周新童，任天宇，黨勝春

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

胃癌的發(fā)生發(fā)展復(fù)雜，涉及多個(gè)癌基因和信號分子[1-3]。長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA，LncRNA)是一種長度超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本[4]，本身并不參與蛋白質(zhì)編碼，其在肝癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[5]。LncRNA AL139147.1位于染色體1p31.3，長度為1 156 bp。目前，關(guān)于AL137147.1在胃癌中的表達(dá)及其對腫瘤生理過程的影響尚不清楚。近幾年來，學(xué)者多利用公共數(shù)據(jù)庫來獲得大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行研究[6]。因此，本研究擬通過生物信息學(xué)方法，分析AL139147.1在胃癌中表達(dá)；并通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾，沉默胃癌MKN-45細(xì)胞株中的AL139147.1表達(dá)，研究其對細(xì)胞增殖和生長周期的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN-45、HGC-27以及正常人胃上皮GES-1細(xì)胞均購于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所。RPMI 1640(美國Invitrogen公司)；10%胎牛血清(美國Gibco公司)；轉(zhuǎn)染試劑聚凝胺(上海吉?jiǎng)P公司)；Trizol試劑(上海普飛生物公司)；逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)；DEPC(北京博奧拓達(dá)科技)；RNA 6000納米試劑盒(美國安捷倫公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)； MTT及二甲基亞砜(上海試一化學(xué)試劑公司)；Annexin V及碘化丙啶(北京夏思生物科技)。

AL139147.1及內(nèi)參GAPDH引物由上海生工公司設(shè)計(jì)，AL139147.1上游引物：5′-TAGGTAATACCATTCGGGACA-3′，下游引物5′-CCATTCTGTAGGT TGCCTGTT-3′；GAPDH上游引物：5′-TGACTTCAACAG CGACACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。AL139147.1 3個(gè)不同的目標(biāo)短發(fā)夾RNA(shRNA)序列如下，shRNA#1：TCTACCAATGTGATGCGAA；shRNA#2：GCCCTCATTGCCAAGACAA；shRNA#3：GGTGGACCAGATGACCTTA；以及陰性對照序列(TTCTCCGAACGTGTCACGT)均由上海吉?jiǎng)P基因有限公司設(shè)計(jì)。慢病毒載體GV493和病毒包裝的質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因有限公司，并經(jīng)測序證實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)篩選 胃癌轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)TCGA-STAD-HT-Seq來自https:∥portal.gdc.cancer. gov癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA) ，共獲得407個(gè)樣本，其中胃癌組織375例，癌旁對照組織32例，同時(shí)下載胃癌臨床樣本文件TCGA-STAD，共計(jì)443例樣本信息。行預(yù)后分析以及用臨床資料來進(jìn)行相關(guān)性分析時(shí)，將胃癌患者的測序數(shù)據(jù)與臨床信息合并，共剩下375例。健康者胃黏膜組織測序數(shù)據(jù)來自https:∥gtexportal.org基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Genotype-Tissue Expression,GTEx)，共獲得194個(gè)樣本。首先采用edgeR包對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，之后通過sva包的combat函數(shù)實(shí)現(xiàn)批次校正，最后提取出375例胃癌組織、32例癌旁對照組織及194例正常胃黏膜組織中的AL139147.1表達(dá)用于后續(xù)研究。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞均培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，其中含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/L)，并保持37 ℃室溫和5% CO2濃度。

