李慧文，曾令烽，陳海云

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405； 2.廣東省中醫(yī)院骨傷科，廣州 510120)

骨質(zhì)疏松癥是一種常見病，其主要病因是骨骼中骨量低，骨微結(jié)構(gòu)損壞，無(wú)法保證骨骼韌性與強(qiáng)度，從而導(dǎo)致骨骼脆性增加[1]。在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)病率最高，對(duì)絕經(jīng)后婦女的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，且對(duì)患者的日常生活造成極大影響[2]。PMOP與祖國(guó)醫(yī)學(xué)中“骨枯”描述癥狀十分相似?！鹅`樞·經(jīng)脈》：“足少陰而氣絕，則骨枯已”。腎精虧虛，骨髓化生無(wú)源，無(wú)以滋養(yǎng)骨骼，枯槁易折。PMOP的辨證主要分為腎虛血瘀、脾腎兩虛、肝腎陰虛和腎精虧虛4型[3]。由此可見，此病以肝脾虛和腎虛為主，同時(shí)伴有血瘀癥，治療上應(yīng)以補(bǔ)腎填精為主，兼以活血化瘀、健脾益氣養(yǎng)陰。

中醫(yī)藥治療PMOP收效良好，既能減輕癥狀，又能改善患者的整體狀態(tài)，且無(wú)明顯毒副作用。菟絲子和女貞子是常用的藥對(duì)。菟絲子黃酮具有促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性雌激素的作用，女貞子提取物中也存在雌激素樣物質(zhì)[4]，因而兩者配伍治療PMOP常事半功倍。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討菟絲子、女貞子中有實(shí)際價(jià)值的活性成分、作用靶點(diǎn)及其相互作用，進(jìn)一步預(yù)測(cè)菟絲子、女貞子抗PMOP的靶點(diǎn)，重點(diǎn)研究菟絲子、女貞子配伍治療PMOP的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1菟絲子、女貞子的潛在活性成分及作用靶標(biāo)收集 以“TUSIZI”“NVZHENZI”為檢索詞，生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為篩選條件，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中檢索獲得菟絲子、女貞子的相關(guān)活性成分。

1.2菟絲子、女貞子作用靶標(biāo)收集 從PubChem平臺(tái)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得菟絲子和女貞子具體活性成分對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行smiles格式調(diào)整。然后對(duì)其進(jìn)行整理并導(dǎo)入Swiss Target Predictio平臺(tái)(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行藥物活性成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)，物種選擇“Homo Sapiens”。

1.3PMOP靶標(biāo)收集 以“postmenopausal osteoporosis”為關(guān)鍵詞，從人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中收集PMOP有關(guān)的靶標(biāo)。將UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)作為基礎(chǔ)，完成確認(rèn)、轉(zhuǎn)換等步驟。對(duì)以上靶標(biāo)進(jìn)行整合，剔除其中的重復(fù)項(xiàng)和假陽(yáng)性靶標(biāo)，再通過(guò)Venny平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)完成藥物相應(yīng)的靶標(biāo)及疾病關(guān)鍵靶標(biāo)的映射，進(jìn)而明確菟絲子、女貞子有效的活性成分并繪制韋恩圖。

1.4藥物-活性成分-疾病-關(guān)鍵靶標(biāo)可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 經(jīng)映射獲得疾病、關(guān)鍵靶標(biāo)以及活性成分間的關(guān)系，并通過(guò)Cytoscape V3.7.2中的自由度、介度與緊密度等對(duì)特征值進(jìn)行拓?fù)洌M(jìn)而展開可視化分析，完成對(duì)藥物-活性成分-疾病-關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的建立。

1.5關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI)的構(gòu)建 在String v 11.0中錄入關(guān)鍵靶標(biāo)并進(jìn)行物種設(shè)置，設(shè)成“Homo Sapiens”，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)的有效建立。然后在Cytoscape內(nèi)導(dǎo)入所涉各項(xiàng)數(shù)據(jù)，并基于可視化分析的相關(guān)過(guò)程完成對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖的建立。

1.6菟絲子、女貞子作用靶標(biāo)和關(guān)鍵靶蛋白可靠性驗(yàn)證及分子對(duì)接 本研究選取藥物作用靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)作為對(duì)接所用的蛋白，從RCSB Protein Data Bank平臺(tái)(https://bivi.co/visualisation/rcsb-protein-data-bank)下載菟絲子、女貞子作用靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)，以ChemBio3D Ultra 17.0完成對(duì)靶蛋白三維結(jié)構(gòu)的可視化處理，然后通過(guò)MMFF94力場(chǎng)完成相關(guān)調(diào)整。蛋白、化合物均通過(guò)AutodockTools 1.5.6將格式轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。通過(guò)Autodock vina 1.1.2[5]完成分子對(duì)接處理，并將參數(shù)exhaustiveness調(diào)整為20，選擇優(yōu)質(zhì)的構(gòu)象后使用Pymol軟件顯示其三維結(jié)構(gòu)。

