（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站/廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524013）

【研究意義】高粱（Sorghum bicolor）是禾本科高粱屬1 年生草本植物，不僅是世界上重要的糧食和能源作物，也是優(yōu)質(zhì)的飼料作物。高粱具有耐旱、耐澇、耐鹽堿等多種特性［1］，其基因組較?。s750 Mb），具有豐富的遺傳多樣性，其優(yōu)良的基因資源在作物改良中具有廣闊的應(yīng)用前景［2］。轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，對轉(zhuǎn)錄過程起誘導(dǎo)或抑制作用［3］。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子作為植物中一類重要轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物生長發(fā)育、響應(yīng)激素誘導(dǎo)和生物及非生物脅迫等生物學(xué)進(jìn)程［4］，開展高粱WRKY基因耐旱性表達(dá)特征分析具有重要意義，可為高粱WRKY基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】WRKY基因家族作為高等植物中備受關(guān)注的基因家族之一，自第一個WRKY 轉(zhuǎn)錄因子基因從甘薯中克隆以來［5］，隨著許多物種基因組測序工作完成，越來越多的WRKY基因從基因組水平上鑒定出來，已在青稞［6］、中?？Х龋?］、大麥［8］和楊樹［9］基因組分別鑒定了41、49、98、122 個WRKY基因。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子包含1～2 個保守WRKY 結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域由約60 個氨基酸序列組成，其保守的7 個核心氨基酸序列為“WRKYGQK”。根據(jù)WRKY保守結(jié)構(gòu)域數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)類型，可將WRKY 轉(zhuǎn)錄因子分為組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ三大類，其中組Ⅱ又分為5 個亞類（Ⅱa～Ⅱe）。組ⅠWRKY 轉(zhuǎn)錄因子包含2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸類型為C2H2，組Ⅱ和組Ⅲ轉(zhuǎn)錄因子只含有1 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指類型分別為C2H2、C2HC 型［10］。據(jù)報道，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與了植物生長發(fā)育的許多進(jìn)程，如開花［11］、次級代謝物合成［12］和衰老［13］等。也有較多研究表明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)各種壓力脅迫，如玉米ZmWRKY62-like基因響應(yīng)鹽和干旱脅迫［14］；小麥TaWRKY33受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，TaWRKY33轉(zhuǎn)基因擬南芥比對照具有更好的耐鹽性［15］；甜高粱SSWRKY28、SSWRKY76基因的表達(dá)結(jié)果表明，它們可能在應(yīng)答干旱脅迫時發(fā)揮一定作用［16］；高粱SbWRKY30基因通過影響擬南芥和水稻的根系結(jié)構(gòu)來提高對干旱脅迫的耐受性，擬南芥和水稻的轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫后脯氨酸含量、SOD、POD 和CAT 酶活性高于野生型植株，而MDA 含量低于野生型植株［17］。【本研究切入點(diǎn)】前人研究結(jié)果表明，組ⅢWRKY 成員廣泛參與植物生長發(fā)育進(jìn)程、生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)［18］。趙興奎等［19］已從高粱基因組鑒定了16個組ⅢWRKY成員，但沒有研究其響應(yīng)逆境脅迫的表達(dá)譜。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以高粱品種BTx623 為試材，采用PEG6000 溶液模擬干旱脅迫［20-21］，研究高粱組ⅢWRKY成員響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)譜，為挖掘耐旱候選基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試高粱品種為BTx623，由廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心保存，該材料有參考基因組序列，為中等耐旱性材料［22］。高粱組ⅢWRKY基因信息來自參考文獻(xiàn)［19］，基因序列下載 自Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

主要試劑：TransZol Plant 植物總RNA 純化試劑盒、Trans2K? Plus DNA Marker、TransStart?Top Green qPCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；ThermoScientific 反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622，購自Thermo Fermentas 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 干旱脅迫處理 供試高粱種子用1%（W/W）NaClO 溶液浸泡10 min，然后用滅菌的蒸餾水沖洗干凈，采用 0.5×Hoagland 營養(yǎng)液水培，植株在植物光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長條件為28 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗，光照強(qiáng)度為9600 lx。營養(yǎng)液每2 d 更換1 次，待植株生長至3 葉期，用含20%（W/W）PEG6000 的營養(yǎng)液水培，模擬干旱脅迫處理，于處理后0、1、3、6、12 h 收集整株植物，每個樣本混合6 株植物，每個時間點(diǎn)取3個生物學(xué)重復(fù)樣本。

