李偉業(yè),羅海忠,殷小龍,張川,柳敏海,章霞,邱豪軍,毛志增,油九菊,徐志進(jìn)*

(1.浙江省舟山市水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316000；2.舟山市海洋與漁業(yè)局，浙江 舟山 316000；3.浙江萬里學(xué)院，浙江 寧波 315100)

大黃魚Larimichthyscrocea為暖水性魚類，主要分布于黃海南部、東海，以及瓊州海峽以東的南海北部沿岸，是中國重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一。大黃魚的水溫適應(yīng)范圍為10～32 ℃，最適溫度為18～25 ℃，低于14 ℃和高于30 ℃攝食下降，低于7 ℃時(shí)大黃魚死亡[1]。近年來，由于生態(tài)環(huán)境的破壞，極端天氣頻繁發(fā)生，中國南方沿海地區(qū)也常受寒流侵襲，致使養(yǎng)殖海區(qū)水溫長(zhǎng)期偏低，對(duì)于不耐低溫的大黃魚造成了嚴(yán)重的損害。據(jù)報(bào)道，2016年南方漁業(yè)因寒潮造成經(jīng)濟(jì)損失超過20億元，僅大黃魚損失就超過3億元[2]。因此，開展低溫對(duì)大黃魚影響的研究，對(duì)開發(fā)抗寒大黃魚新品種、促進(jìn)大黃魚產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前，有關(guān)低溫對(duì)大黃魚影響的研究較多，但多集中于生長(zhǎng)特性、生理生化指標(biāo)等方面，而對(duì)大黃魚耐寒分子機(jī)制研究較少。金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是由微生物和動(dòng)植物產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白，是一類可被多種因素誘導(dǎo)的內(nèi)源性蛋白，在水生動(dòng)物體內(nèi)各生長(zhǎng)發(fā)育階段發(fā)揮著重要作用，具有較強(qiáng)的清除自由基能力[3]。水通道蛋白(Aquaporin，AQP)，又名水孔蛋白，是一種位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)(內(nèi)在膜蛋白)，不僅在水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起主要作用，還具有陽離子通道的作用，同時(shí)有助于CO2和NH3的交換運(yùn)輸[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白有200多種亞型, 其中對(duì)AQP1的研究最為廣泛和深入[5]。AQP1是由Agre等從紅細(xì)胞膜分離純化Rh血型多肽時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的，相對(duì)分子質(zhì)量為 28 000。它不僅可以調(diào)節(jié)滲透壓, 還與小分子氣體交換和運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān), 也與某些疾病有著重要的相關(guān)性[6]。熱休克蛋白(Heat shock protein，HSPs)，是一組在生物進(jìn)化過程中高度保守的蛋白分子，HSP60 家族是HSP家族中重要的成員之一，可以有效保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受逆境脅迫[7]。TCP1 (t-com-plex polypeptide-1)屬于HSP60家族Ⅱ類亞族，是一種廣泛存在于細(xì)胞漿中的異型寡聚蛋白，對(duì)提高細(xì)胞耐受應(yīng)激能力、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，MT、AQP1、TCP1 3個(gè)基因與魚類的抗寒性能相關(guān)[3-8]。為此，本研究中選取了上述基因，并比較分析了耐低溫品系與非耐低溫品系大黃魚中3個(gè)基因在低溫條件下的表達(dá)特點(diǎn)，以驗(yàn)證3個(gè)候選基因與大黃魚耐寒能力的相關(guān)性，旨在從分子層面闡釋大黃魚在低溫脅迫下基因調(diào)控的相關(guān)機(jī)理，以期為今后研究大黃魚的耐寒分子機(jī)制和抗寒育種提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚取自浙江省舟山市水產(chǎn)研究所繁育的F5代耐低溫品系大黃魚和非耐低溫品系大黃魚幼魚，耐低溫品系大黃魚體質(zhì)量為(55.35±3.52)g，體長(zhǎng)為(14.72±0.25)cm，非耐低溫大黃魚體質(zhì)量為(56.45±4.41)g，體長(zhǎng)為(14.91±0.32)cm。將試驗(yàn)魚置于圓形玻璃鋼桶(直徑為200 cm、高為100 cm)內(nèi)，納米氣管增氧，于每天9:00、16:00各投喂一次配合飼料(天邦大黃魚配合飼料3號(hào)料)，并于投喂后1 h吸污，日換水率100%。試驗(yàn)用水為過濾后的自然海水。