1.2.2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將AL139147.1的3個(gè)目標(biāo)shRNA序列以及陰性對照序列克隆至GV493載體中，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。隨后取對數(shù)生長期的MKN-45細(xì)胞，分為空白對照組、陰性對照組、shRNA干擾組(shRNA#1組、shRNA#2組、shRNA#3組)，接種于含無血清培養(yǎng)基的6孔板中，并維持5×105個(gè)/孔密度；當(dāng)融合度達(dá)70 %時(shí)，通過聚凝胺將4 μL慢病毒空載體、攜帶陰性對照序列或目標(biāo)shRNA序列的載體分別轉(zhuǎn)染入各組細(xì)胞；培養(yǎng)16 h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至完全培養(yǎng)基中，通過qRT-PCR檢測AL139147.1相對表達(dá)量，從3個(gè)shRNA干擾組中選出AL139147.1表達(dá)降低最顯著者用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.3 qRT-PCR檢測各細(xì)胞株中AL139147.1相對表達(dá)量 收集胃癌AGS、MKN-45、HGC-27細(xì)胞系以及正常人胃上皮GES-1細(xì)胞，以及“1.2.2.2”中各分組細(xì)胞；加入Trizol試劑、氯仿，離心分離上層清液；加入異丙醇沉淀RNA；用75 %乙醇漂洗2次；完全溶解于不含RNA酶的水中。用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測定RNA濃度和D(260 nm)、D(280 nm)值。用RNA 6000納米試劑盒檢驗(yàn)RNA質(zhì)量。用寡核苷酸引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)體系12 μL，其中綠色熒光混合物6 μL，上游引物和下游引物各0.15 μL，cDNA模版2 μL，雙蒸水5.1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃熱啟動(dòng)3 min，95 ℃變性10 min，56 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)部參照，用公式2-ΔΔCt計(jì)算AL139147.1相對表達(dá)。

1.2.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取“1.2.2.2”中MKN-45細(xì)胞，設(shè)shRNA#3組、陰性對照組和空白對照組，接種于96孔板，細(xì)胞密度5×103個(gè)/孔，孵育1～5 d。加入10 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h；每組細(xì)胞加入150 μL二甲基亞砜，孵育10 min；用酶標(biāo)儀測量490 nm波長處光密度(D)值，繪制生長曲線，即可間接反映細(xì)胞增殖情況。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞分組同“1.2.2.4”，用胰蛋白酶處理，PBS洗2次；并依次加入500 μL Annexin V結(jié)合緩沖液以及5 μL碘化丙啶；混合均勻后避光孵育約10 min；用流式細(xì)胞儀分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例；每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AL139147.1在胃癌中呈高表達(dá)且與患者預(yù)后有關(guān)

數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，與癌旁對照組織和正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中AL139147.1表達(dá)明顯升高(Z=8.397，4.420，P均<0.05)，癌旁組織和正常胃黏膜組織之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.422，P=0.671)。見圖1。生存分析顯示，AL139147.1高表達(dá)患者總體生存和無病生存期均短于AL139147.1低表達(dá)者(P均<0.05)。見圖2。

圖1 AL139147.1在胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)

圖2 AL139147.1表達(dá)與患者總體生存時(shí)間及無病生存時(shí)間的關(guān)系

2.2 AL139147.1表達(dá)與臨床病理特征間相關(guān)性

結(jié)果顯示，AL139147.1表達(dá)與T分期、TNM分期以及腫瘤分化程度相關(guān)(P均<0.01)，而與年齡、性別、腫瘤部位、胃癌家族史、N分期及M分期無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。見表1。

2.3 AL139147.1在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，AGS、MKN-45癌細(xì)胞株中AL139147.1表達(dá)水平顯著高于正常胃上皮GES-1細(xì)胞株(t=10.533和6.659，P均<0.05)，其中MKN-45細(xì)胞更為明顯，而HGC-27細(xì)胞表達(dá)與GES-1細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.328，P>0.05)。因此，選擇MKN-45細(xì)胞用于構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)AL139147.1的細(xì)胞模型。

表1 胃癌患者AL139147.1表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染shRNA#3序列后，MKN-45細(xì)胞中AL139147.1表達(dá)水平顯著降低(t=5.156，P<0.01)，轉(zhuǎn)染shRNA#1、shRNA#2序列后AL139147.1表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。因此，選擇shRNA#3序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖3。

