劉明麗，楊文意，王金鳳，陳良標(biāo)*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306;2.國(guó)家海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心, 上海201306;3.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海201306)

變溫動(dòng)物無(wú)法使身體的溫度保持恒定，其體溫只能隨環(huán)境的變化而變化。魚(yú)類(lèi)作為典型的變溫動(dòng)物，其行為和體內(nèi)生理變化都在一定范圍內(nèi)受到水溫變化的影響，因此，水溫對(duì)魚(yú)類(lèi)的生存具有重要的影響。當(dāng)水溫急劇降低，會(huì)使魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生冷應(yīng)激。然而即使在同一低溫脅迫下，不同的魚(yú)類(lèi)對(duì)于冷脅迫耐受卻存在較大的差別，而造成這種低溫耐受差異的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

模式動(dòng)物斑馬魚(yú)Daniorerio是一種廣溫性的魚(yú)類(lèi)，其體型較小，性成熟周期短，能夠忍受水溫季節(jié)性較廣的溫度波動(dòng)[1-2]。有試驗(yàn)表明，斑馬魚(yú)在一定時(shí)間內(nèi)能夠忍受9 ℃的低溫[1]，與斑馬魚(yú)相比，羅非魚(yú)Oreochromisniloticus忍受低溫的能力則較弱。同樣的降溫策略下比較羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)的耐寒性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷8 ℃、12 h的低溫后羅非魚(yú)出現(xiàn)了死亡的現(xiàn)象，但是斑馬魚(yú)只是出現(xiàn)了身體失去平衡的現(xiàn)象，并沒(méi)有死亡，這表明在這種降溫策略下斑馬魚(yú)比羅非魚(yú)的耐寒能力更強(qiáng)[3]。研究者通過(guò)對(duì)兩種魚(yú)類(lèi)死亡前各時(shí)間點(diǎn)各組織的凋亡信號(hào)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)的鰓組織在8 ℃、6 h時(shí)出現(xiàn)大量的凋亡信號(hào)，但是斑馬魚(yú)鰓中卻幾乎沒(méi)有凋亡信號(hào)，并且這種凋亡信號(hào)只在鰓組織中比較明顯，在其他組織幾乎檢測(cè)不到[3]。除此之外，一些魚(yú)類(lèi)的鰓組織在應(yīng)對(duì)低溫刺激時(shí)表現(xiàn)出很強(qiáng)的形態(tài)可塑性[4-6]，并且有許多關(guān)于魚(yú)類(lèi)鰓組織響應(yīng)低溫刺激的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析[7-8]，這些均表明鰓組織細(xì)胞凋亡可能是魚(yú)類(lèi)耐受低溫的薄弱環(huán)節(jié)。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是一種機(jī)體在一定程度的壓力條件下為了避免受到壓力的損傷而采取的一種積極主動(dòng)的適應(yīng)性措施[9]。在細(xì)胞凋亡早期，可以通過(guò)對(duì)受到壓力導(dǎo)致的不能恢復(fù)的細(xì)胞進(jìn)行清除以達(dá)到保護(hù)組織免受壓力損傷的目的，但是當(dāng)細(xì)胞凋亡積累到一定程度時(shí)也會(huì)使組織受到不可恢復(fù)的損傷甚至最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。腫瘤抑制因子P53是一種能夠促凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也能抑制抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，所以在凋亡發(fā)生中其起到重要作用[10]。但是過(guò)量的P53對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是有毒的，因此，細(xì)胞會(huì)形成一種負(fù)反饋機(jī)制監(jiān)測(cè)P53發(fā)揮作用[11-12]。在這個(gè)負(fù)反饋調(diào)控中MDM2(murine double minutes 2)是一個(gè)主要的調(diào)控子[13]，其N(xiāo)末端結(jié)構(gòu)域和P53的N末端結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，一方面遮住了P53的N末端轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域直接阻止其轉(zhuǎn)錄活性[14]，另一方面啟動(dòng)P53泛素化導(dǎo)致其被蛋白酶體系統(tǒng)降解[15]。除此之外，MDM2包含核輸出信號(hào)，可以通過(guò)直接的相互作用誘導(dǎo)P53核輸出，從而抑制細(xì)胞凋亡[16-17]。由于MDM2既能受到P53的誘導(dǎo)也反過(guò)來(lái)能抑制P53的功能[12]，因此，這種調(diào)控呈現(xiàn)出一種反饋回路的調(diào)控模式。此外，MDM2-P53反饋回路會(huì)受到核糖體生物發(fā)生過(guò)程的調(diào)控[18]，如核糖體蛋白(ribosomal proteins，RPs)RPL11與MDM2結(jié)合抑制其泛素化連接酶的活性，從而激活P53[18-19]。

