劉暢，劉雄偉，丁晶鑫，李嘉欣，尹志剛，周英,3

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 3. 貴州省藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

黃褐毛忍冬(L.fulvotomentosaHsu et S. C. Cheng)是忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物，為中國(guó)藥典收載山銀花的基原植物，味甘、寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效(中國(guó)藥典，2015版)。其主要含有綠原酸、皂苷類、醇類、酯類、黃酮類等多種化合物[1-3]，具有解熱、抗菌、抗內(nèi)毒素、抗病毒、抗炎、降血糖血脂、免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗氧化功能等功效[4]。黃褐毛忍冬水提物及醇提物能夠使四氯化碳致急性肝損傷小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肝臟三酰甘油及肝臟丙二醛的含量降低，水煎液較醇提物具有更好的保肝作用[5]，但對(duì)其含有的主要藥效成分和分子作用機(jī)制尚不清楚。故鑒定黃褐毛忍冬的主要成分與作用靶點(diǎn)對(duì)闡釋其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制具有重要意義。

超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF-MS)目前已被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的快速鑒定[6]，將液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)掃描的碎片離子信息和化合物裂解規(guī)律與對(duì)照品或文獻(xiàn)比對(duì)，可快速、準(zhǔn)確地分析中藥中所含化學(xué)成分[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)利用復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建藥物、靶點(diǎn)與疾病間的相互作用關(guān)系網(wǎng)，闡述中藥的多成分-多靶點(diǎn)-多途徑作用關(guān)系，可預(yù)測(cè)化學(xué)成分作用的靶點(diǎn)和揭示中藥成分復(fù)雜的作用機(jī)制[8]。整合化學(xué)物質(zhì)組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，可為中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)的發(fā)現(xiàn)提供更有效的研究方法和路徑[9]。

因此，本研究擬利用UPLC-Q-TOF-MS快速解析和鑒別黃褐毛忍冬中的化學(xué)成分，同時(shí)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)其主要作用節(jié)點(diǎn)和通路，預(yù)測(cè)黃褐毛忍冬保肝作用的潛在靶點(diǎn)。從化學(xué)物質(zhì)組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探究黃褐毛忍冬的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑保肝作用機(jī)制，為尋找黃褐毛忍冬的質(zhì)量標(biāo)志物，有效控制中藥質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥材及化學(xué)試劑

黃褐毛忍冬采自貴州省興義市安龍縣德臥鎮(zhèn)水井村，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為黃褐毛忍冬的干燥花蕾。無(wú)水乙醇(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；乙腈、甲醇(GR，阿拉丁試劑有限公司)；乙酸(GR，北京邁瑞達(dá)科技有限公司)；蘆丁(純度≥97%)，綠原酸(純度≥98%)，新綠原酸(純度≥98%)，隱綠原酸(純度≥98%)，異綠原酸A(純度≥98%)，異綠原酸B(純度≥98%)，異綠原酸C(純度≥98%)，咖啡酸(純度≥98.5%)，上述標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；α-常春藤皂苷(純度≥98%)，灰氈毛忍冬皂苷甲(純度≥98%)，灰氈毛忍冬皂苷乙(純度≥98%)，斷氧化馬錢(qián)子苷(純度≥98%)，木犀草苷(純度≥97%)，異槲皮苷(純度≥98%)，斷馬錢(qián)子酸(純度≥99%)，上述標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都瑞芬思生物科技股份有限公司。

1.2 主要儀器

Acquity UPLCTM液相色譜儀，Acquity UPLC?BEH C18 Column(美國(guó)Waters集團(tuán)公司)，Xevo G2-XS QTof (ESI離子源，美國(guó)Waters集團(tuán)公司)，SG8200HPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液和供試品溶液制備 分別精密稱量10 mg標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇有機(jī)溶液作為溶媒，超聲至標(biāo)品全部溶解完全，配置成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取黃褐毛忍冬干品適量，蒸餾水回流提取，以料液比1∶20，1.5 h/次，提取3次，趁熱抽濾，合并3次提取的濾液，水浴蒸干得供試品浸膏，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?；取適量浸膏加甲醇超聲溶解，置于10 mL容量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，制備成1 g/mL(相當(dāng)于每毫升含1 g生藥的溶液)的藥液，進(jìn)樣前用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)。