2.4 AL139147.1沉默減緩胃癌細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組相比，shRNA#3組在培養(yǎng)了2、3、4、5 d光密度均顯著降低(P均<0.05)，而培養(yǎng)1 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1. 348和1.362，P均>0.05)。由此表明MKN-45細(xì)胞增殖在AL139147.1沉默后明顯減慢。見圖4。

圖3 qRT-PCR檢測AL139147.1表達(dá)

a：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)空白對照組比較；b：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)陰性對照組比較

2.5 AL139147.1沉默致細(xì)胞周期停滯于G2/M期

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，各組G0/G1期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.049，P>0.05)，S期(F=39.943，P<0.01)和G2/M期(F=100.094，P<0.01)細(xì)胞間均有顯著差異。其中，與空白對照組和陰性對照組相比，shRNA#3組中S期細(xì)胞比例均顯著降低(t=9.181和6.771，P均<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例均顯著增加(t=20.333和9.255，P均<0.05)；空白對照組和陰性對照組S期、G2/M期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

由此表明，AL139147.1表達(dá)沉默導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2/M期，從而影響胃癌細(xì)胞生長。見圖5。

3 討論

本研究通過TCGA和GTEx，分析AL139147.1在胃癌組織、癌旁對照組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在胃癌中呈高表達(dá)；生存分析顯示 AL139147.1表達(dá)較高患者生存時(shí)間更短，提示AL139147.1促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展，對患者預(yù)后判斷具有一定價(jià)值。由于高通量測序數(shù)據(jù)具有一定的誤差及背景噪音[7]，本研究雖然在分析前已對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及批次校正，但結(jié)果仍需要更進(jìn)一步驗(yàn)證。

a：P<0.05，與空白對照組比較；b：P<0.05，與陰性對照組比較

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AL139147.1表達(dá)與T分期有關(guān)，提示AL139147.1可能影響腫瘤的生長。目前TNM分期已被視為胃癌患者生存的重要預(yù)測指標(biāo)[8]。與Ⅰ期和Ⅱ期相比，Ⅲ期和Ⅳ期胃癌患者表現(xiàn)出較高的局部復(fù)發(fā)率和較差的生存結(jié)果，提示AL139147.1表達(dá)對判斷胃癌的具體臨床分期有一定的指導(dǎo)作用。AL139147.1表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)，提示其可能影響腫瘤的分化及病理分型。有研究顯示，胃癌分化程度雖然與胃癌患者預(yù)后無關(guān)，但與T分期和TNM分期顯著相關(guān)[9]。因此，AL139147.1表達(dá)可能僅與T分期、TNM分期及腫瘤分化程度中的一個(gè)或兩個(gè)參數(shù)直接相關(guān)，而與剩余因素只是間接相關(guān)，需要進(jìn)一步分析。

qRT-PCR通過對樣本中的微量核酸進(jìn)行指數(shù)倍擴(kuò)增，極大提高檢測靈敏度，對LncRNA研究具有重要價(jià)值[10]。本研究通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，胃癌AGS、MKN-45細(xì)胞中AL139147.1表達(dá)顯著高于正常胃上皮GES-1細(xì)胞，而HGC-27細(xì)胞中表達(dá)高于GES-1細(xì)胞，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示AL139147.1并非在所有胃癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)。

近幾年來，很多研究表明LncRNA在癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期等生物學(xué)過程中起重要作用[6,11-12]。本研究結(jié)果顯示，AL139147.1能夠減緩胃癌MKN-45細(xì)胞增殖，并使其細(xì)胞周期停滯在G2/M期。由此推斷，AL139147.1通過調(diào)控細(xì)胞分裂的G2/M期，從而影響胃癌細(xì)胞生長。此作用在其他胃癌細(xì)胞及實(shí)體腫瘤上是否同樣存在，尚需后續(xù)驗(yàn)證。

綜上所述，AL139147.1在胃癌中呈高表達(dá)，對胃癌臨床分期、病理分級以及預(yù)后判斷具有一定的價(jià)值，其表達(dá)沉默可以抑制胃癌MKN-45細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期停滯在G2/M期。