由于斑馬魚(yú)和羅非魚(yú)在同樣的低溫處理下，其鰓組織凋亡的信號(hào)出現(xiàn)的時(shí)間差異很大[3]，那么這種差異是否與RPL11/MDM2/P53通路有關(guān)，為了研究這個(gè)問(wèn)題，本試驗(yàn)中將羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)暴露在同一梯度低溫下，觀察羅非魚(yú)、斑馬魚(yú)在低溫下呈現(xiàn)出不同的運(yùn)動(dòng)能力和反應(yīng)情況，通過(guò)Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction，RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)RPL11/MDM2/P53通路中相關(guān)蛋白和基因表達(dá)量的變化，分析這些信號(hào)通路在不同低溫耐受能力的魚(yú)中呈現(xiàn)出的表達(dá)模式，旨在為不同魚(yú)類(lèi)低溫耐受能力機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型羅非魚(yú)親魚(yú)取自青島羅非魚(yú)良種場(chǎng)，野生型斑馬魚(yú)親魚(yú)取自中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，均在水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室恒溫魚(yú)房?jī)?nèi)人工繁殖和飼養(yǎng)。試驗(yàn)用羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)發(fā)育到4個(gè)月時(shí)分別按雌雄比為1∶1的比例篩選試驗(yàn)用魚(yú)，然后統(tǒng)一在28 ℃下條件下暫養(yǎng)2個(gè)月，最后取6月齡的魚(yú)用于試驗(yàn)研究。

1.2 方法

1.2.1 低溫處理方法和樣品采集 按照Hu等[3]的降溫策略，待水溫降到8 ℃后，分別于0、3、6、9 h取斑馬魚(yú)和羅非魚(yú)的鰓組織存放于液氮中，用于組織蛋白提取和RNA樣品制備。然后取28 ℃下養(yǎng)殖的斑馬魚(yú)和羅非魚(yú)鰓組織作為對(duì)照樣品。在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)分別取3尾羅非魚(yú)和18尾斑馬魚(yú)，其中每3尾斑馬魚(yú)的鰓組織混合作為一個(gè)樣品提取蛋白，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，另取9尾斑馬魚(yú)每3尾魚(yú)的鰓組織單獨(dú)作為一個(gè)樣品用來(lái)提取RNA。

1.2.2 鰓組織蛋白提取和RNA樣品收集 將斑馬魚(yú)鰓組織從液氮中取出，放置于冰上的錫箔紙上，待其將要融化時(shí)放到潔凈的提前加入RIPA裂解液(購(gòu)自Sigma，使用前加入PMSF)的玻璃勻漿器中，于冰上輕輕勻速研磨組織直到組織裂解，然后將裂解液移至離心管中，放置于冰上繼續(xù)裂解。

羅非魚(yú)鰓組織取出后置于提前加入液氮的研缽中研磨至粉末狀，用藥匙將粉末分別轉(zhuǎn)移到提前加入RIPA裂解液和TRIZOL reagent(購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司)的離心管中，放置于冰上繼續(xù)裂解15 min，直至組織完全裂解。待組織樣品充分裂解后，將其在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。對(duì)獲得的上清液蛋白進(jìn)行BCA法蛋白濃度測(cè)定(試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司)，根據(jù)測(cè)得濃度添加裂解液至所有樣品保持在同一濃度水平。然后根據(jù)獲得的蛋白體積按比例加入4×Protein SDS PAGE loading(購(gòu)自TaKaRa)，混勻后于95～100 ℃水中煮15 min，保存于-20 ℃冰箱中用于后續(xù)Western blot試驗(yàn)。

1.2.3 蛋白Western blot試驗(yàn) 按照常規(guī)方法配制12%(體積分?jǐn)?shù))SDS-PAGE 蛋白凝膠。將蛋白樣品加入蛋白膠孔中，給予合適的電壓使蛋白在凝膠上面分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，吸出封閉牛奶，直接加入20 g/L脫脂牛奶稀釋過(guò)的一抗(anti-β-actin抗體購(gòu)自杭州華安生物有限公司，anti-P53抗體和anti-RPL11抗體購(gòu)自Abcam公司)于4 ℃孵育過(guò)夜或者室溫孵育2 h，然后吸出一抗，加入1×TBST漂洗液(購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司)洗滌3次，每次5 min。再加入二抗于室溫孵育2 h，回收二抗后加入1×TBST漂洗液洗滌3次，每次5 min。在洗好的膜中盡快加入ECL顯影液(購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司)曝光拍照。