1.2.2SbWRKY基因的表達(dá)譜分析 從NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載有關(guān)干旱脅迫的高粱28K 芯片表達(dá)數(shù)據(jù)（GSE48205），利用GeneSpring GX 11.5軟件（安捷倫科技有限公司）進(jìn)行分析，獲得探針的相對表達(dá)倍數(shù)，計(jì)算log2（fold change）值，然后根據(jù)探針對應(yīng)的基因編號，整理基因的相對表達(dá)值。

1.2.3 總RNA 提取、cDNA 合成及熒光定量表達(dá)分析 采用植物總RNA 純化試劑盒提取植株總RNA，對總RNA 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性；以總RNA 為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，所用Marker 為Trans2K? Plus DNA Marker。以cDNA 為模板使用qRT-PCR Mix按照操作說明配制反應(yīng)體系，在LightCycler480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)，內(nèi)參基因選用高粱GAPDH基因。PCR 反應(yīng)體系（10 μL）：cDNA 1 μL，2×Mix 5 μL，上游引物、下游引物（表1）各0.25 μL，補(bǔ)ddH2O 至10 μL；PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，35 個循環(huán)。

1.2.4 qRT-PCR 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 按照2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對表達(dá)值［23］。使用EXCEL 的student’s T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 高粱組Ⅲ WRKY 基因的qRT-PCR 擴(kuò)增所用引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR amplification of Group III WRKY genes of sorghum

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 完整性檢測

為保證反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR 試驗(yàn)順利開展，本研究對提取的15 個總RNA 樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其完整性較好（圖1），可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 SbWRKY 的基因芯片分析結(jié)果

為研究高粱響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)特征，從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載的高粱28K 芯片（GSE48205）包含對照、干旱脅迫、熱脅迫和復(fù)合脅迫（干旱脅迫和熱脅迫共同處理）共4 組表達(dá)值，將表達(dá)值導(dǎo)入GeneSpring GX 11.5 軟件，經(jīng)數(shù)據(jù)過濾、標(biāo)準(zhǔn)化處理、重要性分析和差異分析等流程，最后篩選得到4 個組ⅢSbWRKY基因的差異表達(dá)倍數(shù)值（表2）。由結(jié)果可知，SbWRKY14、SbWRKY32下調(diào)表達(dá)；SbWRKY39在干旱、熱脅迫時下調(diào)表達(dá)，但在復(fù)合脅迫時上調(diào)表達(dá)；SbWRKY41在3 種脅迫處理時均上調(diào)表達(dá)。

圖1 15 個RNA 樣本的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Detection of 15 RNA samples by agarose gel electrophoresis

表2 不同非生物脅迫下高粱SbWRKY 基因表達(dá)值Table 2 Expression values of SbWRKYs in sorghum under different abiotic stresses

2.3 SbWRKY 基因的qRT-PCR 分析結(jié)果

為研究組ⅢSbWRKY基因響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)譜，采用PEG6000模擬干旱脅迫于不同時間點(diǎn)取樣，通過qRT-PCR分析基因處理與對照之間的相對表達(dá)值，在16個組Ⅲ成員中成功獲得了12個基因的表達(dá)譜（圖2）；各基因在干旱脅迫處理后不同時間點(diǎn)與對照（0 h）相比，SbWRKY10在處理后3、6 h下調(diào)表達(dá)，而在處理后12 h上調(diào)表達(dá)；SbWRKY14在處理后1、6、12 h下調(diào)表達(dá)；SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在處理后1、3、6、12 h均下調(diào)表達(dá)；SbWRKY17在處理后1、6、12 h下調(diào)表達(dá)；SbWRKY39和SbWRKY89在處理后1、3、12 h下調(diào)表達(dá)；SbWRKY53在處理后1、12 h下調(diào)表達(dá)，而在6 h上調(diào)表達(dá)；SbWRKY75在處理后1 h下調(diào)表達(dá)，而在3、6、12 h上調(diào)表達(dá)；SbWRKY93在處理后6 h上調(diào)表達(dá)。

圖2 干旱脅迫下12 個SbWRKY 基因的表達(dá)譜Fig.2 Expression profiles of 12 SbWRKY genes under drought stress

