亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        高粱組Ⅲ WRKY 轉(zhuǎn)錄因子對干旱脅迫的表達(dá)分析

        2021-03-12 09:15:22
        廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年2期
        關(guān)鍵詞:高粱結(jié)構(gòu)域基因組

        (中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站/廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,廣東 湛江 524013)

        【研究意義】高粱(Sorghum bicolor)是禾本科高粱屬1 年生草本植物,不僅是世界上重要的糧食和能源作物,也是優(yōu)質(zhì)的飼料作物。高粱具有耐旱、耐澇、耐鹽堿等多種特性[1],其基因組較?。s750 Mb),具有豐富的遺傳多樣性,其優(yōu)良的基因資源在作物改良中具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子,對轉(zhuǎn)錄過程起誘導(dǎo)或抑制作用[3]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子作為植物中一類重要轉(zhuǎn)錄因子,廣泛參與植物生長發(fā)育、響應(yīng)激素誘導(dǎo)和生物及非生物脅迫等生物學(xué)進(jìn)程[4],開展高粱WRKY基因耐旱性表達(dá)特征分析具有重要意義,可為高粱WRKY基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】WRKY基因家族作為高等植物中備受關(guān)注的基因家族之一,自第一個WRKY 轉(zhuǎn)錄因子基因從甘薯中克隆以來[5],隨著許多物種基因組測序工作完成,越來越多的WRKY基因從基因組水平上鑒定出來,已在青稞[6]、中??Х龋?]、大麥[8]和楊樹[9]基因組分別鑒定了41、49、98、122 個WRKY基因。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子包含1~2 個保守WRKY 結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域由約60 個氨基酸序列組成,其保守的7 個核心氨基酸序列為“WRKYGQK”。根據(jù)WRKY保守結(jié)構(gòu)域數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)類型,可將WRKY 轉(zhuǎn)錄因子分為組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ三大類,其中組Ⅱ又分為5 個亞類(Ⅱa~Ⅱe)。組ⅠWRKY 轉(zhuǎn)錄因子包含2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域,其鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸類型為C2H2,組Ⅱ和組Ⅲ轉(zhuǎn)錄因子只含有1 個WRKY 結(jié)構(gòu)域,鋅指類型分別為C2H2、C2HC 型[10]。據(jù)報道,WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與了植物生長發(fā)育的許多進(jìn)程,如開花[11]、次級代謝物合成[12]和衰老[13]等。也有較多研究表明,WRKY 轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)各種壓力脅迫,如玉米ZmWRKY62-like基因響應(yīng)鹽和干旱脅迫[14];小麥TaWRKY33受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá),TaWRKY33轉(zhuǎn)基因擬南芥比對照具有更好的耐鹽性[15];甜高粱SSWRKY28、SSWRKY76基因的表達(dá)結(jié)果表明,它們可能在應(yīng)答干旱脅迫時發(fā)揮一定作用[16];高粱SbWRKY30基因通過影響擬南芥和水稻的根系結(jié)構(gòu)來提高對干旱脅迫的耐受性,擬南芥和水稻的轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫后脯氨酸含量、SOD、POD 和CAT 酶活性高于野生型植株,而MDA 含量低于野生型植株[17]。【本研究切入點(diǎn)】前人研究結(jié)果表明,組ⅢWRKY 成員廣泛參與植物生長發(fā)育進(jìn)程、生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)[18]。趙興奎等[19]已從高粱基因組鑒定了16個組ⅢWRKY成員,但沒有研究其響應(yīng)逆境脅迫的表達(dá)譜。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以高粱品種BTx623 為試材,采用PEG6000 溶液模擬干旱脅迫[20-21],研究高粱組ⅢWRKY成員響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)譜,為挖掘耐旱候選基因提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        供試高粱品種為BTx623,由廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心保存,該材料有參考基因組序列,為中等耐旱性材料[22]。高粱組ⅢWRKY基因信息來自參考文獻(xiàn)[19],基因序列下載 自Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。

