徐丹丹，石力允，張 羽，林澤勉，姜子德，喬 方

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院/深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，廣東 深圳 518055；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

【研究意義】小?？Х龋–offea arabica）又稱阿拉比卡咖啡，占世界咖啡總產(chǎn)量的70%，廣泛分布于世界各大咖啡產(chǎn)區(qū)。作為世界三大飲料（咖啡、可可、茶）之首，咖啡在中國的引進(jìn)試種已有100 多年的歷史，主要集中種植于我國的云南、海南、廣東和臺(tái)灣地區(qū)［1］。廣東省最早種植的是雷州半島，因咖啡經(jīng)濟(jì)效益顯著，種植面積逐年擴(kuò)大，現(xiàn)在粵東和粵西均有種植；但是咖啡種植中病蟲害的侵襲已成為阻礙咖啡產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大瓶頸。

【前人研究進(jìn)展】咖啡炭疽病是影響小粒咖啡質(zhì)量和產(chǎn)量的重要病害之一，主要為害咖啡葉片、枝條、果實(shí)。高溫條件下，葉片邊緣出現(xiàn)黑色圓形病斑，病斑中央呈灰白色，病斑外緣有黃色暈圈，葉背有同心輪紋，上有黑色小點(diǎn)；新鮮漿果感病時(shí)在果實(shí)向陽面出現(xiàn)深褐色灼傷凹陷斑，斑痕擴(kuò)展形成不規(guī)則凹陷灼傷區(qū)，最后果皮干褐掛于枝上；旱季小樹和弱樹易感病，出現(xiàn)大量落葉，并伴隨有枯枝癥狀［2］。多種炭疽菌可以引起咖啡炭疽病，Cao等報(bào)道了海南地區(qū)咖啡炭疽病的8種炭疽菌，分別為膠孢炭疽菌復(fù)合種（Colletotrichum gloeosporioidescomplexes）中的C.endophytica、C.fructicola、C.ledongense、C.siamense和C.tropicale，博寧炭疽菌復(fù)合種（C.boninensecomplexes）中的C.karstii和長直孢炭疽菌復(fù)合種（C.gigasporumscomplexes）的C.gigasporum［3］；Cristóbal-Martínez等通過分離墨西哥咖啡發(fā)病的葉片、枝條和漿果上的病原菌，鑒定了5種炭疽菌：C.gigasporum、C.gloeosporioides、C.karstii、C.siamense和C.theobromicola［4］；C.boninense、C.coffeanu、C.gloeosporioides能引起巴西咖啡的葉片和果實(shí)炭疽?。?］。

【本研究切入點(diǎn)】長期以來，化學(xué)防治仍然是防治炭疽病的主要措施，而關(guān)于炭疽病菌對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的報(bào)道屢見不鮮。鞏佳莉等［6］報(bào)道咖啡炭疽病菌對(duì)代森錳鋅和百菌清表現(xiàn)為高水平抗性；Chechi 等［7］報(bào)道引起蘋果炭疽病的暹羅炭疽菌C.siamense對(duì)嘧菌酯和甲基硫菌靈表現(xiàn)為抗性；Piccirillo 等［8］發(fā)現(xiàn)引起香橙炭疽病的C.gloeosporioides菌株對(duì)嘧菌酯存在不同程度的抗性。廣東地區(qū)的咖啡栽培種植處于增長階段，且尚未有該地區(qū)咖啡炭疽病的相關(guān)研究報(bào)道，因此，針對(duì)該地區(qū)炭疽病原的研究至關(guān)重要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)對(duì)采自廣東汕尾咖啡基地的炭疽病樣本進(jìn)行病原菌的分離鑒定及防治藥劑的室內(nèi)篩選測定，以期為當(dāng)?shù)乜Х忍烤也〉挠行Х揽靥峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019 年10 月20 日從廣東海豐縣湖畔咖啡種植基地（23°3′29″N，115°26′22″E）采集發(fā)病的咖啡樣品。選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）用于咖啡炭疽病菌的分離、純化和培養(yǎng)。

1.2 病原菌的分離與純化

挑選典型發(fā)病的病葉，在病健交界處切取5 mm×5 mm 的葉片組織塊，于75%乙醇（V/V）中浸潤10 s，隨后用2%的NaClO 表面消毒2～3 min，然后用無菌蒸餾水沖洗3 次，于無菌濾紙上晾干水分［9］。用無菌鑷子將組織塊轉(zhuǎn)移至PDA 平板上，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。待菌落產(chǎn)生橘紅色粘孢團(tuán)后，配制孢子懸浮液涂布于無菌的瓊脂培養(yǎng)基上，于顯微鏡下挑取含有單一分生孢子的瓊脂培養(yǎng)基于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得單孢菌株，然后將純化獲得的菌株移至PDA 斜面試管中保存。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將單孢純化后菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，觀察菌落性狀，并定期測量各菌株在25 ℃下不同時(shí)間段的菌落直徑，計(jì)算各菌株的生長速率；用Olympus BX41 顯微鏡觀察菌絲和分生孢子，隨機(jī)選取60 個(gè)分生孢子，測量分生孢子大小。

