趙譚軍，尹文露，鄒煬，劉麗，宋堅(jiān)，常亞青，湛垚垚

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

精子冷凍保存技術(shù)是動(dòng)物種質(zhì)資源保存的重要技術(shù)手段，也是目前畜牧業(yè)和漁業(yè)中種質(zhì)保存及提供育種基礎(chǔ)材料的重要途徑[1-2]。水產(chǎn)動(dòng)物的精子冷凍保存技術(shù)與方法的研究最早始于20世紀(jì)50年代，英國(guó)學(xué)者Blaxter[3]首次探討了大西洋鯡Clupeaharengus精巢(testis)的冷凍保存技術(shù)與方法，隨后，精子冷凍保存技術(shù)與方法的研究在其他水產(chǎn)生物(尤其是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種)中陸續(xù)開(kāi)展起來(lái)。目前，水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中精子冷凍技術(shù)與方法研究開(kāi)展得相對(duì)廣泛、體系相對(duì)成熟的種類(lèi)主要有魚(yú)類(lèi)[4-7]、貝類(lèi)[8-10]和甲殼類(lèi)[11-15]，而關(guān)于棘皮動(dòng)物精子冷凍方法的研究則相對(duì)滯后。關(guān)于海膽類(lèi)精子冷凍保存方法的研究見(jiàn)于中間球海膽Strongylocentrotusintermediushe和新西蘭巨海膽Evechinuschloroticus[16-17]，這兩種海膽精子的冷凍保存液均由過(guò)濾海水和不同終體積分?jǐn)?shù)的冷凍保存劑二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)配制；而關(guān)于棘皮動(dòng)物中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的海參類(lèi)精子冷凍方法的研究，僅見(jiàn)Shao等[18]的報(bào)道，此報(bào)道中，刺參Apostichopusjaponicus精子的冷凍保存液以蒸餾水為溶劑，加以一定質(zhì)量的NaCl、KCl和CaCl2等5種鹽類(lèi)和終體積分?jǐn)?shù)為15%的DMSO配制而成，不同降溫方式為：先將聚乙烯網(wǎng)冷凍30 min，后在距離液氮6 cm處的聚乙烯網(wǎng)上放置0.5 mL的聚乙烯管(內(nèi)含冷凍保存的精子與冷凍保存液)平衡15 min，然后直接投入液氮再轉(zhuǎn)移到容器中，對(duì)刺參精子僅進(jìn)行了1 h冷凍保存，結(jié)果顯示，冷凍1 h后復(fù)蘇的刺參精子壽命僅為1 200 s，由于冷凍時(shí)間過(guò)短且復(fù)蘇后精子壽命較短，因此，該研究所提供的方法并不具備長(zhǎng)期保存刺參精子及在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用的潛力。

刺參隸屬于棘皮動(dòng)物門(mén)Echinodermata游走亞門(mén)Eleutherozea海參綱Holothuroidea，廣泛分布于全球溫帶區(qū)及熱帶區(qū)海洋，是最常見(jiàn)的海洋高等無(wú)脊椎動(dòng)物，也是重要的漁業(yè)經(jīng)濟(jì)種類(lèi)之一[19]。20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著人們對(duì)刺參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值認(rèn)識(shí)的不斷提高，刺參的市場(chǎng)需求日益增長(zhǎng)，人工養(yǎng)殖及刺參商品加工等產(chǎn)業(yè)的規(guī)模也逐年擴(kuò)大。作為全球刺參的主要生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，中國(guó)養(yǎng)殖刺參的年產(chǎn)量從2013年的19.4萬(wàn)t增加至2018年的22.0萬(wàn)t[20-21]。然而，受全球氣候變化、生態(tài)環(huán)境破壞、水質(zhì)污染和過(guò)度捕撈等多種因素影響，近年來(lái)，野生刺參的資源量急劇減少，養(yǎng)殖刺參則由于良種選育周期長(zhǎng)、常年近交繁殖和雜交育種基礎(chǔ)材料匱乏等原因而出現(xiàn)種質(zhì)退化和單產(chǎn)降低等問(wèn)題，嚴(yán)重制約和影響了刺參產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。為解決以上問(wèn)題，本研究中從精子冷凍保存的關(guān)鍵環(huán)節(jié)著手，在借鑒其他水產(chǎn)物種相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，對(duì)刺參精子冷凍保存過(guò)程中的降溫方式、冷凍保存液、精子與冷凍保存液混合比例及復(fù)蘇溫度4個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行比較和篩選，以期初步獲得一種能夠長(zhǎng)期冷凍保存刺參精子及建立刺參精子資源冷凍庫(kù)的方法，以便高效利用刺參良種繁育與雜交育種用精子資源。

