吳禹濛 , 袁 震 , 姜潔明 , 張 磊 , 任星月 姚安琪 宋昌斌,閆紅偉 , 劉 鷹 ,

(1. 大連海洋大學(xué), 遼寧 大連 116023; 2. 設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023; 3. 中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體研究所, 北京 100083; 4. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237)

光照是影響魚類生長(zhǎng)發(fā)育中的重要因素, 它對(duì)魚類攝食、生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等都有一定影響[1-2]。光照的三要素為光照強(qiáng)度、光譜和光周期[3]。不同魚類和魚類發(fā)育的不同階段對(duì)光照強(qiáng)度的需求均存在差異, 如 Vander 等[4]研究了光照強(qiáng)度對(duì)大西洋鱈(Gadus morhua)生長(zhǎng)的影響, 結(jié)果顯示高光照強(qiáng)度下大西洋鱈生長(zhǎng)更快、存活率更高。謝從新等[5]也發(fā)現(xiàn)隨著光照強(qiáng)度的增大, 烏鱧(Channa argus)幼魚的攝食強(qiáng)度逐漸減小。一般認(rèn)為, 大多數(shù)海水魚靠視覺進(jìn)行攝食, 無論其與食物的距離長(zhǎng)短, 視覺在捕食過程中均非常關(guān)鍵, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中與魚類視覺系統(tǒng)匹配的照明條件可以增加其對(duì)餌料的辨識(shí)度, 縮短搜索食物時(shí)間并最終促進(jìn)生長(zhǎng)和提高存活率[6-7]。研究證實(shí), 光照強(qiáng)度對(duì)不同魚類的影響具有差異[8-9], 光照強(qiáng)度過低或過高, 會(huì)影響魚類的攝食行為, 從而對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生脅迫[10-13]。有研究表明光照強(qiáng)度會(huì)影響魚類的視覺系統(tǒng), 將白化斑馬魚(Danio rerio)和白化虹鱒(Oncorhynchus mykiss)飼養(yǎng)在連續(xù)強(qiáng)光照射條件下, 發(fā)現(xiàn)其視網(wǎng)膜受到光損傷, 主要表現(xiàn)為感光層細(xì)胞的凋亡[14]。即使是對(duì)外界光脅迫抵抗能力較高的體色正常的魚類, 如歐洲舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)、大西洋鱈和大西洋鮭(Salmo salar), 24 h 持續(xù)照明條件下, 它們視網(wǎng)膜的感光層會(huì)變薄[15]。因此,魚類在過高的光照強(qiáng)度下, 其視覺會(huì)受到損害, 進(jìn)而有可能影響其攝食行為和生長(zhǎng)。

在前人的研究中發(fā)現(xiàn), 在藍(lán)光照射下, 金魚(Carassius auratus)的TUNEL 測(cè)定結(jié)果顯示, 視網(wǎng)膜有大量的細(xì)胞凋亡, 另外黑色素濃縮激素(melanin concentration hormone, MCH) 和半胱天冬酶-3(caspase-3)基因表達(dá)上調(diào), MCH-R mRNA 的表達(dá)隨著藍(lán)光暴露和強(qiáng)度的增加而顯著增加, 增加視網(wǎng)膜黑色素聚集, caspase-3 是廣泛用于細(xì)胞凋亡的指標(biāo),是細(xì)胞凋亡的核心作用酶, 以上兩個(gè)基因上調(diào)表明藍(lán)光照射下會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜造成損傷, 這與TUNEL 測(cè)定結(jié)果相符[16]。而在另一項(xiàng)關(guān)于金魚的研究表明, 在綠光處理下更有利于維持視網(wǎng)膜的穩(wěn)定, 增強(qiáng)視網(wǎng)膜細(xì)胞的再生[17]。但光照強(qiáng)度對(duì)魚類視網(wǎng)膜內(nèi)基因表達(dá)的影響還未見報(bào)道。