1.2 方法

1.2.1 低溫脅迫對(duì)比試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)2個(gè)組，分別為耐低溫品系大黃魚組(N組)和非耐低溫品系大黃魚組(F組)，每個(gè)組設(shè)2個(gè)平行。每個(gè)試驗(yàn)桶各放入50尾大黃魚幼魚。試驗(yàn)桶水溫為16 ℃(自然溫度)。試驗(yàn)前，將試驗(yàn)魚移至試驗(yàn)桶中，暫養(yǎng)7 d，待試驗(yàn)魚的狀態(tài)穩(wěn)定后開始正式試驗(yàn)。試驗(yàn)起始溫度為16 ℃，按照1 ℃/d的速率降溫，分別在16、13、10、7 ℃時(shí)取樣，并觀察試驗(yàn)魚的行為狀態(tài)。在各溫度下隨機(jī)抽取3尾魚，取其肝臟、肌肉，并于液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光定量PCR 采用天根生化科技(北京)有限公司試劑盒提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA 的完整性，用RNA作為模板，以O(shè)ligo dT18作為引物合成第一鏈cDNA。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中MT、AQP1、TCP1基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物(表1)，用于熒光定量分析(qPCR)，選取β-actin作為內(nèi)參基因[9]。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7300plus熒光定量擴(kuò)增儀上進(jìn)行，熒光定量檢測(cè)采用SYBR定量檢測(cè)試劑盒(TaKaRa)。反應(yīng)體系(共20 μL)包括：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上、下游引物各0.8 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL, ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下預(yù)變性30 s; 95 ℃下變性 5 s，60 ℃ 下退火31 s, 共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min。溶解反應(yīng)：95 ℃ 下反應(yīng)15 s，60 ℃ 下反應(yīng)60 s (數(shù)據(jù)采集)，95 ℃ 下反應(yīng)15 s。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 大黃魚基因定量分析所用引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下耐低溫和非耐低溫品系大黃魚的行為狀態(tài)

從表2可見：N組大黃魚和F組大黃魚在16、13、10 ℃下，行為狀態(tài)較為相似；在7 ℃下，N組大黃魚和F組大黃魚的行為狀態(tài)出現(xiàn)差異，N組大黃魚盡管活力一般，也不攝食，但未出現(xiàn)翻肚側(cè)游的現(xiàn)象，在水體各層分布較均勻，而F組大黃魚活力不佳，部分出現(xiàn)翻肚側(cè)游的現(xiàn)象，且多分布于水體的中上層。

表2 不同溫度下耐低溫和非耐低溫品系大黃魚的行為狀態(tài)

2.2 不同溫度下耐低溫和非耐低溫品系大黃魚肝臟和肌肉中MT基因表達(dá)量的變化

從圖1可見：隨著溫度的降低，N、F組大黃魚肝臟和肌肉中MT基因表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)，且各試驗(yàn)組均有顯著性差異(16 ℃時(shí)除外)(P<0.05)；在7 ℃時(shí)，大黃魚肝臟和肌肉中MT基因表達(dá)量均達(dá)到最高，N組、F組大黃魚肝臟中的表達(dá)量分別為16 ℃時(shí)的10.8倍和22.3倍，N組、F組大黃魚肌肉中的表達(dá)量分別為16 ℃時(shí)的9.8倍和18.3倍，且F組大黃魚表達(dá)量也顯著高于N組(P<0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.圖1 不同溫度下耐低溫和非耐低溫品系大黃魚肝臟和肌肉中MT基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.1 Relative expression levels of MT gene in liver and muscle of large yellow croaker Larimichthys crocea exposed to different temperature

2.3 不同溫度下耐低溫和非耐低溫品系大黃魚肝臟和肌肉中AQP1基因表達(dá)量的變化

從圖2(a)可見：N、F組大黃魚肝臟中AQP1表達(dá)量均隨溫度的降低呈先升高后降低的趨勢(shì)，且各試驗(yàn)組間均有顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)組表達(dá)量均顯著高于N組(P<0.05)；在13 ℃時(shí)N組、F組大黃魚的表達(dá)量均達(dá)到最高，上調(diào)幅度分別為16 ℃時(shí)的1.73倍和1.82倍；當(dāng)溫度降到10 ℃時(shí)，各試驗(yàn)組大黃魚肝臟中的AQP1表達(dá)量顯著下降；在7 ℃時(shí)N組、F組大黃魚表達(dá)量達(dá)到最低，分別為16 ℃時(shí)的0.23%和0.39%。

圖2 不同溫度下耐低溫和非耐低溫品系大黃魚肝臟和肌肉中AQP1基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.2 Relative expression levels of AQP1 gene in liver and muscle of large yellow croaker Larimichthys crocea exposed to different temperature

