趙露，田勝，劉璐，劉葉，童珊珊，徐希明

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

楊梅葉中富含黃酮、有機(jī)酸、多糖等多種生物活性成分，具有降血糖、肝臟保護(hù)、抗氧化、抗菌等作用[1-2]。研究表明，楊梅葉黃酮化合物對自由基具有較強(qiáng)的清除能力[3-4]。但目前楊梅葉中黃酮類成分的抗氧化活性成分的篩選研究尚停留在總提取物、總黃酮或楊梅苷、槲皮素等個別化合物層面[5]，基于在線篩選的方法一次性分離及評價楊梅葉中的多個抗氧化活性成分尚不清楚。經(jīng)典的抗氧化活性測定方法包括ABTS自由基清除實驗、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基清除實驗、鐵離子還原(FRAP)實驗等[6-7]。本實驗結(jié)合經(jīng)典的抗氧化評價方法，建立了一種2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基-高效液相色譜(DPPH-HPLC)在線篩選楊梅葉中抗氧化活性成分的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DPPH(批號：C10091989，上海麥克林生化科技有限公司)；總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS 法，南京建成生物工程研究所)；甲醇和乙腈購買自國藥集團(tuán)(色譜純)；對照品購買自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；槲皮素、楊梅素、楊梅苷和山柰酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，楊梅葉采自江蘇鎮(zhèn)江江蘇大學(xué)圖書館后山，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院傅海珍老師鑒定為雙子葉綱楊梅科楊梅屬植物楊梅(Myricarubra)的干燥葉子；抗壞血酸、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、醋酸、FeCl3及其他試劑等均為分析純；娃哈哈純凈水若干。

LC-20AT VP型高效液相色譜儀、SPD-20A 型紫外檢測器均為日本Shimadzu公司產(chǎn)品；N2000型色譜數(shù)據(jù)工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)；XT120A型電子天平(瑞士Precisa公司)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；KQ-250B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品和對照品溶液的制備 采摘的新鮮楊梅葉經(jīng)清洗、烘干后粉碎，過180 μm篩，脫脂，得楊梅葉細(xì)粉。稱取烘干的脫脂細(xì)粉0.6 g，置于錐形瓶中，按料液比1∶20加入12 mL無水乙醇(含1.2 mol/L鹽酸)，于功率100 W、頻率40 kHz 超聲條件下提取2次，每次提取40 min。合并提取液后抽濾并減壓濃縮，殘渣用無水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，待用。

分別精密稱取10 mg對照品槲皮素、楊梅素、楊梅苷、山柰酚，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的四個活性成分對照品溶液。

1.2.2 DPPH-HPLC法在線篩選楊梅葉中抗氧化活性成分 色譜柱為Shimadzu C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～30 min，20%乙腈；30～32 min，20%～30%乙腈；32～45 min，30%乙腈；45～60 min，20%～30%乙腈。

DPPH·溶液(2 mg/L甲醇溶液)流速 0.4 mL/min，混合后的檢測波長為517 nm，柱后反應(yīng)管長615 cm。儀器組裝參考文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行，見圖1。

圖1 DPPH-HPLC在線分析儀器示意圖

1.2.3 HPLC方法學(xué)考察

1.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.1”中四個活性成分，楊梅素、槲皮素、楊梅苷、山柰酚的對照品溶液，按10∶2∶1∶1比例混合，配制成混合對照溶液。精密量取混合對照溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋，搖勻。分別精密吸取20 μL，按“1.2.2”色譜條件測定。

1.2.3.2 精密度試驗 取混合對照溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄楊梅苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚的峰面積，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。

1.2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批楊梅葉粉末，按“1.2.1”方法平行制備 6 份供試溶液，進(jìn)樣分析，測定峰面積，計算其含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，計算RSD值。

1.2.4 DPPH自由基清除率檢測 精確稱量20 mg DPPH，置于250 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到200 μmol/L DPPH-甲醇溶液。取“1.2.1”中不同濃度樣品溶液50 μL，加入DPPH-甲醇溶液150 μL，對照組用50 μL甲醇代替樣品溶液，空白組用150 μL甲醇代替DPPH溶液，充分振蕩混勻，避光反應(yīng)30 min，517 nm處測其光密度值，計算自由基清除率。DPPH自由基清除率(%)=[1-(D樣本-D空白)/D對照]×100%。