1.2.4 RNA提取和定量PCR試驗(yàn) 將斑馬魚(yú)鰓組織從液氮中取出置于冰上面的錫箔紙上，待其將要融化時(shí)放到潔凈的提前加入TRIZOL reagent的玻璃勻漿器中，于冰上輕輕勻速研磨組織直到組織裂解，然后將裂解液移至離心管中，放置于冰上繼續(xù)裂解，直至組織完全裂解；待組織樣品充分裂解后，嚴(yán)格按照TRIZOL reagent的操作說(shuō)明提取樣品中RNA，最后加入40 μL DEPC水(購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司)溶解RNA；對(duì)得到的RNA樣品進(jìn)行濃度測(cè)定并置于超低溫冰箱(-80 ℃)中凍存。對(duì)提取的RNA樣品進(jìn)行去基因組的反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)(去DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司)得到cDNAs。用在線IDT軟件設(shè)計(jì)qPCR引物，引物序列見(jiàn)表1和表2。用SYBR Green法對(duì)目的基因及內(nèi)參基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

表1 用于定量PCR的羅非魚(yú)引物Tab.1 Primers for tilapia qPCR

表2 用于定量PCR的斑馬魚(yú)引物Tab.2 Primers for zebrafish qPCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Image J軟件對(duì)Western blot試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± S.D.)表示。用t檢驗(yàn)對(duì)低溫各組與常溫下蛋白或基因表達(dá)進(jìn)行差異顯著性分析。用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用Turkey’s法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)對(duì)低溫脅迫的耐受差異

使用Hu等[3]的降溫步驟，將養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的水溫從28 ℃勻速降到18 ℃，這個(gè)過(guò)程耗時(shí)12 h;在18 ℃停留12 h后，繼續(xù)勻速降到8 ℃，這個(gè)降溫過(guò)程耗時(shí)12 h；然后在8 ℃低溫下再經(jīng)歷9 h。在整個(gè)降溫過(guò)程中會(huì)停止投喂食物以免因水質(zhì)破壞導(dǎo)致多重不可控制的應(yīng)激發(fā)生。剛開(kāi)始降溫時(shí)，在水溫到達(dá)8 ℃之前兩種魚(yú)都能保持身體平衡，但是運(yùn)動(dòng)能力出現(xiàn)不同程度的減弱，鰓的張合頻率稍稍變快。待水溫剛降到8 ℃后斑馬魚(yú)還能繼續(xù)保持身體的平衡，但是不喜運(yùn)動(dòng)，而羅非魚(yú)則慢慢出現(xiàn)失去平衡的狀態(tài)，直至到達(dá)6 h以后，斑馬魚(yú)逐漸開(kāi)始出現(xiàn)失去平衡的現(xiàn)象。9 h后羅非魚(yú)的鰓不再?gòu)埡?，但是解剖發(fā)現(xiàn)其心臟還在跳動(dòng)，故判斷此時(shí)羅非魚(yú)并沒(méi)有死亡；但是斑馬魚(yú)在9 h后鰓還能張合。以上的現(xiàn)象均說(shuō)明，在緩慢降溫的策略下斑馬魚(yú)比羅非魚(yú)更耐低溫。

2.2 低溫對(duì)羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)RPL11/MDM2/P53通路的影響

2.2.1 低溫對(duì)RPL11和P53蛋白表達(dá)水平的影響低溫下，兩種魚(yú)的RPL11和P53蛋白表達(dá)量見(jiàn)圖1。

圖1 各個(gè)溫度和時(shí)間點(diǎn)P53和β-ACTIN的Western blot結(jié)果Fig.1 Western blot of P53 and β-ACTIN at different temperature and time

從圖2可見(jiàn):羅非魚(yú)的P53和RPL11蛋白表達(dá)量隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，特別是在0 h和3 h均出現(xiàn)了非常明顯的表達(dá)量增加，6 h后RPL11表達(dá)量趨于穩(wěn)定，但是P53表達(dá)量持續(xù)累積,這可能是低溫壓力激活核糖體的壓力響應(yīng)程序，誘導(dǎo)RPL11蛋白表達(dá)量升高，RPL11與MDM2結(jié)合抑制其泛素化連接酶的活性，導(dǎo)致P53累積引起凋亡；斑馬魚(yú)P53表達(dá)量在0 h和3 h幾乎沒(méi)有變化，直至6 h才出現(xiàn)明顯的升高，這與羅非魚(yú)鰓組織出現(xiàn)凋亡信號(hào)早于斑馬魚(yú)的現(xiàn)象[3]是一致的，但是RPL11表達(dá)量在0 h后表現(xiàn)出顯著下降趨勢(shì)，這與羅非魚(yú)中0 h后RPL11表達(dá)量顯著升高的現(xiàn)象相反。