歐洲舌齒鱸, 或稱舌齒鱸、狼鱸, 隸屬鱸形目(Perciformes) 、 狼 鱸 科(Moronidae) 、 舌 齒 鱸 屬(Dicentrarchus)[18], 歐洲舌齒鱸的含肉率高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、抗病力強(qiáng)、適宜池塘和工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖[19],是歐洲商業(yè)化養(yǎng)殖的第一個(gè)非鮭科海水魚類, 是歐洲和地中海區(qū)域水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的重要經(jīng)濟(jì)魚類[20]。2010 年, 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所劉鷹研究員率先于2010 年將其引種到我國(guó)進(jìn)行人工養(yǎng)殖, 并于2014 年突破其苗種繁育技術(shù)[21]。為探究光照強(qiáng)度是否會(huì)影響歐洲舌齒鱸稚魚的視覺系統(tǒng), 本研究以孵化后30 d 的歐洲舌齒鱸作為研究對(duì)象, 在白光2.0 W/m2(W 2.0)、1.0 W/m2(W 1.0)和0.3 W/m2(W 0.3)條件下對(duì)其進(jìn)行為期66 d 的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較了3 組稚魚的體長(zhǎng)、濕重和存活率, 根據(jù)結(jié)果構(gòu)建了W 2.0 和W 0.3 兩組稚魚眼組織的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)并進(jìn)行了高通量測(cè)序, 以期為查明光照強(qiáng)度對(duì)魚類生長(zhǎng)和視覺的影響機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 并為養(yǎng)殖生產(chǎn)者提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用歐洲舌齒鱸(孵化后30 d, 體長(zhǎng)12.52±1.34 mm, 濕重92.35±4.77 mg)由大連富谷水產(chǎn)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 養(yǎng)殖與光處理

首先將上述歐洲舌齒鱸稚魚隨機(jī)放置到 9 個(gè)100 L 圓柱形桶(桶高62 cm)中, 每桶養(yǎng)殖密度為700 尾, 養(yǎng)殖周期為66 d。根據(jù)魚類生長(zhǎng)情況投喂鹵蟲無節(jié)幼體(孵化后第30 至40 d)和鹵蟲成體(孵化后第41 至96 d), 每天投喂6～8 次, 每次飽食投喂,投喂前均使用強(qiáng)化劑(50 DE 微囊, 山東省升索漁用飼料研究中心)強(qiáng)化鹵蟲無節(jié)幼體。每天各養(yǎng)殖水桶統(tǒng)一換水?dāng)?shù)次, 并清潔養(yǎng)殖容器, 去除殘餌糞便與死亡幼體。保持各養(yǎng)殖水桶中鹽度為 33, 溫度為18.5～19.5℃溶氧為8 mg/L 以上, pH 7.9～8.1, NH4-N <0.2 mg/L, NO2-N < 0.05 mg/L。

本實(shí)驗(yàn)采用人工LED 光源(深圳市超頻三科技股份有限公司)照明, 共設(shè)置3 種不同的光照處理組(3種光照強(qiáng)度)來開展養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn), 包括0.3 W/m2、1.0 W/m2和2.0 W/m2的白光(表示為: W 0.3, W 1.0, W 2.0)。由可調(diào)節(jié)光強(qiáng)的3 盞LED 燈提供光照, 每個(gè)光照處理組設(shè)置3 個(gè)養(yǎng)殖平行(共在9 個(gè)養(yǎng)殖水桶中開展實(shí)驗(yàn))。采用不透光的灰色幕布將2 個(gè)處理組進(jìn)行隔離并防止外界光線的影響, 且每天使用光譜輻射分析儀(PLA-20, 杭州遠(yuǎn)方光電信息股份有限公司)在水面上進(jìn)行測(cè)試一次, 確保實(shí)驗(yàn)期間光環(huán)境的穩(wěn)定。

1.2.2 生長(zhǎng)數(shù)據(jù)計(jì)算

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)隨機(jī)每組選取20 尾稚魚, 冰上低溫麻醉后, 測(cè)定其體長(zhǎng)和濕重。每天計(jì)數(shù)表面和底部死亡魚的個(gè)數(shù), 存活率的測(cè)定參考Yan 等的研究[22]。