1.2.5 ABTS總抗氧化能力實驗 取試劑盒中的ABTS溶液和氧化劑等體積配制，得ABTS工作母液，室溫避光存放12～16 h后方可使用。使用前，用80%乙醇將ABTS工作母液稀釋成ABTS工作液，用蒸餾水稀釋對照品。將試劑盒中10 mmol/L Trolox(水溶性VE)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。于24孔板中每孔加入200 μL ABTS工作液和10 μL各濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，輕輕混勻，靜置孵育2～6 min，在734 nm處測光密度。處理數(shù)據(jù)，繪制Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述測定Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式測定不同濃度的樣品溶液，平行3次實驗。

1.2.6 FRAP實驗 FRAP工作液配制：300 mmol/L醋酸緩沖液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液(溶于40 mmol/L HCl，現(xiàn)配現(xiàn)用)、20 mmol/L FeCl3溶液，按10∶1∶1配制。取150 μL不同濃度樣品溶液，加入2 850 μL預(yù)熱至37 ℃的FRAP工作液中，搖勻，避光37 ℃放置30 min；于593 nm波長處測定光密度，平行3次實驗。

2 結(jié)果

2.1 HPLC方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系 以各對照品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：楊梅苷Y=3 619 531X-1 307.356 0 (R2=0.999 3)，楊梅素Y=2 433 527X-14 072.000 0(R2=0.999 0)，槲皮素Y=1 890 813X-1 272.906 0 (R2=0.999 2)，山柰酚Y=4 763 985X-2 611.206 0(R2=0.999 1)。由上述線性回歸方程，計算得楊梅葉生藥中各組分的含量：槲皮素0.590 3 mg/g、楊梅素3.199 5 mg/g、楊梅苷0.290 0 mg/g、山柰酚0.092 6 mg/g。

2.1.2 精密度試驗 取混合對照溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得楊梅苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚峰面積的RSD分別為0.41%、0.40%、0.26%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗 測得楊梅苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.40%、0.13%、0.15%、0.17%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 測得楊梅苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚峰面積的RSD分別為0.43%、0.55%、0.29%、1.24%。結(jié)果表明，供試溶液室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 DPPH-HPLC法在線篩選楊梅葉中抗氧化活性成分結(jié)果

由色譜圖2得出，楊梅葉粗提液經(jīng)DPPH-HPLC分析，有4個明顯倒峰出現(xiàn)(反應(yīng)時間約為180 s，即前后兩個色譜圖的保留值相差約3 min)；經(jīng)與對照品保留值相比，篩選出楊梅葉粗提液中主要的抗氧化黃酮類成分應(yīng)為楊梅苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚。

A: 反應(yīng)前；B：反應(yīng)后

2.3 DPPH自由基清除活性

在10～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)，楊梅葉中四種黃酮類成分均顯示有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的作用，且在10～50 μg/mL范圍內(nèi)具有較明顯的濃度依賴關(guān)系，即所有被測組分的DPPH·清除能力都隨樣品濃度的增加而增強(qiáng)。樣品清除DPPH自由基能力采用DPPH·清除率為50%時所需樣品濃度IC50值表示，詳見表1。槲皮素、楊梅素、楊梅苷、山柰酚、L-抗壞血酸、Trolox 的IC50分別為17.42、20.22、30.44、26.23、21.40、41.68 μg/mL，表明槲皮素和楊梅素對DPPH自由基的清除效應(yīng)強(qiáng)于L-抗壞血酸，自由基清除效果較好，楊梅葉中的四種黃酮類成分均具有比Trolox更強(qiáng)的抑制DPPH·的作用。

表1 楊梅葉中黃酮類成分對DPPH自由基的清除作用 %

2.4 ABTS自由基清除活性

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式為Y=-0.591 8X+0.758 2 (R2=0.996 2)。各樣品對ABTS+自由基清除能力見圖3。楊梅葉中四種黃酮類成分均有不同程度的抗氧化作用，各樣品清除ABTS+自由基的能力：槲皮素>楊梅素>L-抗壞血酸>山柰酚≈楊梅苷。由此表明，槲皮素和楊梅素對ABTS+自由基的清除效應(yīng)較L-抗壞血酸高，自由基清除效果較好，而楊梅苷和山柰酚的抗氧化能力較弱。