1 材料方法

1.1 材料

本研究于2019年5—7月的刺參繁殖期內(nèi)開(kāi)展。試驗(yàn)用30頭刺參取自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，自繁家系(濕體質(zhì)量為450～650 g/頭)發(fā)育良好且健康有活力。目前，由于無(wú)相對(duì)成熟的技術(shù)可以進(jìn)行刺參活體的性別鑒定，因此，在試驗(yàn)前按照常規(guī)方法對(duì)試驗(yàn)用刺參進(jìn)行促熟和催產(chǎn)[22]，并根據(jù)其排出的配子進(jìn)行雌雄鑒別，隨后將雌雄個(gè)體分開(kāi)暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室500 L 循環(huán)水槽中。暫養(yǎng)期間，每3日換水一次，每日投喂自制飼料(1 kg海泥中加入10 g酵母和10 g螺旋藻粉)，循環(huán)水槽24 h充分溶氧，自然光照周期。

1.2 方法

1.2.1 精液的獲得與精子質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn) 隨機(jī)選取暫養(yǎng)后恢復(fù)較好的雄性刺參，于冰上解剖，取其生殖腺于無(wú)菌濾紙上吸干體腔液，用消毒剪刀剪碎組織，將釋放出的精液置于2 mL無(wú)菌凍存管中，即為本研究后續(xù)試驗(yàn)所用的精液樣本，試驗(yàn)中對(duì)每次采集到的鮮精液均進(jìn)行精子質(zhì)量檢驗(yàn)，精子活率達(dá)到85%以上的用于精子冷凍保存研究(表1)。

根據(jù)齊文山等[6]的方法，本研究中以精子活率、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間及精子壽命作為評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的3個(gè)指標(biāo)，其中，精子活率指隨機(jī)視野中運(yùn)動(dòng)精子占該視野全部精子的百分比，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間指精子激活到轉(zhuǎn)入慢速運(yùn)動(dòng)的時(shí)間，精子壽命指從精子激活開(kāi)始運(yùn)動(dòng)到99%精子停止運(yùn)動(dòng)的時(shí)間。按照文獻(xiàn)[6]中的方法，用吸管醮取少許精液涂抹在載玻片上，滴加一滴海水激活，在顯微鏡下(Leica，DM4 B，德國(guó))觀察并記錄精子活率、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和精子壽命，以3次獨(dú)立試驗(yàn)作為重復(fù)。

表1 各篩選步驟所用刺參的精子質(zhì)量Tab.1 Sperm quality of sea cucumber Apostichopus japonicus used in each screening step

1.2.2 降溫方式的篩選 利用超純水、葡萄糖(glucose)(12 g/L)、NaCl(7 g/L)、KCl(0.7 g/L)與冷凍保存劑二甲基亞砜(DMSO)(純度≥99.7%)配制成DMSO終體積分?jǐn)?shù)為10%的精子冷凍保存液，按照精液與冷凍保存液體積比為1∶1的比例混勻后放入無(wú)菌、干燥的2 mL凍存管中，按照A、B、C 3種降溫方式，進(jìn)行冷凍保存，3種降溫方式具體操作如下：

A：4 ℃下平衡5 min，置于-80 ℃下過(guò)夜(12 h)，最后液氮保存；

B：4 ℃下平衡5 min，置于-20 ℃下平衡30 min，之后于-80 ℃下過(guò)夜(12 h)，最后液氮保存；

C：三步法，將冷凍管先懸置于距離液氮表面15 cm處10 min，然后置于液氮表面處5 min，最后再浸入液氮中冷凍保存。

分別選取按照A、B、C 3種降溫方式冷凍保存48 h后的刺參精子，于37 ℃恒溫水浴短時(shí)快速?gòu)?fù)蘇至完全融化無(wú)冰晶存在，立即取出，于顯微鏡下觀察并記錄精子質(zhì)量，重復(fù)3次，篩選出最佳的刺參精子降溫方式。