1.4 致病性測定

將菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d后，挑取各菌株的橘紅色粘孢團(tuán)于無菌水中配制成濃度為105個(gè)/mL 的孢子懸浮液。選取幼嫩的咖啡葉片，用無菌接種針刺傷后接種10 μL 的孢子懸浮液，以接種無菌水作為對(duì)照，每個(gè)菌株接種15 片咖啡葉片，3 次重復(fù)。將所有處理的葉片置于保鮮盒中噴霧保濕，定期觀察統(tǒng)計(jì)葉片的發(fā)病情況，并從病組織中再次分離病原菌，與原接種菌株進(jìn)行比較。

1.5 多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒（Omega生物工程有限公司）提取菌絲DNA，用真菌通用引物ITS1/ITS4、特異引物Bt2a/Bt2b、GDF/GDR、CHS-79F/CHS-345R、ACT-512F/ACT-783R和GSF1/GSR1共6對(duì)引物分別對(duì)菌株的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）［10］、β-微管蛋白基因（β-Tubulin，TUB2）［11］、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）［12］、幾丁質(zhì)合成酶基因（chitin synthase,CHS）［13］、肌動(dòng)蛋白基因（Actin，ACT）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）［14］進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各序列擴(kuò)增引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包含DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol/L），2×MasterMix 12.5 μL，以ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，（ITS和TUB2：55 ℃；GAPDH：56 ℃；CHS和ACT：58 ℃；GS：54℃）退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

取5 μL 上述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后將PCR 產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司測序。將測得的基因序列與GenBank 中的序列進(jìn)行比對(duì)，下載相似性高的序列及其對(duì)應(yīng)復(fù)合種的常見模式菌株序列，使用MEGA 軟件剪切后按照ITS-TUB2-GAPDH-CHS-ACT-GS 的順序首尾拼接，分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以自展法（Bootstrap）進(jìn)行檢測，共循環(huán)1000 次。

表1 病原菌鑒定所用引物的具體信息Table 1 Detailed information of primers used for pathogen identification

1.6 殺菌劑抑菌活性測定

供試藥劑原藥苯醚甲環(huán)唑（96.3%）、咪鮮胺（97%）、吡唑醚菌酯（98%）和甲基硫菌靈（97%）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物細(xì)菌和殺菌研究室提供。將4 種殺菌劑溶解于甲醇中配制得到原液，然后以倍比法加水稀釋得到工作液，將各藥劑工作液與PDA 混合制成含有殺菌劑的PDA 平板［15］。用孔徑為5 mm 的打孔器取菌絲塊接種至PDA 含藥平板上，以加入等體積的甲醇作為對(duì)照，每個(gè)藥劑濃度處理4次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑，計(jì)算各殺菌劑菌絲生長抑制率和EC50值，繪制毒力回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

炭疽病在咖啡各生長期均可發(fā)生，本研究主要采集發(fā)病的咖啡葉片。葉片感病多在葉尖和葉緣產(chǎn)生褐色病斑，隨病斑的不斷擴(kuò)大，后期病斑中心呈灰褐色且具同心輪紋排列的黑色小點(diǎn)，邊緣為暗褐色，其外緣有黃色暈圈；發(fā)病嚴(yán)重的則數(shù)個(gè)病斑交匯成大病斑，葉片干枯、脫落（圖1）。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

圖1 田間咖啡葉片發(fā)病癥狀Fig.1 Diseased symptoms of Coffea arabica leaves in field

圖2 代表菌株的菌落和分生孢子形態(tài)Fig.2 Colony and conidia morphology characteristics of representative strains