1.2.3 RNA 提取

根據(jù)生長(zhǎng)數(shù)據(jù)結(jié)果, 為保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性,另取W 0.3 和W 2.0 組的稚魚麻醉(20 尾/桶), 于低溫條件下分離眼組織, 放入裝有RNA later 的離心管中,之后在–80℃超低溫冰箱中進(jìn)行保存。眼組織的總RNA 的提取采用RNeasy Mini Kit 試劑盒(Qiagen, 德國(guó)), 根據(jù)說明書操作。采用Agilent 2100 生物分析儀和Nanodrop ND-1000 分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的質(zhì)量和濃度。

1.2.4 基因文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組分析

樣品檢測(cè)合格后, 將之前提取的總RNA 等量混合, 送樣至北京諾禾致源生物有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)(reads)作為原始數(shù)據(jù)(raw data),將帶接頭的、低質(zhì)量的reads 過濾除去進(jìn)而得到高質(zhì)量可用數(shù)據(jù)(clean reads)。利用組裝軟件Trinity 對(duì)獲得的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列組裝。

通過BLASTX 將轉(zhuǎn)錄本與NCBI、SwissProt、KEGG、GO、COG、KOG、EggNOG、Pfam9 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。利用Blast2 GO 軟件進(jìn)行基因本體(GO)注釋, 并使用TopGo 進(jìn)行富集分析。序列也進(jìn)一步與COG 和EggNOG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 并對(duì)基因序列進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和功能分類。利用 Perl script 進(jìn)行KEGG 通路的富集對(duì)基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的功能及其代謝途徑進(jìn)行系統(tǒng)分析。通過在線KEGG 自動(dòng)注釋服務(wù)(KAAS), 可以得到的每條序列的京都基因與基因組同源體系分析(KO)注釋, 并映射到相應(yīng)的KEGG 通路中。

1.2.5 差異表達(dá)基因的鑒定

利用FPKM 值表示對(duì)應(yīng)非重復(fù)序列基因(unigene)的表達(dá)豐度。FPKM 計(jì)算公式如下:

每一百萬個(gè)map 上的reads 中map 到外顯子的每1K 堿基上的Fragments 個(gè)數(shù)(FPKM)=cDNA 片段(cDNA fragments)/圖譜片段(百萬)[mapped fragments(millions)]/轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度[transcript lengths (kb)]。

篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate, FDR)≤0.01 和差異倍數(shù)(log2fold change, FC)>1。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的正確性, 采用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)晶狀體纖維主要固有蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白3、維生素A 脫氫異構(gòu)酶、熱休克同源70、伸長(zhǎng)因子1-α 和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶6 個(gè)基因的表達(dá)。引物使用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)。以提取的眼組織的 RNA 為模板, 按照 SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)試劑盒說明書合成cDNA,然后以其為模板, 以β-actin 為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增(Applied Biosystems 7900 HT Real-TimePCR儀)。PCR 條件為: 95℃, 5 min; 95℃, 3 s 和60℃, 20 s共40 個(gè)循環(huán)[23]。

表1 引物序列Tab. 1 Sequences of the primers used for PCR amplification of differentially expressed genes in Dicentrarchus labrax

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)以2–ΔΔCT法處理。采用統(tǒng)計(jì)軟件IBM SPSS 22.0(IBM, Armonk, NY, 美國(guó))中的t檢驗(yàn)分析眼內(nèi)的基因表達(dá)的顯著性差異, 使用Duncan 檢驗(yàn)兩個(gè)不同光照組之間稚魚體長(zhǎng)、濕重和存活率, 顯著性設(shè)定為P<0.05 和P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 不同光強(qiáng)的白光對(duì)歐洲舌齒鱸稚魚生長(zhǎng)的影響

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), W 2.0 組稚魚的體長(zhǎng)和濕重顯著小于W 0.3 和W 1.0 處理組下飼養(yǎng)的稚魚(P< 0.05),但三組歐洲舌齒鱸稚魚的存活率無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝

經(jīng)Illumina Hiseq 2500 測(cè)序, W 0.3 處理組獲得raw reads(統(tǒng)計(jì)原始序列數(shù)據(jù)) 50 907 730 個(gè), W 2.0處理組獲得raw reads 50 265 736 個(gè); W 0.3 處理組獲得clean reads 50 273 392 個(gè), W 2.0 處理組獲得clean reads 49 277 200 個(gè); W 0.3 處理組獲得clean bases(測(cè)序序列的個(gè)數(shù)乘以測(cè)序序列的長(zhǎng)度) 7.54 GB, W 2.0處理組獲得clean bases 7.39 GB。

圖1 W 0.3、W 1.0 與W 2.0 組歐洲舌齒鱸稚魚的濕重、體長(zhǎng)和存活率Fig. 1 Wet weight, body length, and survival rate of Dicentrarchus labrax juveniles in the W 0.3, W 1.0, and W 2.0 groups

2.3 差異表達(dá)基因篩選及其功能富集分析

根據(jù)兩個(gè)RNA 樣本基因的差異表達(dá)豐度來做差異表達(dá)分析。如圖2 所示, 共得到的差異表達(dá)基因有368 個(gè), 與W 0.3 組相比, W 2.0 組中234 個(gè)基因上調(diào)表達(dá), 134 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖2)。

圖2 W 0.3 與W 2.0 組歐洲舌齒鱸稚魚眼內(nèi)差異表達(dá)基因的火山圖Fig. 2 Volcano plot of differentially expressed genes in the eye of D. labrax between the W 0.3 and W 2.0 groups

在篩選得到的差異表達(dá)基因中, 晶狀體纖維主要固有樣蛋白(MIP),晶狀體纖維膜固有蛋白(lens fiber membrane intrinsic protein), 晶狀體纖維膜固有蛋白(lens fiber membrane intrinsic protein), 晶狀體纖維膜固有蛋白樣亞型X1(lens fiber membrane intrinsic protein-like isoform X1)等, rho 相關(guān)的btb 結(jié)構(gòu)域, 包含蛋白 2 樣亞型 X1(rho-related BTB domain-containing protein 2-like isoform X1), 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1(insulin-like growth factor-binding protein 1), 維生素A 脫氫異構(gòu)酶(RPE65)等均在W 2.0 組出現(xiàn)了上調(diào)(表2)。

對(duì)得到的368 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 分析發(fā)現(xiàn), 差異表達(dá)基因主要富集在分子功能(MF)和生物學(xué)功能(BP)上。其中在MF 上差異表達(dá)基因主要分布在細(xì)胞黏附(cell adhesion)、生物黏附(biological adhesion)、磷酸化(phosphorylation)等通路上。而在BP上差異表達(dá)基因主要分布在葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶激(glucose-6-phosphate isomerase activation)、分子內(nèi)氧化還原酶(intramolecular oxidoreductase), 且分布較少(圖3)。

表2 W 0.3 與W 2.0 組歐洲舌齒鱸眼內(nèi)代表性的差異表達(dá)基因Tab. 2 Differentially expressed genes in the eye of D. labrax between the W 0.3 and W 2.0 groups

續(xù)表

圖3 W 0.3 與W 2.0 組歐洲舌齒鱸眼內(nèi)差異表達(dá)基因的GO 富集分析Fig. 3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in the eye of D. labrax between the W 0.3 and W 2.0 groups

KEGG富集分析結(jié)果如圖4所示, 差異基因富集在碳代謝(carbon metabolism), 乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism), RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(RNA transport), 氧化磷酸化(oxidative phosphorylation), 三羧酸循環(huán) TCA 循環(huán)(citrate cycle TCA cycle), 淀粉和蔗糖的代謝(starch and sucrose metabolism), 軍團(tuán)桿菌病(legionellosis), 磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)等20 個(gè)通路上。在這些通路中, RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體、氧化磷酸化和碳代謝上差異表達(dá)基因的分布相對(duì)較多。