        主要試劑:TransZol Plant 植物總RNA 純化試劑盒、Trans2K? Plus DNA Marker、TransStart?Top Green qPCR SuperMix,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;ThermoScientific 反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622,購自Thermo Fermentas 公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 干旱脅迫處理 供試高粱種子用1%(W/W)NaClO 溶液浸泡10 min,然后用滅菌的蒸餾水沖洗干凈,采用 0.5×Hoagland 營養(yǎng)液水培,植株在植物光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),生長條件為28 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗,光照強(qiáng)度為9600 lx。營養(yǎng)液每2 d 更換1 次,待植株生長至3 葉期,用含20%(W/W)PEG6000 的營養(yǎng)液水培,模擬干旱脅迫處理,于處理后0、1、3、6、12 h 收集整株植物,每個樣本混合6 株植物,每個時間點(diǎn)取3個生物學(xué)重復(fù)樣本。

        1.2.2SbWRKY基因的表達(dá)譜分析 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載有關(guān)干旱脅迫的高粱28K 芯片表達(dá)數(shù)據(jù)(GSE48205),利用GeneSpring GX 11.5軟件(安捷倫科技有限公司)進(jìn)行分析,獲得探針的相對表達(dá)倍數(shù),計(jì)算log2(fold change)值,然后根據(jù)探針對應(yīng)的基因編號,整理基因的相對表達(dá)值。

        1.2.3 總RNA 提取、cDNA 合成及熒光定量表達(dá)分析 采用植物總RNA 純化試劑盒提取植株總RNA,對總RNA 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性;以總RNA 為模板,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA,所用Marker 為Trans2K? Plus DNA Marker。以cDNA 為模板使用qRT-PCR Mix按照操作說明配制反應(yīng)體系,在LightCycler480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng),內(nèi)參基因選用高粱GAPDH基因。PCR 反應(yīng)體系(10 μL):cDNA 1 μL,2×Mix 5 μL,上游引物、下游引物(表1)各0.25 μL,補(bǔ)ddH2O 至10 μL;PCR擴(kuò)增程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 35 s,35 個循環(huán)。

        1.2.4 qRT-PCR 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 按照2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對表達(dá)值[23]。使用EXCEL 的student’s T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

        表1 高粱組Ⅲ WRKY 基因的qRT-PCR 擴(kuò)增所用引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR amplification of Group III WRKY genes of sorghum

        2 結(jié)果與分析

        2.1 總RNA 完整性檢測

        為保證反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR 試驗(yàn)順利開展,本研究對提取的15 個總RNA 樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,其完整性較好(圖1),可用于后續(xù)試驗(yàn)。

        2.2 SbWRKY 的基因芯片分析結(jié)果

        為研究高粱響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)特征,從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載的高粱28K 芯片(GSE48205)包含對照、干旱脅迫、熱脅迫和復(fù)合脅迫(干旱脅迫和熱脅迫共同處理)共4 組表達(dá)值,將表達(dá)值導(dǎo)入GeneSpring GX 11.5 軟件,經(jīng)數(shù)據(jù)過濾、標(biāo)準(zhǔn)化處理、重要性分析和差異分析等流程,最后篩選得到4 個組ⅢSbWRKY基因的差異表達(dá)倍數(shù)值(表2)。由結(jié)果可知,SbWRKY14、SbWRKY32下調(diào)表達(dá);SbWRKY39在干旱、熱脅迫時下調(diào)表達(dá),但在復(fù)合脅迫時上調(diào)表達(dá);SbWRKY41在3 種脅迫處理時均上調(diào)表達(dá)。

        圖1 15 個RNA 樣本的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Detection of 15 RNA samples by agarose gel electrophoresis

        表2 不同非生物脅迫下高粱SbWRKY 基因表達(dá)值Table 2 Expression values of SbWRKYs in sorghum under different abiotic stresses

