徐莉莉，張軍，尚璐璐，丁慢玲，鄭金旭

(1. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 2. 江蘇大學(xué)附屬澳洋醫(yī)院呼吸科，江蘇 蘇州 215600)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是以嗜酸性、中性粒細(xì)胞炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的最常見的氣道疾病之一[1]。哮喘患者氣道中炎癥細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞可產(chǎn)生大量活性氧,機(jī)體有一定的抗氧化能力，但是當(dāng)活性氧過多時(shí)，造成氣道上皮、內(nèi)皮等結(jié)構(gòu)不同程度的損傷，進(jìn)而加重氣道炎癥，增加氣道高反應(yīng)性等[2-4]。組織核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)是一種氧化還原敏感的堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，參與多種抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究表明，激活Nrf2表達(dá)能減輕卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠的炎癥[5-6]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是半胱氨酸的乙?；苌铮黾蛹?xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量，中和氧化劑[7]。目前，NAC在肺部疾病中如慢性阻塞性肺疾病[8]、急性呼吸窘迫綜合征[9]、間質(zhì)性肺疾病[10]等的治療中發(fā)揮抗炎、抗氧化作用。但NAC對(duì)哮喘的作用及機(jī)制尚未有明確研究[11-12]。為此，本研究探討NAC對(duì)哮喘模型小鼠氣道炎癥和氧化應(yīng)激的影響及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性BALB/c小鼠18只，6～8周，體重18～22 g，購自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(蘇)202003784]。

1.1.2 主要試劑和儀器 OVA(Ⅴ級(jí)，美國Sigma公司)；氫氧化鋁凝膠(美國Pierce公司)；氮乙酰半胱氨酸泡騰片(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20150548，意大利Zambon S.p.A.公司)；丙二醛、谷胱甘肽試劑盒(南京建成生物工程研究所)；IL-13、IL-5、IFN-γ ELISA試劑盒(美國Proteintech公司)；PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；引物及內(nèi)參(GADPH)序列由金唯智公司設(shè)計(jì)合成，序列：HO-1上游5′-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3′，下游5′-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3′；Nrf2上游：5′-TAGATGACCATGAGTCGCTTGC-3′，下游5′-GCCAAACTTGCTCCATGTCC-3′；GAPDH上游5′-TGGATTTGGACGCATTGGTC-3′，下游5′-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3′；超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；PCR儀器(美國Thermo公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；HE染液試劑盒(武漢谷歌生物有限公司)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[13-14]建立哮喘模型。按隨機(jī)數(shù)字法將18只小鼠均分為對(duì)照組，哮喘組，N-乙酰半胱氨酸組，每組6只。致敏階段：第1天、第8天、第15天予哮喘組和N-乙酰半胱氨酸組每只小鼠腹腔注射致敏液0.2 mL(內(nèi)含100 μg OVA+2 mg氫氧化鋁凝膠+0.2 mL PBS)；激發(fā)：于第22天開始，每天予2.5% OVA霧化吸入45 min，連續(xù)1周。對(duì)照組均予PBS替代，N-乙酰半胱氨酸組在每次霧化前30 min予NAC(300 mg/kg)灌胃，對(duì)照組和哮喘組予等量PBS灌胃。

1.2.2 取材和檢測(cè)

1.2.2.1 ELISA法測(cè)定血清中相關(guān)細(xì)胞因子含量 1%戊巴比妥(10 mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠，待其活動(dòng)減弱后，眼球采血，置于EP管，每只約1 mL；冰上靜置3 h，分離血清；4 ℃，3 000 r/min離心10 min，按照說明書分別檢測(cè)IL-5、IL-13和IFN-γ含量。

1.2.2.2 BALF細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù) 采血處死后，將小鼠固定于手術(shù)板，頸部常規(guī)備皮、消毒，暴露氣管，“T”形切口，插管，夾緊氣管套管，0.8 mL預(yù)冷PBS注入肺，回抽并輕輕按摩肺部。重復(fù)3次，每次回收率>80%。4 ℃，1 500 r/min離心15 min；棄上清液，用1 mL PBS重懸，用血細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，瑞士染色分類計(jì)數(shù)，用光學(xué)顯微鏡計(jì)至少200個(gè)細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)分計(jì)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞。

1.2.2.3 肺組織樣本采集 肺泡灌洗結(jié)束后，每組小鼠均沿著頸部切口向下剪開胸部皮膚，逐層剝離肌肉和組織，暴露胸腔，取肺組織以備后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2.4 HE染色及炎癥評(píng)分 取左肺用4%中性多聚甲醛室溫固定48 h，中間換液一次；石蠟包埋、切片4 μm，溶蠟，二甲苯脫蠟，降級(jí)濃度梯度乙醇脫水，水洗；蘇木素染色3 min，水洗；分色、氨化，水洗；伊紅液染色2 min；乙醇脫水，二甲苯透明；中性樹脂封固、烤片。在高倍顯微鏡下觀察，使用Image Pro軟件采集圖片。炎癥評(píng)分細(xì)則根據(jù)文獻(xiàn)[15]如下，根據(jù)血管和支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行評(píng)分：0分，無炎癥細(xì)胞；1分，偶爾有炎癥細(xì)胞纏繞；2分，薄層(1～5)層炎癥細(xì)胞包圍；3分，炎癥細(xì)胞層厚>5層。

1.2.2.5 肺組織丙二醛和谷胱甘肽測(cè)定 取右肺組織，超聲勻漿機(jī)研磨，4 ℃，4 000 r/min離心15 min；取上清液，按照說明書檢測(cè)丙二醛、谷胱甘肽含量。