1.3.2 色譜條件 色譜儀：Acquity UPLCTM液相色譜儀(四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測(cè)器，在線真空脫氣機(jī))；色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18 Column(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A相為乙腈溶液，B相為0.4%乙酸水溶液；洗脫梯度條件：流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；色譜儀流出液不經(jīng)分流直接注入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。梯度洗脫程序: 0～1 min，5% A，95% B；1～18 min，98% A，2% B；18～20 min，5% A，95% B。

1.3.3 質(zhì)譜條件 采用ESI電噴霧源，分別在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)掃描范圍質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)(m/z)：50～1 500。離子源參數(shù)：噴霧電壓1 500 V，錐孔采樣電壓：40 V；離子源溫度：110 ℃；氣簾氣流量：50 L/h；去溶劑氣溫度：112 ℃；去溶劑氣流量(N2)：800 L/h；碰撞能量：20～30 V；用Masslynx 4.1工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和后續(xù)分析處理。

1.3.4 藥物成分的吸收 根據(jù)Lipinski類藥五原則，將鑒定出的化合物導(dǎo)入Molinspiration網(wǎng)站(http:∥www.molinspiration.com/cgi-bin/properties)，依據(jù)其油水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值(logP)、相對(duì)分子質(zhì)量(MW)、拓?fù)錁O性表面積(TPSA)、氫鍵給體數(shù)(nON)、氫鍵受體數(shù)(nOHNH)與旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)(nrotb)等性質(zhì)預(yù)測(cè)藥物分子的吸收情況[10-11]。符合以下規(guī)則： ① nON≤5，② nOHNH≤10，③ MW<500，④ logP為-2～5，⑤ nrotb≤10的化合物會(huì)有更好的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)代謝過(guò)程中會(huì)有更高的生物利用度。如果一個(gè)化合物違反了其中兩個(gè)規(guī)則將可能有水溶性或透膜性差的問(wèn)題。

1.3.5 有效成分作用靶標(biāo)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)的收集 利用ALOGPS 2.1(http:∥www.vcclab.org/lab/alogps/)平臺(tái)，將黃褐毛忍冬化合物結(jié)構(gòu)圖轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES格式。將Canonical SMILES格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction平臺(tái)(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)和Similarity ensemble approach (SEA)數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥sea.bkslab.org/)，將其屬性設(shè)置為“homo sapiens”，預(yù)測(cè)化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將這些靶蛋白轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱。通過(guò)GeneCards(https:∥genecards.weizmann.ac.il/v3/)，以“acute liver injury”為關(guān)鍵詞檢索與肝損傷相關(guān)的基因，篩選并刪除重復(fù)靶點(diǎn)基因，與化合物作用的靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集比對(duì)，最終獲得化合物-疾病靶點(diǎn)。

1.3.6 “有效成分-靶點(diǎn)”和蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將化學(xué)成分與候選靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，建立成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。為了分析靶點(diǎn)間的相互作用，將候選靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系，保存為T(mén)SV格式，把條目node1和node2數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，計(jì)算度(degree)值，將靶點(diǎn)大小和顏色設(shè)置用于反映節(jié)點(diǎn)(node)數(shù)的大小，顏色的深淺設(shè)置用于反映結(jié)合分?jǐn)?shù)的大小，從而獲得最終的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用KOBAS3.0(http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn/)工具對(duì)化合物-靶點(diǎn)交集蛋白靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路富集分析(P<0.05)，篩選黃褐毛忍冬主要化學(xué)成分參與的生物學(xué)通路。

2 結(jié)果

2.1 黃褐毛忍冬的化學(xué)成分鑒定及吸收預(yù)測(cè)