        2.3 SbWRKY 基因的qRT-PCR 分析結(jié)果

        為研究組ⅢSbWRKY基因響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)譜,采用PEG6000模擬干旱脅迫于不同時間點(diǎn)取樣,通過qRT-PCR分析基因處理與對照之間的相對表達(dá)值,在16個組Ⅲ成員中成功獲得了12個基因的表達(dá)譜(圖2);各基因在干旱脅迫處理后不同時間點(diǎn)與對照(0 h)相比,SbWRKY10在處理后3、6 h下調(diào)表達(dá),而在處理后12 h上調(diào)表達(dá);SbWRKY14在處理后1、6、12 h下調(diào)表達(dá);SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在處理后1、3、6、12 h均下調(diào)表達(dá);SbWRKY17在處理后1、6、12 h下調(diào)表達(dá);SbWRKY39和SbWRKY89在處理后1、3、12 h下調(diào)表達(dá);SbWRKY53在處理后1、12 h下調(diào)表達(dá),而在6 h上調(diào)表達(dá);SbWRKY75在處理后1 h下調(diào)表達(dá),而在3、6、12 h上調(diào)表達(dá);SbWRKY93在處理后6 h上調(diào)表達(dá)。

        圖2 干旱脅迫下12 個SbWRKY 基因的表達(dá)譜Fig.2 Expression profiles of 12 SbWRKY genes under drought stress

        3 討論

        WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)各種非生物脅迫方面已有相關(guān)報道,WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物對干旱脅迫的響應(yīng)中起重要作用[24]。在擬南芥中過表達(dá)TaWRKY1和TaWRKY33激活了幾個與逆境相關(guān)的下游基因,提高了擬南芥在各種脅迫下的萌發(fā)率,促進(jìn)了根系的生長[25]。在煙草和梨中過表達(dá)PbrWRKY53增強(qiáng)了對干旱脅迫的耐受性。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株的活性氧生成相對更少、抗氧化酶活性和代謝產(chǎn)物更高。此外,在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達(dá)PbrWRKY53導(dǎo)致PbrNCED1的表達(dá)水平提高;敲除PbrWRKY53可下調(diào)PbrNCED1的表達(dá)豐度,同時降低其耐旱性[26]。水稻組ⅢWRKY 轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY11 在干旱和高溫脅迫時誘導(dǎo)表達(dá),以熱激蛋白HSP101基因作啟動子驅(qū)動OsWRKY11表達(dá)時,轉(zhuǎn)基因植株耐熱性和耐旱性增強(qiáng),葉片萎蔫變慢,離體葉片失水較慢;結(jié)果表明OsWRKY11基因在應(yīng)對高溫和干旱脅迫反應(yīng)中起重要作用,可能有助于提高植物的抗逆性[27]。

        為了解SbWRKY基因在干旱脅迫調(diào)控中所起作用,本研究利用公共數(shù)據(jù)庫基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù),分析高粱組ⅢWRKY基因在干旱脅迫、熱脅迫和復(fù)合脅迫條件下的表達(dá)模式,2 個基因(SbWRKY14和SbWRKY32)在3 種處理?xiàng)l件下均下調(diào)表達(dá),1 個基因(SbWRKY41)在3 種處理?xiàng)l件下上調(diào)表達(dá)。基因的表達(dá)趨勢通常反映其相應(yīng)的功能,在雷蒙德棉中,干旱脅迫處理后,有16 個基因(其中包含3 個組Ⅲ成員)誘導(dǎo)表達(dá),15 個基因表達(dá)量減少[28];本研究通過qRTPCR 技術(shù)檢測出12 個基因的表達(dá)譜,其中4 個基 因(SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93)在1 個或多個時間點(diǎn)誘導(dǎo)表達(dá),而4個基因(SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42)在所有時間點(diǎn)均抑制表達(dá)。這些結(jié)果表明,不同的SbWRKY基因在應(yīng)對干旱脅迫時可能起不同的調(diào)控作用。SbWRKY41的qRT-PCR檢測結(jié)果與基因芯片檢測的表達(dá)譜呈相反表達(dá)趨勢,可能是由于兩個研究采用的材料、干旱處理方法不同所致:本研究所用試材為BTx623,以20% PEG6000 模擬干旱脅迫;而芯片試驗(yàn)所用試材為R16,采用自然干旱脅迫處理[29]。