這表明，在羅非魚(yú)體內(nèi)核糖體生物發(fā)生進(jìn)程可能是對(duì)低溫壓力進(jìn)行響應(yīng)，通過(guò)抑制P53被泛素化達(dá)到快速積累P53的目的，大量積累的P53誘導(dǎo)鰓組織的凋亡。與羅非魚(yú)相比較，斑馬魚(yú)P53表達(dá)量升高的時(shí)間點(diǎn)明顯更晚，并且此過(guò)程中也沒(méi)有伴隨著RPL11的表達(dá)量升高。

*表示同一時(shí)間下兩個(gè)基因組間有顯著性差異(P<0.05);標(biāo)有不同字母者表示同一基因不同時(shí)間下有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同。Note: *means significant difference within two gene groups at same time (P<0.05)；The means with different letters within the same gene are significantly different in the different time at the 0.05 probability level, and the means with the same letter within the same gene are not significant differences, et sequentia.圖2 在羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)中各個(gè)溫度和時(shí)間點(diǎn)P53和RPL11蛋白水平的定量分析Fig.2 Quantitative analysis of P53 and RPL11 in tilapia and zebrafish at different temperature and time

2.2.2 低溫對(duì)羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)RPL11/MDM2/P53通路中mdm2 mRNA表達(dá)水平的影響 為了確定P53表達(dá)量升高是由于MDM2-P53這條信號(hào)通路所起的作用，對(duì)mdm2轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量進(jìn)行分析。從圖3可見(jiàn)：在羅非魚(yú)中，8 ℃、6 h 前mdm2表達(dá)量變化不大，并且處于低表達(dá)水平，此時(shí)有利于P53蛋白表達(dá)量的積累，6 h后mdm2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，這可能是由于RPL11的表達(dá)量趨于穩(wěn)定，并且P53大量積累誘導(dǎo)mdm2表達(dá)量升高導(dǎo)致的；在斑馬魚(yú)中，8 ℃、0 hmdm2表達(dá)量出現(xiàn)升高的變化，這不利于P53的積累，直到 8 ℃、6 h后mdm2表達(dá)量開(kāi)始下降，P53開(kāi)始大量積累。

2.3 低溫對(duì)羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)RPL11/MDM2/P53通路中P53下游靶基因表達(dá)量的影響

為了研究P53凋亡活性的分子機(jī)制，對(duì)羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的鰓組織中P53下游靶基因bad和p21在mRNA水平上的表達(dá)變化進(jìn)行分析。bad屬于Bcl2家族的基因[20]，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。從圖4可見(jiàn)，羅非魚(yú)在6 h后bad和p21兩個(gè)基因都表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，這暗示低溫下這兩個(gè)基因可能被激活的P53上調(diào)。

圖3 兩種魚(yú)在不同溫度和時(shí)間點(diǎn)的mdm2轉(zhuǎn)錄水平定量PCRFig.3 qPCR of mdm2 transcript levels relative to β-actin in the two fish species at different temperature and time

圖4 兩種魚(yú)在不同溫度和時(shí)間點(diǎn)的bad 和 p21轉(zhuǎn)錄水平定量PCRFig.4 qPCR of bad and p21 transcript levels in the two fish species at different temperature and time

3 討論

3.1 低溫下細(xì)胞內(nèi)P53積累導(dǎo)致其發(fā)生凋亡

魚(yú)鰓組織最先與外部環(huán)境溫度波動(dòng)有直接的接觸，因此，可能是魚(yú)類(lèi)低溫耐受的薄弱環(huán)節(jié)。有研究表明，對(duì)低溫下斑馬魚(yú)和羅非魚(yú)的各個(gè)組織進(jìn)行凋亡信號(hào)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)鰓組織在8 ℃、6 h時(shí)是最早出現(xiàn)凋亡的，而同一時(shí)間點(diǎn)下斑馬魚(yú)并未出現(xiàn)凋亡[3]。本試驗(yàn)中通過(guò)蛋白定量分析發(fā)現(xiàn)，在羅非魚(yú)鰓組織中試驗(yàn)3 h后P53蛋白表達(dá)量持續(xù)性顯著升高，但是斑馬魚(yú)鰓組織中在6 h時(shí)才開(kāi)始積累P53蛋白(圖2)。因此，羅非魚(yú)比斑馬魚(yú)更早出現(xiàn)凋亡信號(hào)的原因可能與P53的積累有關(guān)。

