，此方法有效解決了黏性魚(yú)卵人工授精及孵化過(guò)程中的一些困難，具有受精率高、孵化管理方便、孵化效果好而穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，可以成批獲得規(guī)格整齊的魚(yú)苗。脫黏法大致可分為物理脫黏法和化學(xué)脫黏法。

3.1.1 物理脫黏法 物理脫黏主要利用脫黏劑對(duì)魚(yú)卵進(jìn)行處理，例如黃泥漿、滑石粉、淀粉或富勒氏土等，使魚(yú)卵脫去黏性。亦可使用機(jī)械裝置對(duì)黏性卵進(jìn)行沖洗分離魚(yú)卵，通過(guò)機(jī)械作用除去魚(yú)卵表面的黏液使魚(yú)卵脫去黏性。其中，最具代表性的方法是黃泥漿脫黏法，即采用黃泥漿與受精卵攪拌使之脫黏，然后洗去泥漿進(jìn)行孵化。羅俊烈[56]采用鯽Carassiusauratus、鯪Cirrhinusmolitorella人工雜交后利用黃泥漿進(jìn)行脫黏，然后流水孵化，此方法受精率可達(dá)92%，孵化率可達(dá)86%。 Monaco等[57]使用黃泥漿人工去除了高首鱘魚(yú)卵黏性，孵化率為54%～57%。Chebanov等[58]認(rèn)為，富勒氏土是最有效的物質(zhì)之一，但缺點(diǎn)是處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使用黃泥漿和富勒氏土處理需要35～45 min。

陳力等[59]對(duì)白斑狗魚(yú)Esoxlucius的受精卵進(jìn)行脫黏試驗(yàn)，并使用6種材質(zhì)的脫黏劑進(jìn)行對(duì)比，分別為黃泥漿、滑石粉、生粉(淀粉)、牛奶、生豆?jié){和熟豆?jié){，對(duì)親魚(yú)人工催產(chǎn)授精后加入脫黏劑，結(jié)果表明，滑石粉脫黏效果最好，在顯微鏡下可觀察到卵的表面有大量分布均勻的小顆粒，適于規(guī)?；斯な诰a(chǎn)。郭長(zhǎng)江等[60]對(duì)達(dá)氏鰉Husodauricus受精卵用質(zhì)量濃度為200 g/L的滑石粉溶液進(jìn)行脫黏，再用清水清洗后轉(zhuǎn)入尤先科孵化器，取得了良好的效果。

物理脫黏法的原理是利用機(jī)械震蕩和摩擦去除卵表面的黏性物質(zhì)，操作不當(dāng)會(huì)對(duì)受精卵產(chǎn)生損傷，病原體借此大量滋生而導(dǎo)致孵化率降低。Monaco等[57]指出，真菌感染是湖鱘Acipenserfulvescens卵孵化率下降的關(guān)鍵。Bouchard等[61]用質(zhì)量濃度50 mg/L 的緩沖碘液處理魚(yú)卵30 min，然后再分別使用尿素-氯化鈉-單寧酸溶液及富勒氏土脫黏，這樣先消毒再脫黏的方法，雖然耗時(shí)增加，但孵化率高達(dá)99.6%和97.7%。

3.1.2 化學(xué)脫黏法 化學(xué)脫黏法是通過(guò)使用對(duì)魚(yú)卵卵膜產(chǎn)生化學(xué)作用的物質(zhì)處理來(lái)去除魚(yú)卵的黏性，使用的材料包括蛋白水解酶、尿素-氯化鈉混合溶液和單寧酸等。