2.4 qPCR 結(jié)果

對(duì)得到的6 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證, 結(jié)果顯示在W 2.0 組稚魚眼內(nèi)MIP、HSC70、 RBP3、RPE65、EF1A 和GPI 基因的表達(dá)都顯著高于W 0.3 組稚魚(P<0.05, 圖5), 這與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

3 討論

圖4 W 0.3 與W 2.0 組歐洲舌齒鱸眼內(nèi)差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析Fig. 4 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in the eye of D. labrax between the W 0.3 and W 2.0 groups

圖5 W 0.3 與W 2.0 組歐洲舌齒鱸眼內(nèi)6 個(gè)基因表達(dá)Fig. 5 Expression of six genes in the eye of D. labrax between the W 0.3 and W 2.0 groups

許多海洋魚類靠視覺覓食, 并且需要一個(gè)最低光照強(qiáng)度閾值; 但是對(duì)高光強(qiáng)影響稚魚視覺, 進(jìn)而影響其攝食和生長(zhǎng), 目前關(guān)于這方面的認(rèn)識(shí)仍然不足。前人的研究主要集中在光照條件對(duì)眼睛, 尤其是視網(wǎng)膜的組織學(xué)上的觀察, 而對(duì)眼內(nèi)基因的相關(guān)性表達(dá)產(chǎn)生的影響的報(bào)道少之又少。Bayarri 等人研究發(fā)現(xiàn)影響歐洲舌齒鱸眼睛視網(wǎng)膜敏感性光閾值為0.06 W/m2[24], Villamizar 等人設(shè)置光照強(qiáng)度為0.42 W/m2,使歐洲舌齒鱸眼睛和血漿中褪黑激素含量產(chǎn)生變化[25]。在本研究中, 我們的研究任務(wù)是查明當(dāng)光照強(qiáng)度增加時(shí), 歐洲舌齒鱸稚魚的生長(zhǎng)、存活和視覺是否受到影響。因此我們將稚魚分別暴露于0.3 W/m2、1.0 W/m2和2.0 W/m2這3 個(gè)光照強(qiáng)度下, 形成3 個(gè)處理組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 在光照強(qiáng)度為2.0 W/m2下飼養(yǎng)的稚魚的平均體長(zhǎng)、濕重均顯著小于1.0 或0.3 W/m2下飼養(yǎng)的稚魚(P<0.05), 而1.0 和0.3 W/m2光照強(qiáng)度下飼養(yǎng)的稚魚平均體長(zhǎng)無顯著差異(P>0.05), 3 個(gè)處理組之間的存活率無顯著性差異(P>0.05)。前人研究證明, 漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)暴露于100 lx的光照強(qiáng)度以下時(shí)生長(zhǎng)和存活率都有所降低[26]。金頭鯛(Sparus aurata)在中等強(qiáng)度下生長(zhǎng)較好, 可能是由于這種光強(qiáng)下會(huì)刺激視網(wǎng)膜上的色素, 增加其辨別獵物的能力[27]。加州鱸魚(yellow perch)的反應(yīng)距離,隨著光強(qiáng)的降低而逐漸降低, 當(dāng)光強(qiáng)度下降到小于2 lx 時(shí), 最大平均反應(yīng)距離顯著下降, 在黑暗中最小反應(yīng)距離減小[28]。另在禽類中, 光照強(qiáng)度在1～65 lx,對(duì)雞的生長(zhǎng)沒有影響, 而在130～290 lx 的光照下會(huì)抑制雞的生長(zhǎng)[29]。由此可見, 因不同物種的生活環(huán)境不同, 其對(duì)光強(qiáng)的適應(yīng)范圍各有不同, 過低或者是過高的光強(qiáng)都會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。因此, 在養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 了解魚類生長(zhǎng)所需的合理光照強(qiáng)度至關(guān)重要。