3.2 MDM2與RPL11相互作用誘導(dǎo)P53積累

有研究表明，核糖體蛋白(ribosomal proteins，RPs)，如 RPL5[21]、RPL11[22]和RPL23[23]能夠通過(guò)與MDM2結(jié)合阻止其對(duì)P53的降解和泛素化，從而實(shí)現(xiàn)P53的積累。還有研究表明，敲降RPS6能誘導(dǎo)RPL11激活P53[21]，敲降RPL29或RPL30能提高M(jìn)DM2與RPL11的相互作用，從而誘導(dǎo)P53[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，羅非魚(yú)試驗(yàn)中8 ℃、0 h時(shí)RPL11蛋白表達(dá)量開(kāi)始出現(xiàn)升高，而mdm2的轉(zhuǎn)錄水平維持在較低水平(圖3)，導(dǎo)致P53表達(dá)量到3 h出現(xiàn)顯著升高，P53表達(dá)量的不斷升高最終導(dǎo)致6 h時(shí)出現(xiàn)凋亡信號(hào)[3]。雖然在8 ℃、6 h后斑馬魚(yú)鰓中P53的表達(dá)量有一定的升高，但是在8 ℃、9 h前在斑馬魚(yú)鰓中并未檢測(cè)到凋亡信號(hào)[3]，這可能是由于其體內(nèi)P53的表達(dá)水平和羅非魚(yú)相比還是較低的，并且P53下游靶基因的表達(dá)也未升高。這表明，在斑馬魚(yú)體內(nèi)低溫誘導(dǎo)RPL11/MDM2/P53信號(hào)發(fā)生的時(shí)間比羅非魚(yú)晚或者是斑馬魚(yú)響應(yīng)低溫的途徑和羅非魚(yú)是不同的，這種差異化的表達(dá)模式對(duì)研究魚(yú)類(lèi)在響應(yīng)低溫脅迫時(shí)所產(chǎn)生差異的分子機(jī)制提供了研究思路。

通過(guò)比較分析這兩種魚(yú)RPL11/MDM2/P53通路中各組分的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，參與到該通路的基因和蛋白的表達(dá)量在兩種魚(yú)體內(nèi)表達(dá)模式有所差異。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果及Hu等[3]的研究，作者推測(cè)羅非魚(yú)中低溫誘導(dǎo)RPL11高表達(dá)，通過(guò)RPL11/MDM2的調(diào)控導(dǎo)致P53快速并且大量積累，激活P53下游凋亡相關(guān)基因表達(dá)，最終導(dǎo)致凋亡信號(hào)大量積累并造成鰓組織不可逆的損傷(圖5A)；但是在斑馬魚(yú)中低溫誘導(dǎo)下RPL11表達(dá)量反而降低，導(dǎo)致P53表達(dá)量緩慢升高，最終出現(xiàn)凋亡的時(shí)間較羅非魚(yú)晚(圖5B)，這可能是其較羅非魚(yú)更耐低溫的原因之一。因此，鰓組織凋亡信號(hào)的時(shí)間及強(qiáng)度可以作為低溫下組織受損程度的指示劑。并且低溫能誘導(dǎo)羅非魚(yú)中與凋亡相關(guān)的RPL11/MDM2/P53通路中相關(guān)蛋白的變化，并且這種表達(dá)變化模式和耐低溫能力較強(qiáng)的斑馬魚(yú)是不同的，這些不同物種差異性的基因表達(dá)模式可能是羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)低溫耐受能力差異的原因之一，但是其確切的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖5 低溫下RPL11/MDM2/P53信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡調(diào)控模式Fig.5 Pattern diagrams of RPL11/MDM2/P53 pathway involved in cell apoptosis under cold stress

4 結(jié)論

1) 與斑馬魚(yú)相比較，羅非魚(yú)積累P53的過(guò)程較快，并且此過(guò)程中伴隨著PRL11表達(dá)量的升高，而斑馬魚(yú)則相反。

2) 在羅非魚(yú)中，8 ℃、6 h前mdm2處于低表達(dá)水平，此時(shí)有利于P53蛋白表達(dá)量積累，6 h后mdm2表達(dá)量出現(xiàn)顯著升高，可能是P53大量積累導(dǎo)致的；在斑馬魚(yú)中，8 ℃、0 h時(shí)mdm2表達(dá)量出現(xiàn)升高的變化，這不利于P53積累，8 ℃、6 h后mdm2表達(dá)量開(kāi)始下降，P53開(kāi)始大量積累。

3) 本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，參與到該通路的基因和蛋白的表達(dá)量在兩種魚(yú)體內(nèi)表達(dá)模式有所差異，這可能是導(dǎo)致其耐寒能力差異的原因之一。