對(duì)于歐鲇和丁鱥Tincatinca，最有效地去除魚(yú)卵黏性的方法是使用蛋白水解酶。硬骨魚(yú)類的卵被一層厚的蛋白質(zhì)層包覆，可通過(guò)蛋白水解酶分解蛋白質(zhì)層去除黏性。傳統(tǒng)的物理脫黏劑(如黃泥漿、滑石粉和牛奶)在孵化期間通常會(huì)招致細(xì)菌和真菌的大量滋生。使用蛋白水解酶可以降低細(xì)菌和真菌感染的風(fēng)險(xiǎn)[62]。消除魚(yú)卵黏性的常用酶為堿性蛋白酶、麥芽糖酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶。目前，堿性蛋白酶已成功用于去除鯉、丁鱥和歐鲇魚(yú)卵的黏性，該種酶在歐洲的許多孵化場(chǎng)中作為常規(guī)材料使用[63]。以鯉為試驗(yàn)對(duì)象的研究中曾經(jīng)使用過(guò)α-胰凝乳蛋白酶，但其效率(孵化率為50%～70%)比堿性蛋白酶(孵化率為80%～87%)低。麥芽糖酶曾被運(yùn)用在尖齒胡鲇Clariasgariepinus卵脫黏處理中，僅需處理90 s，孵化率即可達(dá)71.6%[64]。此外，經(jīng)6 IU/ mL的胰蛋白酶處理的里海鱘Acipenserpersicus卵，孵化率為86.9%[62]。研究表明，大多數(shù)酶處理通常需要1～2 min，李志等[65]對(duì)異育銀鯽Carassiusauratusgibelio的研究表明，在23 ℃時(shí)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶(pH為7.1～7.4)消化4 min可獲得脫黏受精卵。

尿素和NaCl的混合溶液是水產(chǎn)養(yǎng)殖中去除魚(yú)卵黏性最常用的方法[66]。Kowtal等[67]將高首鱘卵在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的NaCl溶液中處理35 min后，浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的單寧酸10 s，獲得的孵化率為57.7%，與黃泥漿處理組無(wú)明顯差異。比較尿素-氯化鈉-單寧酸溶液和富勒氏土處理湖鱘卵，結(jié)果孵化率分別為84.2%和85.6%[61]。

使用化學(xué)方法處理魚(yú)卵時(shí)，使用劑量和處理時(shí)間對(duì)其成功至關(guān)重要。不正確的劑量和過(guò)長(zhǎng)的處理時(shí)間會(huì)增加死亡率[68]。浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的單寧酸溶液中60～90 s，丁鱥胚胎死亡率達(dá)65%～75%，而仔魚(yú)死亡率則高達(dá)85%～95%[69]。

3.2 人工魚(yú)巢接卵孵化法

采用傳統(tǒng)方法制作的黏性魚(yú)卵附著魚(yú)巢材料主要有棕櫚皮、水草(聚草、金魚(yú)藻)、楊柳根須等。蘇建國(guó)等[71]在人工繁育團(tuán)頭魴的試驗(yàn)中，利用楊樹(shù)根、棕櫚皮制作魚(yú)巢，孵化率為20%左右。楊雪軍等[72〗研究了黃顙魚(yú)對(duì)不同人工魚(yú)巢的產(chǎn)卵偏好，發(fā)現(xiàn)半球形棕櫚集卵效果優(yōu)于半球形塑料和尼龍漁網(wǎng)制作的魚(yú)巢。張勝利[73]研究了用3種材料(芒萁片、棕櫚片、聚乙烯纖維)制作魚(yú)巢對(duì)錦鯉的集卵效果，發(fā)現(xiàn)芒萁制作的魚(yú)巢集卵效果最佳。

由于水草易腐爛，楊柳根須和棕櫚皮使用前需經(jīng)水煮曬干，以除去單寧酸等有毒物質(zhì)，其應(yīng)用受到一定限制。刑克智等[74]采用帶框聚乙烯網(wǎng)片，網(wǎng)目為0.55～1.65 mm，網(wǎng)片先平鋪于布卵池，將受精卵布于網(wǎng)片上，待受精卵在網(wǎng)片上黏結(jié)牢固后，放入孵化池進(jìn)行孵化，總孵化率可達(dá)80%。郭文等[75]采用相似的聚乙烯網(wǎng)片作為魚(yú)巢，將未受精的魚(yú)卵整形成單層且緊密排列的卵片后，再進(jìn)行授精，避免了魚(yú)卵變成團(tuán)塊狀，使魚(yú)卵受精時(shí)能與精子充分接觸，提高了魚(yú)卵受精率。