1.2.3 精子冷凍保存液的篩選 目前，用于配制水產(chǎn)動(dòng)物精子冷凍保存液的溶劑主要有海水[8,16]和蒸餾水[5-7]，因此，本研究中也分別嘗試使用過(guò)濾消毒海水和超純水分別配制刺參精子冷凍保存液。由于海水是刺參精子的激活劑，為避免刺參精子在海水溶劑中由于過(guò)活躍而導(dǎo)致冷凍過(guò)程中的機(jī)械損傷，同時(shí)盡量延長(zhǎng)精子壽命，本研究中借鑒了魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存液[5-7]和Shao等[18]刺參精子冷凍的配方，即加入一定比例的NaCl、KCl和CaCl2以抑制精子的活動(dòng)，加入一定量的葡萄糖以延長(zhǎng)精子壽命。預(yù)試驗(yàn)顯示，以海水作為溶劑配制的含有NaCl、KCl、CaCl2和葡萄糖的精子冷凍保存液，冷凍保存刺參精子1～2 h后，復(fù)蘇的刺參精子活率在10%以上，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)正式篩選試驗(yàn)。

利用煮沸消毒海水或超純水作為溶劑，分別加入葡萄糖、NaCl、KCl、海藻糖(trehalose)和無(wú)水CaCl2配制3種精子稀釋液(表2)，在3種稀釋液中加入DMSO(純度≥99.7%)、甘油(Glycerine，Gly)(純度≥99.0%)或1,2-丙二醇(1,2-Propylene Glycol，1,2- G)(純度≥99.0%)抗凍保護(hù)劑，配制成冷凍保存劑終體積分?jǐn)?shù)為5%、10%和15%的27種精子冷凍保存液(表3)，以精液與冷凍保存液體積比為1∶1的比例混合，用三步法降溫方式進(jìn)行冷凍保存，冷凍保存48 h后的刺參精子，于37 ℃恒溫水浴短時(shí)快速?gòu)?fù)蘇至完全融化無(wú)冰晶存在，立即取出，于顯微鏡下觀察并記錄精子質(zhì)量，試驗(yàn)重復(fù)3次，篩選出最佳的刺參精子冷凍保存液。

表2 刺參精子稀釋液的組成成分Tab.2 Ingredient of sperm cryopreservation diluents of sea cucumber Apostichopus japonicus

表3 刺參精子冷凍保存劑的組成成分Tab.3 Composition of sperm cryopreservation solution of sea cucumber Apostichopus japonicus

1.2.4 精子與冷凍保存液混合比例的篩選 分別以精液與冷凍保存液體積比為1∶1、1∶2和1∶3的3種比例，將刺參精子與最佳精子冷凍保存液Aj-20進(jìn)行混合均勻，按照三步法降溫方式進(jìn)行冷凍保存，冷凍保存48 h后的刺參精子，于37 ℃恒溫水浴短時(shí)快速?gòu)?fù)蘇至完全融化無(wú)冰晶存在立即取出，于顯微鏡下觀察并記錄精子質(zhì)量，試驗(yàn)重復(fù)3次，篩選出最佳的刺參精子與冷凍保存液混合比例。

1.2.5 冷凍精子復(fù)蘇溫度的篩選 分別以精液與冷凍保存液體積比為1∶1和1∶2的2種比例，將刺參精子與最佳精子冷凍保存液Aj-20進(jìn)行混合均勻，按照三步法降溫方式進(jìn)行冷凍保存，冷凍保存48 h后，分別在30 ℃和37 ℃恒溫水浴條件下，對(duì)冷凍保存的精子進(jìn)行短時(shí)快速?gòu)?fù)蘇至完全融化無(wú)冰晶存在，立即取出，于顯微鏡下觀察不同溫度條件下冷凍精子的復(fù)蘇效果，并記錄精子質(zhì)量，試驗(yàn)重復(fù)3次，篩選出最佳的冷凍精子復(fù)蘇溫度。

1.2.6 復(fù)蘇精子的受精及受精卵孵化 從分開(kāi)暫養(yǎng)的刺參中分別選取健康、活力好的雄、雌性刺參各5頭，用常規(guī)方法催產(chǎn)[22]，收集刺參精子與卵子。以精液與冷凍保存液的體積比為1∶2的比例，將刺參精子與冷凍保存液Aj-20進(jìn)行混合均勻，按照三步法降溫方式進(jìn)行冷凍保存，在30 ℃恒溫水浴條件下，分別對(duì)冷凍保存72、120、408 h后的刺參精子進(jìn)行短時(shí)快速?gòu)?fù)蘇至完全融化無(wú)冰晶存在，立即取出進(jìn)行授精。將收集的刺參卵子平均分到24個(gè)1 L的量杯中(注滿(mǎn)海水后卵子約20粒/mL)，將量杯隨機(jī)分為4組：0 h組(鮮精液)、72 h組、120 h組和408 h組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。分別將鮮精液及不同凍存時(shí)間復(fù)蘇后的精子注入相對(duì)應(yīng)的量杯中，加入過(guò)濾海水，水溫為21～22 ℃，每隔1 h上下攪動(dòng)海水，促進(jìn)精卵結(jié)合(精子與卵子數(shù)量的比約為1×106∶1)，受精2 h后，用0.048 mm篩絹洗卵，洗去多余精子，同時(shí)，在每組中隨機(jī)挑選3個(gè)量杯，從每個(gè)量杯中取不少于100粒卵在顯微鏡下觀察受精情況，記錄并統(tǒng)計(jì)受精率(n=3)。 將每組剩余的3個(gè)量杯繼續(xù)在21～22 ℃條件下培養(yǎng)，待培養(yǎng)至受精后第10 h，于Leica顯微鏡下觀察每組剩余3個(gè)量杯中受精卵的囊胚孵化情況，分別記錄并計(jì)算各組的囊胚孵化率。受精至孵化期間，選用過(guò)濾自然海水，溫度保持在21～22 ℃，自然光照周期。