一般認(rèn)為大部分海水魚是通過視覺來攝食, 在W 2.0 組稚魚的生長(zhǎng)較差, 可能是因?yàn)?.0 W/m2對(duì)魚類來說屬于高光強(qiáng), 高光強(qiáng)可能會(huì)影響其視覺, 進(jìn)而對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。與高等脊椎動(dòng)物相比, 多數(shù)魚類的眼睛無眼瞼, 不能調(diào)節(jié)瞳孔大小來控制入射視網(wǎng)膜的光強(qiáng)度, 所以在高光強(qiáng)下魚類的視網(wǎng)膜更容易受到傷害[30]。研究表明, 將大西洋鱈、大西洋鮭和歐洲舌齒鱸置于24 h 高光強(qiáng)照明條件下, 它們的視網(wǎng)膜會(huì)受到損傷[15]。我們前期研究中發(fā)現(xiàn), 24 h 連續(xù)照明條件下, 歐洲舌齒鱸稚魚的視網(wǎng)膜各層厚度會(huì)受到影響, 且感光層均會(huì)受到不同程度的損傷, 相比W 0.3 組, W 2.0 組稚魚的視網(wǎng)膜感光層受損更為嚴(yán)重, 除視桿細(xì)胞的損傷外, 我們還發(fā)現(xiàn)視錐細(xì)胞外節(jié)出現(xiàn)縮短的現(xiàn)象, 在腫脹的內(nèi)節(jié)里出現(xiàn)細(xì)胞核溶解, 這是一種細(xì)胞壞死的標(biāo)志[22]。研究發(fā)現(xiàn), 光誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞損傷是從外節(jié)末端開始的, 這表明外節(jié)層是最先遭受損傷的, 損傷的嚴(yán)重程度和膜盤的更新速度有關(guān)[31]。趙穎熙研究發(fā)現(xiàn), 高光強(qiáng)可以引起豚鼠眼球眼軸增長(zhǎng)減緩, 對(duì)視網(wǎng)膜光感受器造成輕微損傷[32]。然而, 即使在哺乳動(dòng)物中, 光照對(duì)視網(wǎng)膜造成的損傷的分子機(jī)制依舊不是十分清楚。

在本研究中, 以高通量測(cè)序?yàn)檠芯渴侄? 構(gòu)建了W 0.3 和W 2.0 兩組稚魚的眼轉(zhuǎn)錄組文庫(kù), 并篩選不同處理組之間的差異表達(dá)基因, 以期從分子水平來解釋光照強(qiáng)度對(duì)歐洲舌齒鱸視覺的影響。結(jié)果表明, 共獲得在W 2.0 和W 0.3 組稚魚眼內(nèi)差異表達(dá)的基因368 個(gè), 與W 0.3 組相比, W 2.0 組中234 個(gè)基因上調(diào)表達(dá), 134 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。在這些差異表達(dá)基因中, 我們發(fā)現(xiàn), MIP、RBP、RPE65、HSC70、EF1A和GPI 6 個(gè)基因均在W 2.0 組高表達(dá)。這說明, 這些基因的上調(diào)可能是對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng), 進(jìn)而影響歐洲舌齒鱸稚魚的視覺。