采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)黃褐毛忍冬中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，通過(guò)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息分析并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，黃褐毛忍冬水提物樣品圖譜中共鑒定和表征出57個(gè)化學(xué)成分，主要為黃酮、有機(jī)酸、生物堿、環(huán)烯醚萜、皂苷等類型的化合物(圖1)。根據(jù)Lipinski類藥五原則，利用Molinspiration網(wǎng)站對(duì)所鑒定的化合物進(jìn)一步進(jìn)行生物利用度預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24種成分均可能被吸收(表1)，包括奎尼酸(Quinic acid)，獐牙菜苷(Sweroside)，新綠原酸(Neochlorogenic acid)，4,6-O-亞乙基-α-D-葡萄糖(Ethylidene glucose)，綠原酸(Chlorogenic acid)，隱綠原酸(Cryptochlorogenic acid)，斷氧化馬錢(qián)苷酸(Secologanoside)，斷馬錢(qián)子酸(Secologanic acid)，5-對(duì)香豆酰基奎寧酸(5-p-coumaroylquinic acid)，桃葉珊瑚甙元(6′-O-beta-Glucosylaucubin)，木犀草苷(Cynaroside)，梔子苷(Gardenoside)，甲氧基香豆素(7-Methoxycoumarin)，3-O-阿魏?？崴?3-O-feruloylquinic acid)，幼枝含斷氧化馬錢(qián)子甙(Secoxyloganin)，斷馬錢(qián)子苷半縮醛內(nèi)酯(Vogeloside)，幼枝含斷氧化馬錢(qián)子甙甲酯(Secoxyloganin methyl ester)，異槲皮苷(Isoquercitrin)，槲皮素(Quercetin)，山柰酚-7-葡萄糖苷(Kaempferol-7-glucoside)，山柰酚(Kaempferol)，忍冬甙(Lonicerin)，槲皮素-7-O-葡萄糖苷(Quercetin-7-O-β-glucopyranoside)，齊墩果酸(Oleanolic acid)。

A: BPI-; B: BPI+

2.2 黃褐毛忍冬主要化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及篩選

利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到329個(gè)靶點(diǎn)，利用SEA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到279個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)共得到551個(gè)靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與急性肝損傷相關(guān)的基因共6 089個(gè)。將此網(wǎng)絡(luò)與黃褐毛忍冬對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)功能相映射，篩選得到319個(gè)黃褐毛忍冬潛在的靶點(diǎn)。

2.3 候選化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

將化合物和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape分析軟件，構(gòu)建黃褐毛忍冬化學(xué)成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)(圖2)，其中化學(xué)成分、靶點(diǎn)用節(jié)點(diǎn)表示，化學(xué)成分與靶點(diǎn)的相互關(guān)系用邊(edge)表示，有16個(gè)成分作用于同一靶點(diǎn)碳酸酐酶2(CA2)，138個(gè)靶點(diǎn)僅與一個(gè)成分鏈接，存在一個(gè)化學(xué)成分與多個(gè)靶點(diǎn)相互作用和不同化學(xué)成分作用于同一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，表現(xiàn)了中藥的多成分、多靶點(diǎn)相互作用的特點(diǎn)。每種化合物作用于多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)也可由多個(gè)化合物產(chǎn)生作用。從靶點(diǎn)角度來(lái)看，較為重要的靶點(diǎn)有CA2(degree=16)，醛糖還原酶1(AKR1B1，degree=15)，碳酸酐酶1(CA1，degree=14)，碳酸酐酶9(CA9，degree=14)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA，degree=14)，白介素2(IL-2，degree=13)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶基因1(ERAP1，degree=12)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1(FGF1，degree=11)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2，degree=11)，醛氧化酶5(ALOX5，degree=10)，腺苷受體A1(ADORA1，degree=10)，碳酸酐酶4(CA4，degree=10)等。從化合物角度來(lái)看，較為重要的化合物為山柰酚(degree=98)、槲皮苷(degree=93)、齊墩果酸(degree=78)、甲氧基香豆素(degree=73)、梔子苷(degree=47)、隱綠原酸(degree=39)、木犀草苷(degree=39)、4,6-O-亞乙基-α-D-葡萄糖(degree=38)、山柰酚-7-葡萄糖苷(degree=38)、斷馬錢(qián)子苷半縮醛內(nèi)酯(degree=35)、綠原酸(degree=34)、新綠原酸(degree=34)、奎尼酸(degree=30)、3-O-阿魏?？崴?degree=30)、異槲皮苷(degree=30)等。