圖3 楊梅葉中黃酮類成分對ABTS+自由基的清除作用

2.5 鐵離子還原力

楊梅葉中黃酮類成分鐵離子還原力測定結(jié)果見圖4。槲皮素、楊梅素、楊梅苷、山柰酚、L-抗壞血酸樣品的D(593 nm)值：槲皮素>楊梅素>L-抗壞血酸>山柰酚≈楊梅苷。由此表明，槲皮素和楊梅素較楊梅苷和山柰酚具有明顯的還原效果，即具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

圖4 鐵離子還原力測定

3 討論

本研究利用紫外檢測器在波長200～400 nm內(nèi)對對照品溶液進(jìn)行紫外光譜全掃描，結(jié)果顯示，楊梅素、楊梅苷、槲皮素和山柰酚在波長254 nm和360 nm處均有良好吸收。由于楊梅素、楊梅苷、槲皮素在360 nm處的吸收強(qiáng)度小于254 nm處，兼顧三者的靈敏度，因此確定檢測波長為254 nm。四種活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有酚羥基，具有一定的弱酸性，在流動相中加入適量磷酸以改善峰形和分離效果。在上述色譜條件下，槲皮素、楊梅素、楊梅苷和山柰酚與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按楊梅素峰計算不低于4 000，各色譜峰拖尾因子在0.95～1.05內(nèi)。樣品含量測定結(jié)果表明，楊梅葉中楊梅素含量最高，山柰酚含量較少。

經(jīng)典的中藥活性成分研究需先將各物質(zhì)通過分離純化鑒定，再分別進(jìn)行抗氧化實驗的評價，耗時長且無法即時對提取方法進(jìn)行測評。本實驗將高效液相檢測裝置進(jìn)行簡單改造，建立DPPH-HPLC在線篩選抗氧化活性成分的方法，待測液首先經(jīng)過適宜的色譜條件得到良好分離；隨后，第一個紫外檢測器得到色譜峰正信號，給出各個組分信息；經(jīng)與DPPH自由基反應(yīng)后的第二個檢測器設(shè)置波長為517 nm，樣品中如有抗氧化活性物質(zhì)，則與DPPH自由基反應(yīng)后，517 nm處響應(yīng)值降低，相應(yīng)的色譜峰為負(fù)值，無抗氧化活性的物質(zhì)基本無負(fù)峰出現(xiàn)。本法篩選出楊梅葉粗提液中主要的抗氧化黃酮類成分應(yīng)為楊梅苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚。

為證實本法的抗氧化活性篩選結(jié)果，篩選出的抗氧化活性化合物通過DPPH、ABTS、FRAP實驗驗證其抗氧化活性，證實楊梅葉黃酮類化合物在線、離線相結(jié)合的篩選抗氧化活性成分的方法具有切實的可行性。DPPH·是以氮為中心的穩(wěn)定自由基，其醇溶液呈紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收，如果試驗樣品能清除DPPH·，表明樣品具有降低羥自由基、烷自由基或打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用[10]。ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+，在抗氧化物存在時ABTS+產(chǎn)生被抑制，通過測定705 nm處ABTS+光密度可計算樣品的總抗氧化能力[11]。FRAP法是基于氧化還原反應(yīng)，在酸性pH值下，F(xiàn)e3+與TPTZ形成復(fù)合物(Fe3+-TPTZ)，在還原物質(zhì)的作用下，復(fù)合物被還原為Fe2+而呈明顯的藍(lán)色，在593 nm達(dá)最大吸收，其吸光度變化與還原物質(zhì)的含量呈正比例關(guān)系，可以作為測定物質(zhì)總抗氧化能力的一種方法[12]。綜合分析以上不同方法的抗氧化試驗，結(jié)果表明，楊梅葉中黃酮類成分的抗氧化活性為槲皮素的抗氧化能力最強(qiáng)，其次為楊梅素，且兩者的抗氧化能力都強(qiáng)于L-抗壞血酸，而楊梅苷和山柰酚的抗氧化能力較弱。本實驗在建立楊梅葉提取物化學(xué)成分色譜分離的基礎(chǔ)上，進(jìn)行抗氧化活性在線篩選，另針對四種活性成分進(jìn)行DPPH·清除能力、總抗氧化能力以及還原力的研究，驗證了DPPH-HPLC的分析結(jié)果。該法快速、有效，為楊梅葉這類可能含有易氧化降解成分的中藥活性物質(zhì)快速篩選提供了一定參考。