其中我們篩選得到的MIP 為水通道蛋白的一種,主要在晶狀體纖維細(xì)胞及視網(wǎng)膜中表達(dá)[33]。截至目前, 已經(jīng)在植物、原生生物和脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)超過200 種水通道蛋白[33]。眾所周知, 人體內(nèi)大部分器官,如肝、腎、眼等依賴于滲透壓調(diào)節(jié)來維持各自的生理功能, 所以水分對(duì)傳遞視覺信息, 視網(wǎng)膜成像起著至關(guān)重要的作用[33]。MIP 同時(shí)也具有結(jié)構(gòu)性鏈接功能, 它與晶狀體正常代謝及透明度的維持密切相關(guān)。近年來的研究發(fā)現(xiàn), MIP 也與白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)[33]。而白內(nèi)障是由于晶狀體病變而引起的疾病,晶狀體在正常狀態(tài)下是透明的, 因不同原因引起的晶狀體蛋白變性、水腫、纖維之間出現(xiàn)空泡, 上皮細(xì)胞增生等, 從而使晶狀體透明性減弱, 阻礙光線入射眼內(nèi), 形成白內(nèi)障, 進(jìn)而影響視力[34-35]。HSC70 是1999 年Ballinger 等[36]發(fā)現(xiàn)的具有輔助伴侶分子和泛素連接酶功能的蛋白質(zhì), 可以通過其氨基端連接熱休克蛋白調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的重新折疊, 同時(shí)通過其羧基端連接蛋白酶體促進(jìn)底物的降解[37]。HSC70 在所有的器官內(nèi)幾乎均有表達(dá), 但在代謝效率較高亦或是蛋白質(zhì)更替較快的器官或組織中, 如骨骼肌、心臟和腦中高表達(dá), 在胰腺、肺、肝、胎盤和腎臟中的表達(dá)水平相對(duì)較低[37]。在正常情況下, HSC70 參與維持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象, 起到細(xì)胞骨架等基本功能。可當(dāng)細(xì)胞面臨脅迫時(shí), 生物體會(huì)大量表達(dá)HSC70 用于阻止變性蛋白質(zhì)的的積累, 增加細(xì)胞的抗逆和保護(hù)機(jī)制[38]。維生素A 由視黃醇(維生素A1)和3-脫氫視黃醇(維生素A2)組成, 兩者均為20 碳的白芷酮環(huán)多烯烴一元醇, 在動(dòng)物體內(nèi), 其多存在于肝臟中[39]。在前人的研究中發(fā)現(xiàn), 維生素A 是構(gòu)成視覺細(xì)胞內(nèi)感光物質(zhì)的成分, 是維持上皮組織健全所必須的物質(zhì),其不足時(shí)會(huì)引起維生素A 缺乏綜合征, 如眼部視網(wǎng)膜血管炎[40]、夜盲癥和干眼癥[41]。在我們篩選的基因中, 我們發(fā)現(xiàn), RBP3 和RPE65 兩者均在W 2.0 組稚魚高表達(dá), 而RBP 是維生素A 的運(yùn)載蛋白, 在協(xié)助維生素發(fā)揮生理功能中起著不可替代的作用[42]。綜上, 與W 0.3 組相比, 在W 2.0 組中, 上述基因在眼睛組織中的表達(dá)水平上升, 可能是因?yàn)樵摴庹諚l件對(duì)稚魚視覺系統(tǒng)造成了脅迫, 其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。GPI 又被稱為磷酸葡萄糖異構(gòu)酶, 在所有真核生物和原核生物的細(xì)胞中普遍存在, 是一類具有多功能生物活性的天然蛋白質(zhì)[43], 它參與糖代謝的糖酵解作用[44]。光電能的轉(zhuǎn)換是視網(wǎng)膜組織的重要功能之一, 這種轉(zhuǎn)換過程需消耗大量的能量。這種能量的來源主要是依靠葡萄糖的酵解獲得[45]。因此,W 2.0 組稚魚的光電能的轉(zhuǎn)換速率可能增加, 進(jìn)而使葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶表達(dá)水平升高。

4 結(jié)論

本研究以歐洲舌齒鱸稚魚為研究對(duì)象, 在白光光照強(qiáng)度為2.0 W/m2、1.0 W/m2和0.3 W/m2的條件下對(duì)其進(jìn)行養(yǎng)殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較了3 組稚魚的體長(zhǎng)、濕重和存活率, 且構(gòu)建了W 0.3 和W 2.0 兩組稚魚眼組織的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)并進(jìn)行了高通量測(cè)序。研究發(fā)現(xiàn)白光飼養(yǎng)條件下, 高光照強(qiáng)度會(huì)抑制歐洲舌齒鱸稚魚的生長(zhǎng), 這可能是由于高光照強(qiáng)度會(huì)對(duì)其視覺產(chǎn)生影響進(jìn)而影響其攝食活動(dòng)和生長(zhǎng)。