1.2.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá) 超聲勻漿機(jī)研磨肺組織，用Trizol提取總RNA，按說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系：引物混合液2 μL、dNTP混合液 4 μL、二硫蘇糖醇2 μL、RNA模板4 μL、 緩沖液4 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL和無酶水 3 μL。PCR反轉(zhuǎn)錄儀上進(jìn)行孵育，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，-20 ℃保存。以cDNA為模板，配制熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR GreenⅠ預(yù)混液10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、DNA模板2 μL和無酶水6.4 μL，共20 μL。PCR條件：95 ℃反應(yīng)10 min；95 ℃反應(yīng)15 s；60 ℃反應(yīng)60 s；40個(gè)循環(huán)，計(jì)算2-ΔΔCt值分析相關(guān)mRNA表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清炎癥因子的比較

與對(duì)照組相比，哮喘組血清細(xì)胞因子IL-5、IL-13含量顯著增加(t=5.090，12.443，P<0.05)，IFN-γ含量明顯降低(t=-10.344，P<0.05)。與哮喘組相比，N-乙酰半胱氨酸組中血清細(xì)胞因子IL-5、IL-13含量明顯降低(t=-4.568，-12.981，P均<0.05)，IFN-γ含量明顯增加(t=14.109，P<0.05)。見圖1。

a：P<0.05，與對(duì)照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

2.2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)比較

如圖2所示，與對(duì)照組相比，哮喘組白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)顯著增加(t=10.491，39.099，12.323，P均<0.05)；與哮喘組相比，N-乙酰半胱氨酸組白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.658，-19.704，-5.154，P均<0.05)。

a：P<0.05，與對(duì)照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

2.3 各組小鼠肺組織炎癥的比較

肺組織HE染色顯示，對(duì)照組肺泡及氣道結(jié)構(gòu)規(guī)整，管腔無狹窄，偶有少量炎癥細(xì)胞。哮喘組肺組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，管腔狹窄，炎癥滲出明顯，血管周圍水腫；N-乙酰半胱氨酸組炎癥和肺組織損傷程度較哮喘組減輕。3組中哮喘組小鼠評(píng)分最高，哮喘組評(píng)分明顯高于對(duì)照組(t=7.675，P<0.05)，N-乙酰半胱氨酸組評(píng)分明顯低于哮喘組(t=-8.935，P<0.05)。見圖3。

a：P<0.05，與對(duì)照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

2.4 各組小鼠肺組織中丙二醛和谷胱甘肽含量的比較

與對(duì)照組比較，哮喘組肺組織中丙二醛含量明顯升高，谷胱甘肽含量明顯降低 (t=7.974，-4.850，P均<0.05)；與哮喘組比較，N-乙酰半胱氨酸組中丙二醛含量明顯降低，而谷胱甘肽含量明顯升高(t=-6.709，5.772，P均<0. 05)。見圖4。

a：P<0.05，與對(duì)照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

2.5 各組小鼠肺組織HO-1 mRNA和Nrf2 mRNA表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，哮喘組小鼠肺組織中Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；與哮喘組相比，N-乙酰半胱氨酸組肺組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)明顯升高(P均<0.05)。見圖5。

a：P<0.05，與對(duì)照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

3 討論

哮喘動(dòng)物模型是研究抗哮喘藥物及探究其發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵步驟，以O(shè)VA誘導(dǎo)哮喘小鼠模型，具備與人哮喘相似的臨床癥狀和病理表現(xiàn)，是構(gòu)建哮喘的理想模型[14]。本實(shí)驗(yàn)采用OVA誘導(dǎo)，成功構(gòu)建哮喘模型小鼠，并將NAC作為干預(yù)藥物，研究結(jié)果顯示NAC具有抗哮喘作用。

嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是哮喘重要的效應(yīng)細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞在炎癥部位釋放的顆粒蛋白刺激黏液生成，引起組織水腫和氣道阻塞，釋放各種細(xì)胞因子和趨化因子，加重炎癥[16]。中性粒細(xì)胞可以分泌多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氣道重塑[17]。哮喘與Th1/Th2細(xì)胞失衡及其特有的細(xì)胞因子譜密切相關(guān)[18]。本研究顯示，相對(duì)于對(duì)照組，OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠炎癥細(xì)胞數(shù)、IL-5、IL-13水平顯著增加，IFN-γ水平顯著降低，肺組織HE染色顯示氣道周圍有大量炎性細(xì)胞、結(jié)構(gòu)紊亂、破壞。NAC的干預(yù)明顯減少炎癥細(xì)胞數(shù)量，降低Th2細(xì)胞因子水平，增加Th1細(xì)胞因子水平，減輕上述氣道病理損傷表現(xiàn)，且炎癥評(píng)分明顯降低。由此推測(cè)，NAC能緩解哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)。

丙二醛是脂質(zhì)過氧化中最豐富的活性醛，是細(xì)胞損傷的重要信號(hào)分子，作為細(xì)胞和組織氧化應(yīng)激的指標(biāo)[19]。谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)主要的硫醇抗氧化劑，是活性氧清除劑，在維持上皮完整性方面起著重要作用[20]。在本研究中，NAC顯著抑制OVA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，NAC組小鼠肺組織中丙二醛含量減少，谷胱甘肽含量升高，提示NAC通過抗氧化反應(yīng)對(duì)OVA誘導(dǎo)的哮喘有保護(hù)作用。

Nrf2/HO-1信號(hào)通路軸在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[5,21]。為進(jìn)一步研究NAC保護(hù)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究NAC對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響。結(jié)果表明N-乙酰半胱氨酸組Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)明顯升高。由此推測(cè)NAC可能通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路起抗哮喘作用，這與Sussan等[22]研究顯示的激活Nrf2表達(dá)能降低哮喘易感性觀點(diǎn)一致。