受精率=(受精卵數(shù)/總卵數(shù))×100%，

囊胚孵化率=(囊胚期胚胎數(shù)/受精卵總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 25.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Student-Newman-Keuls法進(jìn)行多重比較和顯著性差異分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺參精子冷凍降溫方式的篩選結(jié)果

以相同的冷凍保存液，分別按照A、B、C 3種降溫方式對(duì)刺參精子進(jìn)行冷凍保存。從表4可見(jiàn)：3種降溫方式冷凍保存的刺參精子活率依次為C>B>A。其中，冷凍保存效果最差的是方式A，采用該降溫方式冷凍保存的刺參精子，復(fù)蘇后精子活率低(2.67%±0.58%)，且快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(0 s)及精子壽命(360.67 s±23.80 s)均顯著低于其他兩組(P<0.05)；冷凍保存的精子質(zhì)量最好的是方式C(三步法)，采用該降溫方式冷凍保存的刺參精子復(fù)蘇后，精子活率(9.67%±1.53%)、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(543.67 s±20.5 s)及精子壽命(968.33 s±14.01 s)均顯著高于其他兩組(P<0.05)。因此，本研究中將方式C(三步法)篩選為刺參精子冷凍保存的最佳降溫方式，用于后續(xù)技術(shù)條件的篩選。

表4 不同降溫方式對(duì)刺參精子活率、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命的影響

2.2 刺參精子冷凍保存液的篩選結(jié)果

從表5可見(jiàn)：在相同條件下，以過(guò)濾消毒海水為溶劑的冷凍保存液(Aj-1～Aj-9)中冷凍保存的刺參精子，復(fù)蘇后均未檢測(cè)到精子活率；而采用冷凍保存液Aj-11(DMSO終體積分?jǐn)?shù)為10%)和Aj-20(DMSO終體積分?jǐn)?shù)為10%)冷凍保存的刺參精子，復(fù)蘇后的精子活率均顯著高于其余25組(P<0.05)，其中，使用Aj-20保存液冷凍保存的刺參精子，復(fù)蘇后精子活率(11.78%±3%)略高于使用Aj-11保存液冷凍保存的精子(11.00%±2.33%)，兩者間并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(431.33 s±63.86 s)、精子壽命(1 012.89 s±79.83 s)則均顯著高于使用Aj-11保存液冷凍保存的精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(227.67 s±7.02 s) 、精子壽命(539.00 s±48.87 s)(P<0.05)。因此，確定Aj-20(12 g/L葡萄糖、7 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、5 g/L海藻糖、0.1 g/L無(wú)水CaCl2和終體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO)冷凍保存液為本研究中篩選到的最佳刺參精子冷凍保存液。

2.3 精子與冷凍保存液配比的篩選結(jié)果

采用“2.1節(jié)”和“2.2節(jié)”中篩選到的刺參精子最佳降溫方式和冷凍保存液，進(jìn)行刺參精液與冷凍保存液混合比例的篩選。從表6可見(jiàn)，在相同條件下，分別以精液與冷凍保存液體積比為1∶1、1∶2、1∶3的3種比例進(jìn)行刺參精子冷凍保存，復(fù)蘇后3種比例條件下冷凍精子的活率分別為(9.00±1.00)%(1∶1)、(11.00±2.00)%(1∶2)和<1%(1∶3)，其中，以精液與冷凍保存液體積比為1∶1和1∶2的2種比例保存效果較好，能夠獲得一定數(shù)量有活力的精子，且精子的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別為(508.00±36.01)、(554.33±25.81)s。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，精液與冷凍保存液體積比為1∶1和1∶2的2種比例保存的精子雖然在精子活率和精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間上并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但是，當(dāng)精液與冷凍保存液比例為1∶2時(shí)，冷凍保存的精子在復(fù)蘇后的壽命顯著高于混合比例為1∶1時(shí)凍存的精子(P<0.05)。因此，初步確定刺參精液與冷凍保存液混合的最適比例為1∶2。