將分離得到的菌株單孢純化后共計(jì)得到37株菌株，根據(jù)形態(tài)特征的相似性初篩得到9株炭疽病菌株，分別為CA-1、CA-2、CA-3、CA-6、CA-11、CA-12、CA-13、CA-16和CA-22，其菌落性狀分為3種不同類型。一種菌落正面產(chǎn)生灰白色的氣生菌絲，菌絲平均生長速率為13.98 mm/d，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后可見橙色孢子堆產(chǎn)生（圖2A）；分生孢子無色透明，一端鈍圓，另一端鈍圓或略細(xì)，一般具1～2個(gè)油球（圖2B）；將CA-6選為代表菌株，其大小為14.46～17.88 μm×4.78～6.19 μm（av=16.2 μm×5.6 μm，n=60）。第二種菌落正面產(chǎn)生白色的氣生菌絲，菌絲平均生長速率為15.12 mm/d（圖2C）；分生孢子無色透明，一端鈍圓，另一端鈍圓或尖細(xì)，具2個(gè)油球（圖2D）；將CA-16選為代表菌株，其大小為14.06～17.33 μm×4.59～5.91 μm（av=15.9 μm×5.1 μm，n=60）。第三種菌落正面產(chǎn)生灰色的氣生菌絲，菌絲致密，菌絲平均生長速率為14.23 mm/d（圖2E）；分生孢子無色透明，兩端鈍圓，具2個(gè)油球（圖2F）；將CA-3選為代表菌株，其大小為12.46～15.35 μm×5.13～7.25 μm（av=13.8 μm×6.1 μm，n=60）。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，結(jié)合Weir等［16］和Damm等［17］的描述，菌株CA-6和CA-16與膠孢炭疽菌復(fù)合種（C.gloeosporioidescomplexes）相似，菌株CA-3與盤長孢狀炭疽菌復(fù)合種（C.orchidearumcomplexes）相似。

2.3 致病性測定結(jié)果

將各菌株的分生孢子懸浮液回接至健康的咖啡葉片7 d 后，各葉片穿刺處理點(diǎn)均呈現(xiàn)病斑直徑不一的發(fā)病癥狀（圖3）。對(duì)照葉片不發(fā)病，僅在穿刺處理點(diǎn)有一褐色的氧化斑點(diǎn)，而9 株炭疽菌接種處理的咖啡葉片均呈現(xiàn)褐色壞死性病斑；其中5 株炭疽菌（CA-6、CA-12、CA-13、CA-16和CA-22）的致病力強(qiáng)，病斑直徑為19.2～25.5 mm；3株炭疽菌（CA-1、CA-2和CA-11）的致病力次之，病斑直徑為6.8～9.5 mm；炭疽菌CA-3的致病力較弱，病斑直徑為4.9～5.1 mm。

圖3 回接發(fā)病的咖啡葉片F(xiàn)ig.3 Diseased Coffea arabica leaves after inoculation

2.4 菌株多基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）可以看出：5株菌（CA-1、CA-6、CA-11、CA-12和CA-13）與果生炭疽菌C.fructicola聚在一起，形成一個(gè)明顯的分支；3株菌（CA-2、CA-16和CA-22）與暹羅炭疽菌C.siamense聚在一起，形成一個(gè)明顯的分支；CA-3單獨(dú)與芭蕉生炭疽菌C.musicola聚在一起；各分支間均有較高的支持率，因此確定測試的9株炭疽病菌分別為果生炭疽菌C.fructicola、暹羅炭疽菌C.siamense和芭蕉生炭疽菌C.musicola。

圖4 基于ITS、TUB2、GAPDH、CHS、ACT 和GS 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS,TUB2,GAPDH,CHS,ACT and GS genes

2.5 不同殺菌劑對(duì)病原菌的毒力測定結(jié)果

2.5.1 不同殺菌劑對(duì)炭疽病菌菌絲生長的抑制效果 綜合病原菌鑒定結(jié)果和致病力測定結(jié)果，分別選取致病性強(qiáng)的2 株炭疽病菌C.fructicolaCA-13 和C.siamenseCA-16 進(jìn)行殺菌劑毒力測定試驗(yàn)。利用生產(chǎn)上常用的4 種殺菌劑進(jìn)行菌絲生長的抑制試驗(yàn)，結(jié)果（表2）表明：4 種殺菌劑對(duì)2株待測炭疽病菌的菌絲生長抑制效果差異顯著。咪鮮胺、吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈3 種殺菌劑抑菌效果顯著，當(dāng)其濃度為0.125 mg/L 時(shí)對(duì)兩株炭疽病菌的菌絲生長抑制率超過50%，是防治咖啡炭疽病的理想藥劑。苯醚甲環(huán)唑?qū)芍晏烤也【囊种谱饔么沃?，?dāng)其濃度為0.25 mg/L 時(shí)對(duì)菌株CA-13 和CA-16 的菌絲生長抑制率分別為58.6%和51.2%。

2.5.2 不同殺菌劑對(duì)病原菌的毒力 由表3 可知，4 種殺菌劑均對(duì)兩株強(qiáng)致病性咖啡炭疽病菌具有顯著的抑制活性，從藥劑的EC50值分析可知，咪鮮胺、吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈的抑制作用極強(qiáng)，其對(duì)兩株炭疽病菌菌株的EC50均小于0.1 mg/L，以咪鮮胺的毒力最強(qiáng)，對(duì)CA-13 和CA-16 的EC50分別為0.067、0.039 mg/L；苯醚甲環(huán)唑效果次之，其對(duì)CA-13 和CA-16 的EC50均大于0.1 mg/L。