從圖2(b)可見：N、F組大黃魚肌肉中AQP1表達(dá)量也均隨著溫度的降低呈先升高后降低的趨勢(shì)；在13 ℃時(shí)N組、F組大黃魚的表達(dá)量均達(dá)到最高，上調(diào)幅度分別為16 ℃時(shí)的1.49倍和1.64倍，且F組表達(dá)量顯著高于N組(P<0.05)；當(dāng)溫度降到10 ℃時(shí)，各試驗(yàn)組大黃魚肌肉中的AQP1表達(dá)量顯著下降；在7 ℃時(shí)N組、F組大黃魚表達(dá)量達(dá)到最低，分別為16 ℃時(shí)的0.14%和0.26%，但N組和F組表達(dá)量間無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 不同溫度下耐低溫和非耐低溫品系大黃魚肝臟和肌肉中TCP1基因表達(dá)量的變化

從圖3可見：隨著溫度的降低，N、F組大黃魚肝臟和肌肉中TCP1基因表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)，且各試驗(yàn)組間有顯著性差異(16 ℃時(shí)除外)(P<0.05)；在7 ℃時(shí)，肝臟和肌肉中表達(dá)量均達(dá)到最高，N組、F組大黃魚肝臟中TCP1基因表達(dá)量分別為16 ℃時(shí)的28.3倍和19.3倍，N組、F組大黃魚肌肉中TCP1基因表達(dá)量分別為16 ℃時(shí)的9.3倍和6.3倍，且N組表達(dá)量顯著高于F組(P<0.05)。

圖3 不同溫度下耐低溫和非耐低溫品系大黃魚肝臟和肌肉中TCP1基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.3 Relative expression levels of TCP1 gene in liver and muscle of large yellow croaker Larimichthys crocea exposed to different temperature

3 討論

3.1 低溫脅迫對(duì)耐低溫和非耐低溫品系大黃魚MT基因表達(dá)的影響

MT為一類可被多種因素誘導(dǎo)的內(nèi)源性蛋白，在水生動(dòng)物體內(nèi)各生長(zhǎng)發(fā)育階段均發(fā)揮著重要作用，具有較強(qiáng)的清除自由基能力，其清除羥基自由基的能力是SOD的1萬倍，清除氧自由基的能力是GSH的25倍。眾多研究表明，MT的合成與溫度有明顯的溫度效應(yīng)關(guān)系。Oh等[10]研究發(fā)現(xiàn)，冷、熱應(yīng)激和耐力鍛煉等均可引起大鼠肝臟MT含量升高；Baer等[11]也發(fā)現(xiàn)，MT含量與小鼠對(duì)寒冷的耐受性呈正相關(guān)(r=0.78)。另有研究認(rèn)為，MT可能在冷應(yīng)激中起到穩(wěn)定細(xì)胞膜、保護(hù)細(xì)胞器的重要作用[12-14]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著溫度降低，大黃魚肝臟和肌肉中MT基因表達(dá)量均呈顯著上升，且非耐低溫品系大黃魚的表達(dá)量顯著高于耐低溫品系，這表明低溫脅迫會(huì)促進(jìn)MT基因的表達(dá)，這與Sardella等[15]的研究結(jié)果相似。此外，這或許從側(cè)面反映了耐低溫品系大黃魚比非耐低溫品系大黃魚具有更強(qiáng)的低溫適應(yīng)能力。