表5 不同冷凍保存液對(duì)刺參精子活率、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命的影響

表6 精液與冷凍保存液配比對(duì)刺參精子活率、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命的影響

2.4 精子復(fù)蘇溫度的篩選結(jié)果

為了進(jìn)一步確認(rèn)“2.3節(jié)”中的初步篩選到的精子與冷凍保存液的最適比例(1∶2)，同時(shí)篩選冷凍保存刺參精子的最佳復(fù)蘇溫度條件，采用精子冷凍保存液Aj-20，分別以精液與冷凍保存液體積比為1∶1或1∶2兩種混合比例，按照三步法降溫方式進(jìn)行刺參精子冷凍保存，將冷凍保存的刺參精子分別在30、37 ℃恒溫水浴中短時(shí)復(fù)蘇后進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。結(jié)果顯示：無(wú)論是30 ℃還是37 ℃條件下復(fù)蘇，以1∶2比例混合的精液與冷凍保存液冷凍保存的精子在復(fù)蘇后，其精子質(zhì)量均高于等比例(1∶1)混合的精液與冷凍保存液，進(jìn)一步證實(shí)刺參精液與冷凍保存液的最適比例為1∶2。此外，當(dāng)冷凍精子在30 ℃條件下復(fù)蘇后，無(wú)論精子活率、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間還是精子壽命，均優(yōu)于37 ℃條件復(fù)蘇組，其中，以精液與冷凍保存液體積比為1∶2配比冷凍保存的刺參精子在30 ℃水浴復(fù)蘇后的精子活率最高，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和精子壽命最長(zhǎng)，且均顯著高于其他組(P<0.05)(表7)。

2.5 復(fù)蘇精子的受精及受精卵孵化試驗(yàn)

按照本研究中篩選出的最適刺參精子冷凍方法進(jìn)行刺參精子冷凍保存，分別將冷凍72、120、408 h后的刺參精子在30 ℃恒溫水浴復(fù)蘇，以復(fù)蘇精子與卵子數(shù)量比為1×106∶1的比例分別與收集到的同一批刺參卵子混合授精并培養(yǎng)，同時(shí)，以等量鮮精液與同一批刺參卵子混合授精并培養(yǎng)。

從圖1可見(jiàn)：冷凍保存0 (鮮精液)、72、120、408 h刺參精子受精率分別為(92.47±2.33)%、(77.63±5.7)%、(83.72±2.33)%、(83.74±3.67)%，受精卵的囊胚孵化率分別為(79.83±2.51)%、(51.49±3.08)%、(56.47±2.56)%、(55.00±2.33)%；冷凍保存72、120、408 h的刺參精子在受精率和受精卵囊胚孵化率方面均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但與鮮精液相比，冷凍保存的刺參精子受精率和受精卵囊胚孵化率均比鮮精液低10%和30%左右，且存在顯著性差異(P<0.05)。研究表明，本研究中的篩選方法適宜于刺參精子的長(zhǎng)期冷凍保存，但仍存在一定的優(yōu)化提升空間。

表7 不同復(fù)蘇溫度對(duì)刺參精子活率、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命的影響

同顏色柱形圖中標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)差異性顯著(P>0.05)。The means with different letters in the same color column chart is significant between groups (P<0.05), and the means with the same letter is not significant between groups (P>0.05).圖1 冷凍保存不同時(shí)間的刺參精子受精率與囊胚孵化率Fig.1 Fertilization rate and blastula hatching rate of sea cucumber Apostichopus japonicus sperm cryopreserved at different time