表1 常見(jiàn)養(yǎng)殖魚(yú)類黏性卵脫黏方法及孵化率Tab.1 De-adhesion methods of adhesive eggs and corresponding hatching rates in common fishes

4 存在問(wèn)題及展望

抑制魚(yú)卵黏性的活化，或使已經(jīng)與水化合發(fā)生黏附的魚(yú)卵脫黏，是黏性卵人工繁育技術(shù)革新最重要的研究方向之一。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)外科研人員的不斷努力下，被作為研究對(duì)象的魚(yú)類愈加廣泛，對(duì)黏性卵的研究也日漸深入，但仍存在一定局限和不足。本研究中綜合國(guó)內(nèi)外學(xué)者的最新研究進(jìn)展，在黏性卵研究?jī)?nèi)容較為薄弱方面提出了幾點(diǎn)尚需加強(qiáng)和拓展的研究?jī)?nèi)容，以期為今后的研究提供參考。

1) 建立黏性卵黏附程度的統(tǒng)一量化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。目前只能憑借肉眼簡(jiǎn)單鑒別非黏性卵、弱黏性卵和黏性卵，實(shí)際上，不同魚(yú)類黏性卵的黏性程度存在較大差異。卵黏性程度不同，意味著黏性卵的表面超微結(jié)構(gòu)、表面黏性層成分、黏性機(jī)制有差異，生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)卵黏性的抑制及針對(duì)性脫黏處理方法也不同。因此，建立黏性卵黏附程度的統(tǒng)一量化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)是黏性卵研究的基礎(chǔ)之一，可以作為今后的一個(gè)基礎(chǔ)性研究方向。

2) 加強(qiáng)對(duì)黏性卵表面結(jié)構(gòu)特別是超微結(jié)構(gòu)的研究。目前，黏性卵表面結(jié)構(gòu)的分類系統(tǒng)尚無(wú)學(xué)術(shù)界較為公認(rèn)的體系。使用先進(jìn)的電子顯微鏡技術(shù)對(duì)黏性卵做深入的超微結(jié)構(gòu)研究，建立各魚(yú)類魚(yú)卵形態(tài)的“數(shù)據(jù)庫(kù)”，完善黏性卵表面結(jié)構(gòu)分類體系，這對(duì)魚(yú)類的辨識(shí)和分類，以及了解魚(yú)類生活的環(huán)境因素十分重要。這些工作不僅僅是基礎(chǔ)性的學(xué)科研究，對(duì)提高人工繁育效率和改進(jìn)工廠化養(yǎng)殖技術(shù)也具有重大指導(dǎo)意義。

3) 加強(qiáng)黏性卵表面黏性成分的研究。黏性卵通常具有形態(tài)與生化雙重黏附機(jī)制，目前僅對(duì)少數(shù)魚(yú)類黏性卵表面黏性成分進(jìn)行了詳盡的描述，且這些黏性蛋白成分的成因，遇水化合反應(yīng)后對(duì)卵表面結(jié)構(gòu)變化的影響等，現(xiàn)有研究成果還有較大的延展空間，可以作為重要的研究方向。特別是對(duì)黏性卵表面蛋白質(zhì)和黏多糖成分的研究，可以指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，有針對(duì)性地使用蛋白酶分解的方法，對(duì)魚(yú)卵進(jìn)行高效且低成本的脫黏處理。

4) 脫黏技術(shù)的改進(jìn)。現(xiàn)有關(guān)于黏性卵魚(yú)類的人工繁育孵化技術(shù)中，最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一是對(duì)黏性卵的脫黏。實(shí)際生產(chǎn)中還可以考慮使用配方溶液，在黏性卵發(fā)生黏附之前抑制黏附，這可能是一種更有效的方法。