3.2 低溫脅迫對(duì)耐低溫和非耐低溫品系大黃魚AQP1基因表達(dá)的影響

AQP基因不僅在水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起到主要作用，還具有陽離子通道的作用，同時(shí)有助于CO2和NH3的交換運(yùn)輸，它屬于水選擇性跨膜通道[16]。研究表明，AQP1基因與動(dòng)物機(jī)體的抗寒能力關(guān)系密切，在樹蛙Hylachrysoscelis和面包酵母Saccharomycescerevisiae研究中均發(fā)現(xiàn)，AQP1 基因與這些物種的抗寒性能相關(guān)[17-18]。此外，朱華平等[19]研究表明，AQP1基因表達(dá)量與溫度顯著相關(guān)，且隨著溫度的降低，AQP1基因的表達(dá)量逐漸下調(diào)。本研究中發(fā)現(xiàn)，AQP1基因表達(dá)量與溫度也具有顯著的相關(guān)性，溫度降至10 ℃后，耐低溫品系和非低溫品系大黃魚肝臟和肌肉的AQP1基因表達(dá)均顯著下調(diào)，在7 ℃時(shí)表達(dá)量最低，且耐低溫品系大黃魚肝臟和肌肉的AQP1表達(dá)量均低于非耐低溫品系。結(jié)合耐低溫品系和非耐低溫品系大黃魚在7 ℃下的行為狀態(tài)(耐低溫品系大黃魚緩慢游動(dòng)，非耐寒品系大黃魚部分側(cè)游)，筆者認(rèn)為，耐低溫品系大黃魚具有更強(qiáng)的耐低溫能力，這也可能與其AQP1表達(dá)量下調(diào)幅度更大有關(guān)，這也與朱華平等[16]的研究結(jié)果相似。其機(jī)制可能是大黃魚機(jī)體為適應(yīng)低溫條件，AQP1 基因表達(dá)量大幅下調(diào)，降低細(xì)胞膜上AQP1 的含量或活性，減少水分子的跨膜運(yùn)輸，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境保持相對(duì)穩(wěn)定，降低外界低溫對(duì)細(xì)胞的損害。

3.3 低溫脅迫對(duì)耐低溫和非耐低溫品系大黃魚TCP1基因表達(dá)的影響

TCP1伴侶蛋白是一大類在生物大分子折疊、組裝及降解過程中起重要協(xié)同作用且與細(xì)胞應(yīng)激損傷關(guān)系密切的蛋白。對(duì)提高細(xì)胞耐受應(yīng)激的能力、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用[8,20]。眾多研究表明，TCP1與生物體抗寒能力相關(guān)，如酵母SaccharomycescerevisiaeTCP-1-alpha 和TCP-1-beta 的低溫誘導(dǎo)表達(dá)模式顯示，TCP-1是一種冷激表達(dá)蛋白[21]，肉蠅Sarcophagacrassipalpis滯育期的低溫存活能力與熱休克蛋白如TCP-1、HSP70家族等的上調(diào)表達(dá)關(guān)系密切[22]；蔥蠅Deliaantique幼蟲耐寒能力增強(qiáng)也與其TCP-1的上調(diào)表達(dá)密切相關(guān)[23]。在水生生物中也有研究表明，TCP基因與抗寒密切相關(guān)，如殷勤等[24]在低溫脅迫試驗(yàn)中證實(shí)，TCP基因與凡納濱對(duì)蝦耐寒性狀存在相關(guān)性，不同基因型的個(gè)體在耐寒能力上具有差異；謝建麗等[25]對(duì)尼羅羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著低溫脅迫程度的加強(qiáng)，TCP基因表達(dá)上調(diào)幅度增大，這表明TCP-1-beta和TCP-1-eta是潛在的耐寒相關(guān)基因。本研究中發(fā)現(xiàn)，TCP1基因表達(dá)量與溫度也具有顯著的相關(guān)性，隨著溫度的降低，各試驗(yàn)組大黃魚肝臟和肌肉中的TCP1基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，在溫度降至7 ℃后，TCP1基因表達(dá)量上調(diào)幅度最大。此外，耐低溫品系大黃魚肝臟和肌肉中的TCP1表達(dá)量均顯著高于非耐低溫品系。本研究結(jié)果與謝建麗等[25]的研究結(jié)果相似，這表明TCP1與大黃魚的抗寒能力密切相關(guān)，同時(shí)，耐低溫品系大黃魚的TCP1表達(dá)量顯著高于非耐低溫品系，這也從側(cè)面反映了耐低溫品系大黃魚比非耐低溫品系具有更強(qiáng)的抗寒能力。

4 結(jié)論

1)2個(gè)品系的大黃魚MT、AQP1、TCP1 3個(gè)基因在低溫下表現(xiàn)出顯著差異性，表明這3個(gè)基因與大黃魚抗寒能力具有一定的相關(guān)性。

2)耐低溫品系大黃魚在低溫下存活率和活力要優(yōu)于非耐低溫品系，結(jié)合MT、AQP1、TCP1 3個(gè)與抗寒相關(guān)的基因的表達(dá)差異，證明兩者在低溫適應(yīng)能力和抗寒能力上存在一定區(qū)別。

3)在大黃魚耐低溫品系的篩選過程中，尋找出抗寒相關(guān)因子及其基因，獲得抗寒相關(guān)基因的分子標(biāo)記，是低溫選育耐低溫品系的重要手段。而找到與性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種的前提和基礎(chǔ)，因此，今后應(yīng)重點(diǎn)進(jìn)行抗寒基因編碼序列SNP位點(diǎn)的篩查。