2.4 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃褐毛忍冬預(yù)防急性肝損傷的靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)定打分值為高置信度0.900，獲得蛋白相互作用關(guān)系，將其保存為T(mén)SV文件，導(dǎo)入Cytoscape中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，得到254個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 268條邊，選取degree>10作圖，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖3)。靶點(diǎn)兩兩之間的互作作用各不相同，其中顏色深淺反映該靶點(diǎn)連接其他靶點(diǎn)個(gè)數(shù)的多少，用度(degree)體現(xiàn)，degree值越高，顏色越深(黃色)表明該靶點(diǎn)的作用越關(guān)鍵。對(duì)其進(jìn)行拓?fù)浞治?，依?jù)相關(guān)參數(shù)：度(degree)，介度(betweenness)，緊密度(closeness)大小，確定了網(wǎng)絡(luò)中的11個(gè)關(guān)鍵核心靶標(biāo)：磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1，degree=54)，淀粉樣前體蛋白(APP，degree=48)，絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3，degree=46)，原癌基因(SRC，degree=39)，熱休克蛋白90α(HSP90AA1，degree=36)，絲/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1，degree=36)，轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3，degree=33)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFA，degree=29)，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR，degree=29)，B細(xì)胞κ輕肽基因增強(qiáng)子核因子1(NFKB1，degree=28)，ppGpp合成酶基因(RELA，degree=27)。

表1 黃褐毛忍冬水提物化學(xué)成分鑒定分析

續(xù)表1

圖2 黃褐毛忍冬化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作

2.5 靶標(biāo)功能富集分析及“成分-靶標(biāo)-通路-功能”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用KOBAS 3.0在線軟件進(jìn)行KEGG生物通路分析結(jié)果表明，319個(gè)靶點(diǎn)主要富集在242個(gè)信號(hào)通路(P<0.05)，得到急性肝損傷相關(guān)的26個(gè)功能條目(表2)，涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路等。

將富集分析得到的26個(gè)主要通路對(duì)應(yīng)黃褐毛忍冬主要成分及靶點(diǎn)，構(gòu)建“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型。此網(wǎng)絡(luò)綠色節(jié)點(diǎn)代表黃褐毛忍冬中的活性成分，黃色節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，紫色節(jié)點(diǎn)代表調(diào)控通路，邊代表三者之間的相互作用(圖4)。從富集通路的多少來(lái)看，較為重要的通路為PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Relaxin信號(hào)通路等，較為重要的靶點(diǎn)為AKT1、PIK3R1、PRKCA、絲裂原活化蛋白激酶10(MAPK10)、核內(nèi)原癌基因(JUN)、EGFR、NFKB1、糖原合成酶激酶3(GSK3B)、RELA、腫瘤壞死因子(TNF)、HRA、白介素6(IL-6)、磷酸酶C(PLCG1)、FOS、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NFKBIA)、VEGFA、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CREB1)、鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶2β(CAMK2B)、胰島素受體(INSR)和白介素-1B(IL-1B)等。AKT1富集到13個(gè)相關(guān)的通路，PIK3R1富集到13個(gè)相關(guān)的通路，PRKCA富集到10個(gè)相關(guān)的通路，MAPK10和JUN富集到9個(gè)相關(guān)的通路，EGFR、NFKB1、GSK3B和RELA富集到8個(gè)相關(guān)的通路，TNF和HRAS富集到7個(gè)相關(guān)通路，IL-6、PLCG1、FOS和NFKBIA富集到6個(gè)相關(guān)通路，VEGFA、CREB1、CAMK2B、INSR和IL-1B富集到5個(gè)相關(guān)通路。多條通路之間是通過(guò)共有靶點(diǎn)連接，表明各條通路之間可能協(xié)同作用于黃褐毛忍冬的預(yù)防急性肝損傷作用。

表2 黃褐毛忍冬作用靶點(diǎn)的KEGG富集分析

綠色三角形表示活性成分；黃色圓圈表示潛在靶點(diǎn)；紫色箭頭表示通路

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)黃褐毛忍冬水提物的化學(xué)成分進(jìn)行了定性研究，結(jié)果顯示黃褐毛忍冬提取物主要含有57種成分，其中24種化學(xué)成分可能被吸收，包括酚酸類，黃酮類、三萜皂苷類等。通過(guò)“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的搭建、拓?fù)鋮?shù)的分析及生物通路的信息挖掘?qū)S褐毛忍冬保肝的化學(xué)成分、潛在作用靶點(diǎn)及其分子機(jī)制進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示黃褐毛忍冬中隱綠原酸、木犀草苷、綠原酸、新綠原酸、山柰酚、槲皮苷、齊墩果酸、梔子苷、斷馬錢(qián)子苷半縮醛內(nèi)酯等可能作用于CA2、AKR1B1、CA1、CA9、VEGFA、IL-2、ERAP1、FGF1、FGF2、ALOX、ADORA1、CA4等靶點(diǎn)發(fā)揮保肝作用。