3 討論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)各種非生物脅迫方面已有相關(guān)報道，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物對干旱脅迫的響應(yīng)中起重要作用［24］。在擬南芥中過表達(dá)TaWRKY1和TaWRKY33激活了幾個與逆境相關(guān)的下游基因，提高了擬南芥在各種脅迫下的萌發(fā)率，促進(jìn)了根系的生長［25］。在煙草和梨中過表達(dá)PbrWRKY53增強(qiáng)了對干旱脅迫的耐受性。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的活性氧生成相對更少、抗氧化酶活性和代謝產(chǎn)物更高。此外，在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達(dá)PbrWRKY53導(dǎo)致PbrNCED1的表達(dá)水平提高；敲除PbrWRKY53可下調(diào)PbrNCED1的表達(dá)豐度，同時降低其耐旱性［26］。水稻組ⅢWRKY 轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY11 在干旱和高溫脅迫時誘導(dǎo)表達(dá)，以熱激蛋白HSP101基因作啟動子驅(qū)動OsWRKY11表達(dá)時，轉(zhuǎn)基因植株耐熱性和耐旱性增強(qiáng)，葉片萎蔫變慢，離體葉片失水較慢；結(jié)果表明OsWRKY11基因在應(yīng)對高溫和干旱脅迫反應(yīng)中起重要作用，可能有助于提高植物的抗逆性［27］。

為了解SbWRKY基因在干旱脅迫調(diào)控中所起作用，本研究利用公共數(shù)據(jù)庫基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析高粱組ⅢWRKY基因在干旱脅迫、熱脅迫和復(fù)合脅迫條件下的表達(dá)模式，2 個基因（SbWRKY14和SbWRKY32）在3 種處理?xiàng)l件下均下調(diào)表達(dá)，1 個基因（SbWRKY41）在3 種處理?xiàng)l件下上調(diào)表達(dá)。基因的表達(dá)趨勢通常反映其相應(yīng)的功能，在雷蒙德棉中，干旱脅迫處理后，有16 個基因（其中包含3 個組Ⅲ成員）誘導(dǎo)表達(dá)，15 個基因表達(dá)量減少［28］；本研究通過qRTPCR 技術(shù)檢測出12 個基因的表達(dá)譜，其中4 個基 因（SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93）在1 個或多個時間點(diǎn)誘導(dǎo)表達(dá)，而4個基因（SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42）在所有時間點(diǎn)均抑制表達(dá)。這些結(jié)果表明，不同的SbWRKY基因在應(yīng)對干旱脅迫時可能起不同的調(diào)控作用。SbWRKY41的qRT-PCR檢測結(jié)果與基因芯片檢測的表達(dá)譜呈相反表達(dá)趨勢，可能是由于兩個研究采用的材料、干旱處理方法不同所致：本研究所用試材為BTx623，以20% PEG6000 模擬干旱脅迫；而芯片試驗(yàn)所用試材為R16，采用自然干旱脅迫處理［29］。

此外，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物生長發(fā)育、各種生物及非生物脅迫進(jìn)程，如在水稻中已驗(yàn)證了16 個OsWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的功能，結(jié)果表現(xiàn)為Ⅰ類參與抗病進(jìn)程，Ⅱb 類具有抗病和抗逆功能，Ⅱd 類調(diào)控植物的營養(yǎng)生長，而Ⅲ類具有調(diào)控營養(yǎng)生長和抗逆等功能［30］。本研究只開展了Ⅲ類基因在干旱脅迫條件下的表達(dá)譜分析，這些成員還可能響應(yīng)低溫、高溫和高鹽等脅迫反應(yīng)并發(fā)揮一定作用。為深入了解這些基因的功能，后續(xù)還需克隆這些基因，通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證其生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

高粱WRKY 轉(zhuǎn)錄因子基因在應(yīng)對逆境脅迫中起重要調(diào)控作用，本研究在前人研究基礎(chǔ)上挑選16 個高粱組ⅢWRKY 轉(zhuǎn)錄因子基因開展進(jìn)一步研究。通過基因芯片分析結(jié)果表明，SbWRKY14和SbWRKY32在3 種處理?xiàng)l件下全部下調(diào)表達(dá)，表明這2 個WRKY基因在干旱脅迫、熱脅迫和復(fù)合脅迫下具有相似功能；SbWRKY41在3 種脅迫條件下誘導(dǎo)表達(dá)。為進(jìn)一步分析該組成員的表達(dá)譜，以20% PEG6000 模擬干旱脅迫，在0、1、3、6、12 h 取樣，采用qRT-PCR 檢測出該組12 個基因的表達(dá)譜；SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93在1 個或多個時間點(diǎn)誘導(dǎo)表達(dá)，而SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在所有時間點(diǎn)均抑制表達(dá)。通過這兩種分析方法，篩選到誘導(dǎo)和抑制表達(dá)基因，這為我們今后深入了解SbWRKY基因在干旱脅迫中的調(diào)控功能提供參考，也為我們克隆耐旱相關(guān)基因提供候選基因。