3 討論

3.1 保存液對(duì)刺參精子冷凍保存效果的影響

適宜的冷凍保存液是進(jìn)行生物配子低溫冷凍保存的基礎(chǔ)前提，對(duì)精子的存活起著至關(guān)重要的作用，可有效防止細(xì)胞膜在冷凍保存時(shí)被降溫過(guò)程中形成的機(jī)械剪切力損傷，以及被胞內(nèi)胞外形成的冰晶刺透，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性[23]。目前，用于冷凍保存精子的冷凍保護(hù)液主要由稀釋液和冷凍保存劑組成。其中，稀釋液是為了提供體外適宜的生理生存環(huán)境，通過(guò)滲透壓的調(diào)節(jié)脫出細(xì)胞中多余的水分，冷凍時(shí)防止細(xì)胞中大的冰晶形成，保護(hù)精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，盡可能減少精子的冷凍損傷，獲得較高的復(fù)蘇后存活率[24]?，F(xiàn)有報(bào)道顯示，水產(chǎn)動(dòng)物精子冷凍保存液配制溶劑主要采用過(guò)濾海水和蒸餾水兩種，其中，海膽[16-17]、貝類(lèi)[8,25-26]和甲殼類(lèi)[11,13]精子冷凍保存液的溶劑主要使用過(guò)濾海水，而魚(yú)類(lèi)[5-7]和海參[18]精子冷凍液的配制則多使用蒸餾水。

Shao等[18]的研究中，刺參精子冷凍液使用蒸餾水為溶劑，而與刺參同屬于棘皮動(dòng)物的海膽精子冷凍保存液溶劑則為消毒海水，因此，本研究中嘗試分別以超純水和消毒海水作為溶劑進(jìn)行刺參精子冷凍保存液的配制。結(jié)果表明，本研究中篩選到的最佳用于刺參精子冷凍的精子稀釋液為以超純水為溶劑配制的Aj-20精子冷凍保存液(12 g/L葡萄糖、7 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、5 g/L海藻糖、0.1 g/L無(wú)水CaCl2和終體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO)，其中，冷凍保存液中的KCl和NaCl提供的K+、Na+是精漿的重要組成成分，可以較好地維持刺參精子的滲透壓；CaCl2提供的Ca2+會(huì)引起精子聚集，使得精子活率降低，對(duì)精子的活動(dòng)具有抑制作用[27]；葡萄糖被證實(shí)可以增強(qiáng)精子活率，延長(zhǎng)精子壽命[27]；海藻糖具有生物保護(hù)作用，可提高生物在低溫時(shí)的存活率[28]。刺參精子的天然等滲液雖然為自然海水，但是，Shao等[18]的研究則是以蒸餾水為溶劑，通過(guò)組合5種鹽類(lèi)配制精子稀釋液，對(duì)刺參精子冷凍保存1 h，復(fù)蘇后的精子壽命僅為1 200 s，并未獲得較好的冷凍效果。此外，與刺參同屬于棘皮動(dòng)物且地理分布區(qū)域比較相似的中間球海膽的精子冷凍保存液組成與本研究中篩選到的最佳刺參精子冷凍保存液在溶劑的選取上差別較大，劉志丹等[16]的研究顯示，以煮沸消毒海水作為溶劑配制的中間球海膽精子冷凍保存液可以有效保護(hù)中間球海膽精子，由此推測(cè)，即使是相似地理分布的同類(lèi)生物，其精子冷凍保存液在配方上也會(huì)存在一定的種屬特異性。

本研中還發(fā)現(xiàn)，以海水為溶劑配制的冷凍保存液冷凍保存刺參精子1～2 h內(nèi)有活力，但冷凍保存48 h后的精子卻無(wú)活力，可能是由于本研究中以海水為溶劑的冷凍保存液中的生理鹽、葡萄糖和抗凍劑等物質(zhì)通過(guò)漸進(jìn)式滲透壓破壞方式影響刺參精子的活率，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。此外，有研究指出，以蒸餾水為溶劑配制精子冷凍液的關(guān)鍵是各種生理鹽的濃度和配比[27]。本研究中曾通過(guò)預(yù)試驗(yàn)對(duì)葡萄糖、NaCl和KCl等的濃度進(jìn)行初步篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，以葡萄糖(15 g/L)、NaCl(10 g/L)、KCl(1 g/L)，以及葡萄糖(12 g/L)、NaCl(7 g/L)、KCl(0.7 g/L)分別配制的兩種精子冷凍保存液進(jìn)行刺參精子冷凍保存(48 h)，復(fù)蘇后的精子活率并無(wú)顯著性差異，且目前關(guān)于以蒸餾水為溶劑配制刺參精子冷凍保存液的可借鑒資料較少，加之受到繁殖季節(jié)和樣本量等因素制約，因此，本著節(jié)約原則，本研究中選擇了葡萄糖(12 g/L)、NaCl(7 g/L)和KCl(0.7 g/L)的生理鹽比例，這也說(shuō)明本研究中篩選到的刺參精子冷凍液配方還有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。