基于拓?fù)鋮?shù)分析，較為重要的化合物為山柰酚、槲皮苷、異槲皮苷、木犀草苷、梔子苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、齊墩果酸、奎尼酸、3-O-阿魏?？崴岬?。山柰酚能夠通過(guò)抑制JNK磷酸化，降低肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，保護(hù)線粒體功能，抵抗DNA斷裂誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到保護(hù)過(guò)量對(duì)乙酰氨基酚導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷[12]。異槲皮苷能夠通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制脂肪細(xì)胞分化[13]，調(diào)控AMPK信號(hào)通路改善肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝[14]。木犀草苷能夠減少非酒精性脂肪肝脂質(zhì)的沉積，減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)程度，提高脂聯(lián)素受體2的表達(dá)，對(duì)非酒精性脂肪肝具有較好的保護(hù)作用[15]。綠原酸能夠通過(guò)JNK途徑抑制非酒精性脂肪性肝病大鼠模型中的自噬和胰島素抵抗，減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷[16]。這些化學(xué)成分可能是黃褐毛忍冬預(yù)防急性肝損傷的關(guān)鍵成分。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)其化學(xué)成分-靶點(diǎn)相互關(guān)系進(jìn)行構(gòu)建，其保肝活性主要與CA1、CA2、CA4、CA9、AKR1B1、ERAP1、ALOX5、FGF1、FGF2、VEGFA、IL-2密切相關(guān)。肝癌組織中，下調(diào)CA1和CA2的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[17]。人醛氧化酶是活性氧產(chǎn)生的來(lái)源，其表達(dá)反映了機(jī)體產(chǎn)生活性氧的水平和決定了肝細(xì)胞對(duì)藥物的易感性，脂聯(lián)素可以下調(diào)醛氧化酶水平從而避免脂肪肝的形成[18]。FGF1是一種具有多種生理功能的代謝調(diào)節(jié)因子，能夠通過(guò)抑制氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，保護(hù)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷[19]。FGF2與創(chuàng)傷修復(fù)和細(xì)胞增殖密切相關(guān)，通過(guò)ERK1/2和JNK信號(hào)協(xié)同調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的有絲分裂[20]。

進(jìn)一步分析黃褐毛忍冬急性肝損傷靶點(diǎn)所涉及的信號(hào)通路，通路富集分析結(jié)果顯示主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路等。Hedgehog信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞的增殖和活化，并抑制細(xì)胞的凋亡，在損傷肝臟的再生修復(fù)進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[21]。Hippo信號(hào)通路能夠影響肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化、增殖和凋亡，進(jìn)而影響藥物及膽汁淤積引起的肝纖維化的發(fā)生[22]。在成熟的健康肝臟中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路途徑幾乎是無(wú)活性的，但在肝臟腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、肝臟炎癥、肝硬化、肝臟局灶性結(jié)節(jié)性增生等肝臟疾病的發(fā)生中扮演重要的角色[23-25]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠與Hippo/YAP信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路以及Notch信號(hào)通路等存在多位點(diǎn)的交叉聯(lián)系，在機(jī)體生理病理過(guò)程中的功能性關(guān)聯(lián)具有牽一發(fā)而動(dòng)全身的聯(lián)動(dòng)效應(yīng)[26]。黃褐毛忍冬作用于急性肝損傷是多靶點(diǎn)、多通路、多功能的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)機(jī)制，多條通路協(xié)同發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究基于UPLC-Q-TOF-MS分析技術(shù)對(duì)黃褐毛忍冬水提物中化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，并利用化學(xué)物質(zhì)組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步分析了黃褐毛忍冬預(yù)防急性肝損傷的主要化學(xué)成分，探討了其預(yù)防急性肝損傷可能的分子機(jī)制，為黃褐毛忍冬質(zhì)量標(biāo)志物的確定奠定了研究基礎(chǔ)。