        此外,WRKY 轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物生長發(fā)育、各種生物及非生物脅迫進(jìn)程,如在水稻中已驗(yàn)證了16 個OsWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的功能,結(jié)果表現(xiàn)為Ⅰ類參與抗病進(jìn)程,Ⅱb 類具有抗病和抗逆功能,Ⅱd 類調(diào)控植物的營養(yǎng)生長,而Ⅲ類具有調(diào)控營養(yǎng)生長和抗逆等功能[30]。本研究只開展了Ⅲ類基因在干旱脅迫條件下的表達(dá)譜分析,這些成員還可能響應(yīng)低溫、高溫和高鹽等脅迫反應(yīng)并發(fā)揮一定作用。為深入了解這些基因的功能,后續(xù)還需克隆這些基因,通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證其生物學(xué)功能。

        4 結(jié)論

        高粱WRKY 轉(zhuǎn)錄因子基因在應(yīng)對逆境脅迫中起重要調(diào)控作用,本研究在前人研究基礎(chǔ)上挑選16 個高粱組ⅢWRKY 轉(zhuǎn)錄因子基因開展進(jìn)一步研究。通過基因芯片分析結(jié)果表明,SbWRKY14和SbWRKY32在3 種處理?xiàng)l件下全部下調(diào)表達(dá),表明這2 個WRKY基因在干旱脅迫、熱脅迫和復(fù)合脅迫下具有相似功能;SbWRKY41在3 種脅迫條件下誘導(dǎo)表達(dá)。為進(jìn)一步分析該組成員的表達(dá)譜,以20% PEG6000 模擬干旱脅迫,在0、1、3、6、12 h 取樣,采用qRT-PCR 檢測出該組12 個基因的表達(dá)譜;SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93在1 個或多個時間點(diǎn)誘導(dǎo)表達(dá),而SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在所有時間點(diǎn)均抑制表達(dá)。通過這兩種分析方法,篩選到誘導(dǎo)和抑制表達(dá)基因,這為我們今后深入了解SbWRKY基因在干旱脅迫中的調(diào)控功能提供參考,也為我們克隆耐旱相關(guān)基因提供候選基因。

        猜你喜歡
        高粱結(jié)構(gòu)域基因組
        我終于認(rèn)識高粱了
        高粱名稱考釋
        高粱紅了
        牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
        蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域劃分方法及在線服務(wù)綜述
        重組綠豆BBI(6-33)結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用分析
        組蛋白甲基化酶Set2片段調(diào)控SET結(jié)構(gòu)域催化活性的探討
        泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與泛素化信號的識別
        基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
        遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
        有趣的植物基因組
        欧美在线Aⅴ性色| 国产一区二区三区在线视频观看| 国产亚洲成人av一区| 国产精品白丝久久av网站| 狠狠躁夜夜躁人人躁婷婷视频| 日本一区午夜艳熟免费| 在线观看视频一区| 欧美zozo另类人禽交| 91九色国产在线观看| 黄污在线观看一区二区三区三州| 国产亚州精品女人久久久久久| 国产无遮挡又爽又刺激的视频老师| 美女大量吞精在线观看456| 特级毛片全部免费播放a一级| av免费在线观看网站大全| 免费国产在线视频自拍白浆| 亚洲国产精品无码中文字| 99久久免费精品高清特色大片| 亚洲AV秘 无套一区二区三区| 亚洲精品一区二区成人精品网站| 奇米影视7777久久精品| 亚洲成av人片在线观看ww| 少妇的丰满3中文字幕| 岛国精品一区二区三区| 网址视频在线成人亚洲| 偷拍夫妻视频一区二区| 无码乱人伦一区二区亚洲一| 国产亚洲精久久久久久无码77777| 亚洲综合五月天欧美| 国产三级视频一区二区| 国产剧情一区二区三区在线| 久久国产色av免费观看| 亚洲av无码国产剧情| 亚洲香蕉毛片久久网站老妇人| 蜜乳一区二区三区亚洲国产| 亚洲乱亚洲乱妇| 国产2021精品视频免费播放| 国产 无码 日韩| 日日噜噜噜夜夜狠狠久久蜜桃| 成人影院在线视频免费观看| 欧美中日韩免费观看网站|