冷凍保存劑的主要作用是保護(hù)細(xì)胞不被溫度速降過(guò)程中由冰晶產(chǎn)生的機(jī)械剪切力所損傷[29]，目前用于生物配子低溫冷凍的抗冷凍保存劑主要有DMSO、Gly、1，2- G、甲醇、乙二醇和雞蛋黃等，其中，DMSO由于毒性較低、抗凍效果好，常被用到石斑魚(yú)、鮭、鱘、扇貝和海膽等水產(chǎn)動(dòng)物的精子冷凍保存[5-7,9,16]，本研究結(jié)果也表明，以DMSO為冷凍保存劑保存的刺參精子質(zhì)量明顯優(yōu)于Gly和1，2-G，從一定程度上證實(shí)了DMSO作為水產(chǎn)動(dòng)物精子冷凍保存劑的優(yōu)勢(shì)。值得注意的是，本研究中發(fā)現(xiàn)，精子與冷凍保存液混合冷凍體系中DMSO的最終體積分?jǐn)?shù)從6.67%升至7.50%時(shí)會(huì)極顯著影響刺參冷凍精子的活率，比如，本研究中以精液與Aj-20冷凍保存液的體積比為1∶3和精液與Aj-21冷凍保存液的體積比為1∶1冷凍保存的刺參精子活率均低于1%，這兩種比例保存液中的DMSO的最終體積分?jǐn)?shù)均為7.50%，高于本研究中篩選到的最佳冷凍保存條件中的DMSO最終體積分?jǐn)?shù)(6.67%)，推測(cè)原因，可能是抗凍劑濃度的增加提高了細(xì)胞毒性，進(jìn)而對(duì)精子造成損傷。進(jìn)一步比較本研究中篩選到的最佳刺參精子冷凍保存液和已經(jīng)報(bào)道的魚(yú)類(lèi)[6]、貝類(lèi)[9]及海膽[16]的精子冷凍保存液發(fā)現(xiàn)，DMSO、Gly等可作為通用冷凍保存劑用于水產(chǎn)動(dòng)物精子冷凍保存液的配制，但在含量配比上卻存在一定的種屬特異性。

3.2 降溫方式對(duì)刺參精子冷凍保存效果的影響

降溫方式是影響冷凍精子質(zhì)量的重要因素之一，冷凍速度過(guò)快，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脫水不充分，不能有效阻止細(xì)胞內(nèi)冰晶的生成。研究發(fā)現(xiàn)，冰晶化只有在0～-60 ℃的條件下緩慢降溫才能生成，降溫越慢，冰晶越大，在-15～-25 ℃時(shí)形成的冰晶最多，對(duì)細(xì)胞危害最大，同時(shí)，冷凍速度過(guò)慢也會(huì)導(dǎo)致精子失水嚴(yán)重，對(duì)精子質(zhì)膜產(chǎn)生較大的壓力應(yīng)激，因此，在冷凍保存過(guò)程中，盡量避開(kāi)這個(gè)有害溫度區(qū)，才能更好地保護(hù)凍存的細(xì)胞[23]。目前，在水產(chǎn)動(dòng)物精子冷凍保存中采用的降溫方式主要有兩種，一種是程序降溫，即利用程序降溫儀器設(shè)定降溫速度進(jìn)行降溫，如李純等[9]利用程序降溫的方法，以20 ℃/min的速度進(jìn)行降溫冷凍保存了櫛孔扇貝Azumapectenfarreri的精子，取得了較好的冷凍效果；另一種則是平衡法降溫，即將精液處在不同溫度節(jié)點(diǎn)進(jìn)行平衡降溫，劉志丹等[16]采用該方法較好地冷凍保存了中間球海膽的精子。本研究結(jié)果顯示，采用平衡法降溫，可以較好地冷凍保存刺參精子，與中間球海膽精子降溫方式具有一定的一致性，表明在進(jìn)行棘皮類(lèi)動(dòng)物精子冷凍保存方法研究時(shí)，可選擇平衡法降溫方法，且該方法操作簡(jiǎn)單，具有較好的應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的潛力。但是，在平衡降溫的具體細(xì)節(jié)上，刺參與中間球海膽仍具有一定差異，這表明采用平衡法降溫進(jìn)行棘皮動(dòng)物精子冷凍保存在具體實(shí)施步驟上具有一定的種屬特異性，應(yīng)根據(jù)具體種類(lèi)的精子特點(diǎn)進(jìn)行篩選。