3 討論

本研究采用組織分離法得到病原菌株，單孢純化后根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合ITS、TUB2、GAPDH、CHS、ACT 和GS 進(jìn)行多基因系統(tǒng)學(xué)分析，證明分離得到的菌株分別為果生炭疽菌C.fructicola、暹羅炭疽菌C.siamense和芭蕉生炭疽菌C.musicola。通過柯赫氏法則驗(yàn)證所有分離得到的菌株均可侵染葉片，引發(fā)葉片炭疽癥狀，故本研究結(jié)果應(yīng)是準(zhǔn)確可靠的，這是關(guān)于果生炭疽菌C.fructicola、暹羅炭疽菌C.siamense和芭蕉生炭疽菌C.musicola3 種炭疽病菌復(fù)合侵染引起廣東地區(qū)引起咖啡葉片炭疽病的首次報(bào)道，該病原的確定為廣東咖啡葉片炭疽病的診斷和防治提供了理論依據(jù)。該研究對(duì)炭疽病原菌的鑒定與Cao 等對(duì)海南地區(qū)咖啡炭疽病病原菌研究結(jié)果基本一致［3］。另外，本研究亦首次從咖啡葉片中分離到芭蕉生炭疽菌C.musicola，但是該菌株致病力較弱，故不作為病原菌進(jìn)行藥效試驗(yàn)測定。但是，芭蕉生炭疽菌C.musicola能引起芋頭小果野蕉Musa acuminata［17］、Colocasia esculenta［18］和棉豆Phaseolus lunatus［19］的炭疽病，亦應(yīng)引起重視。

果生炭疽菌C.fructicola和暹羅炭疽菌C.siamense同屬于膠孢炭疽菌復(fù)合種C.gloeosporioidescomplex，是重要的炭疽病菌種群［16］。關(guān)于炭疽病的化學(xué)防治，苯丙咪唑類殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈通過抑制病原菌細(xì)胞β-微管蛋白合成而阻礙正常的有絲分裂達(dá)到抑菌的效果［20］，腈菌唑和三唑酮為真菌甾醇生物合成抑制劑，導(dǎo)致真菌細(xì)胞裂解死亡［21］，上述4 種殺菌劑為常用的廣譜型藥劑。本研究結(jié)果證明咪鮮胺、吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈對(duì)兩種炭疽病菌的抑菌效果最佳，其EC50均小于0.1 mg/L，

該結(jié)果與鞏佳莉的研究結(jié)果基本一致［6］。苯醚甲環(huán)唑?qū)μ烤也【鶦A-13 和CA-16 的EC50均大于0.1 mg/L，表明炭疽病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑有一定的抗性，該結(jié)果與宋丹丹等用三唑酮處理?xiàng)顦涮烤也【贸龅慕Y(jié)論一致［22］。由于試驗(yàn)所選4 種殺菌劑均為炭疽病防治的常規(guī)殺菌劑，長期使用導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生，且試驗(yàn)多選咖啡基地旁有大量的荔枝園，本研究鑒定得到的暹羅炭疽菌C.siamense亦是荔枝炭疽病的重要病原菌［23］，所以在防治咖啡炭疽病的同時(shí)亦應(yīng)對(duì)荔枝炭疽病進(jìn)行預(yù)防，降低病原菌的侵染源。

表2 殺菌劑對(duì)咖啡炭疽病菌菌絲生長的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of fungicides on mycelial growth of Colletotrichum isolated from Coffea arabica

表3 殺菌劑對(duì)咖啡炭疽病菌的室內(nèi)毒力分析Table 3 In vitro toxicity analysis of fungicides to Colletotrichum isolated from Coffea arabica

4 結(jié)論

結(jié)合致病性接種、形態(tài)特征觀察和多基因（ITS、TUB2、GAPDH、CHS、ACT 和GS）系統(tǒng)學(xué)分析，鑒定廣東咖啡葉片炭疽病的優(yōu)勢(shì)病原菌為果生炭疽菌C.fructicola和暹羅炭疽菌C.siamense；咪鮮胺、吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈對(duì)果生炭疽菌C.fructicola和暹羅炭疽菌C.siamense的抑制作用極強(qiáng)，對(duì)兩株炭疽病菌菌株的EC50均小于0.1 mg/L，為田間防治咖啡炭疽病時(shí)選擇更多輪換藥劑提供了參考。