3.3 復(fù)蘇溫度對(duì)刺參精子冷凍保存效果的影響

復(fù)蘇方法是影響冷凍精子質(zhì)量的最后一環(huán)，其中，適宜復(fù)蘇溫度的確定尤為重要。目前，冷凍精子復(fù)蘇時(shí)的溫度范圍主要有3個(gè)，即低溫冰水復(fù)蘇(0～5 ℃)、溫水復(fù)蘇(30～40 ℃)和高溫復(fù)蘇(50～80 ℃)[23]；水產(chǎn)動(dòng)物冷凍精子的復(fù)蘇溫度主要集中在20～40 ℃(溫水)[5-7,9,16]。比如，哲羅鮭Huchotaimen和云紋石斑魚(yú)Epinehelusmoara等魚(yú)類(lèi)冷凍精子的適宜復(fù)蘇溫度為37 ℃[5-6]，冷凍的櫛孔扇貝精子則在35 ℃水浴中的復(fù)蘇效果最佳[9]，中間球海膽的冷凍精子在20～24 ℃水浴中復(fù)蘇后的活率較好。本研究中發(fā)現(xiàn)，冷凍的刺參精子在30 ℃恒溫水浴中復(fù)蘇后的精子活率較好，本研究結(jié)果與其他水產(chǎn)動(dòng)物冷凍精子復(fù)蘇溫度的數(shù)據(jù)表明，水產(chǎn)動(dòng)物精子冷凍在復(fù)蘇時(shí)間上具有一定的種屬特異性。但是，由于本研究中并未檢測(cè)冷凍的刺參精子在30 ℃以下條件復(fù)蘇后的質(zhì)量，因此，刺參精子冷凍保存方法在復(fù)蘇溫度的選擇上可能存在優(yōu)化空間。

與Shao等[18]報(bào)道的刺參精子冷凍方法相比，本研究中篩選到的最佳刺參精子冷凍保存方法在冷凍保存液的鹽類(lèi)組成上相對(duì)簡(jiǎn)單，篩選到的冷凍保存液中的鹽類(lèi)僅有3種，而Shao等[18]的研究中鹽類(lèi)有5種，如未來(lái)應(yīng)用于生產(chǎn)，本研究中的方法可以節(jié)約成本；其次，采用本研究中篩選到的方法進(jìn)行刺參精子冷凍保存，復(fù)蘇后精子壽命為(2 817.33±93.76)s，是Shao等[18]報(bào)道中復(fù)蘇后精子壽命的2.3倍，且本研究中所保存的精子時(shí)間為408 h，比Shao等[18]報(bào)道中的冷凍保存1 h更久；最后，雖然使用本研究中篩選到的方法進(jìn)行刺參精子冷凍，獲得的復(fù)蘇精子活率僅有19%左右，但是，在實(shí)際操作中，本研究中通過(guò)提高復(fù)蘇精子與卵的比例(一般情況精子與卵子數(shù)量的比例為(1×103～1×104)∶1，而本研究中精子與卵子數(shù)量的比例為1×106∶1)，也獲得了比較理想的受精率和胚胎孵化率，且通過(guò)比較3個(gè)冷凍保存不同時(shí)間復(fù)蘇后的刺參精子的受精能力及受精卵的發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)，冷凍保存72、120、408 h的刺參精子的受精能力與受精卵的囊胚孵化率并無(wú)顯著性差異，這表明本研究中篩選到的最佳技術(shù)方法可以用于刺參精子的長(zhǎng)期冷凍保存，具有較好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的潛力。

4 結(jié)論

1)將冷凍管懸置在距離液氮表面15 cm處10 min，然后再將冷凍管懸置在液氮表面處5 min，最后將冷凍管浸入液氮中冷凍保存的降溫方式，為本研究中篩選到的刺參精子冷凍保存最佳降溫方式。

2)以超純水為溶劑配制的 Aj-20 冷凍保存液(12 g/L葡萄糖、7 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、5 g/L海藻糖、0.1 g/L無(wú)水CaCl2和終濃度為10%的DMSO)為本研究中篩選到的刺參精子最佳冷凍保存液。

3)精子與冷凍保存液的混合比例1∶2為本研究中篩選到的最佳混合比例。

4)30 ℃水浴短時(shí)迅速?gòu)?fù)蘇溫度為本研究中篩選到的刺參精子最佳復(fù)蘇溫度。

5)按照本研究中篩選出的最佳冷凍方法進(jìn)行刺參精子冷凍保存408 h，復(fù)蘇后的精子與卵子的受精率可達(dá)83.74%，囊胚孵化率可達(dá)55.00%，表明本研究中篩選到的最佳冷凍保存技術(shù)方法可用于刺參精子的長(zhǎng)期冷凍保存，具有較好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的潛力。