1.7關(guān)鍵靶標(biāo)生物功能注釋及通路分析富集 使用R 4.0.5進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析，GO富集對(duì)生物過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能進(jìn)行分析，通路分析選擇KEGG，設(shè)置校正后的P<0.05，并繪圖。

2 結(jié) 果

2.1菟絲子、女貞子的潛在活性成分篩選 以生物利用度≥30%、類藥性≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)完成篩選，共獲得菟絲子潛在活性成分11個(gè)，女貞子潛在活性成分13個(gè)，見表1。

表1 菟絲子、女貞子的潛在活性成分

續(xù)表1

2.2菟絲子、女貞子配伍治療PMOP的潛在作用靶標(biāo)預(yù)測(cè) 完成菟絲子、女貞子潛在活性成分篩選后，將其smiles格式向Swiss Target Prediction平臺(tái)中進(jìn)行轉(zhuǎn)移，共獲得兩植物的潛在作用靶標(biāo)572個(gè)，其中菟絲子282個(gè)，女貞子290個(gè)。排除重復(fù)靶標(biāo)后，菟絲子靶標(biāo)共190個(gè)，女貞子則降至170個(gè)?；贠MIM與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，疾病靶標(biāo)共1 296個(gè)，對(duì)其進(jìn)行重復(fù)靶標(biāo)排除后梳理出不同的疾病靶標(biāo)共1 130個(gè)。通過(guò)Venny平臺(tái)繪制韋恩圖(圖1) ，經(jīng)映射處理后，篩選出疾病、藥物同時(shí)作用的靶點(diǎn)共113個(gè)，菟絲子起作用的靶標(biāo)107個(gè)，而歸屬女貞子的104個(gè)，兩者共同靶標(biāo)98個(gè)。對(duì)應(yīng)的活性成分共18個(gè)，其中菟絲子10個(gè)，女貞子8個(gè)。

2.3藥物-活性成分-疾病-關(guān)鍵靶標(biāo)可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將菟絲子、女貞子與PMOP共同的靶標(biāo)及相關(guān)活性成分等信息添加到Cytoscape中，進(jìn)一步建立與繪制藥物、活性成分-疾病-關(guān)鍵靶標(biāo)之間可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖2。與關(guān)鍵靶標(biāo)存在直接相關(guān)性的活性成分共15個(gè)，其中12個(gè)活性成分能與3個(gè)以上的關(guān)鍵靶標(biāo)相連，包括芝麻素、異鼠李素、β谷甾醇、山柰酚、異黃酮、苦參堿、膽固醇、槲皮素、女貞果苷D_qt、紫杉醇、木犀草素、圣草酚。關(guān)鍵靶標(biāo)中度值前5的分別為前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)1、PTGS2、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor γ,PPARγ)、核因子κB p65(nuclear factor κB p65,RELA)、胱天蛋白酶3(caspase-3)。

2.4關(guān)鍵靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò) 于String數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取蛋白質(zhì)間的互作關(guān)系，再將相關(guān)數(shù)據(jù)添加到Cytoscape中，完成對(duì)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。其中含關(guān)鍵靶標(biāo)113個(gè)，條邊共17 030個(gè)。Degree值排名前10的分別是JUN、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-α serine/threonine-protein kinase,AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)1、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、RELA、MAPK8、MAPK14、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)。

節(jié)點(diǎn)大小采用以Degree值表示，節(jié)點(diǎn)隨值增大而增大；Combine socre值的大小反映邊的粗細(xì)，Combine socre值越大，邊越粗

2.5菟絲子、女貞子作用靶標(biāo)和關(guān)鍵靶蛋白分子對(duì)接可靠性驗(yàn)證及結(jié)果 通過(guò)分子水平描述化合物β谷甾醇、異鼠李素、山柰酚、木犀草素、槲皮素與PTGS1、PTGS2、PPARγ、RELA、caspase-3的作用模式，將上述成分進(jìn)行分子對(duì)接，其親和力見表2，并取得分最高的β谷甾醇和PPARγ作圖分析，其理論結(jié)合模式見圖4～7。

PPARγ：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ

表2 使用分子對(duì)接軟件Autodock Vina進(jìn)行對(duì)接打分 (kcal/mol)

2.6關(guān)鍵靶標(biāo)生物的功能注釋及通路分析 經(jīng)GO功能相關(guān)注釋顯示，菟絲子和女貞子存在關(guān)鍵靶標(biāo)的主要功能為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性等，見圖8。通過(guò)對(duì)KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，篩選出主要的富集通路有糖尿病并發(fā)癥的晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力以及動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等，見圖9。

PPARγ：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ

紫色箭頭：氫鍵方向 PPARγ：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ

紫色：蛋白；藍(lán)色：配體 PPARγ：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ

圖8 菟絲子和女貞子關(guān)鍵靶標(biāo)的生物功能注釋富集分析

KEGG：京都基因和基因組百科全書

3 討 論

女性在絕經(jīng)期后雌激素水平顯著下降，導(dǎo)致身體骨鈣含量大量流失，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，西醫(yī)治療以預(yù)防骨質(zhì)丟失、抑制骨吸收為主，并不能從根本上改善骨代謝情況，且存在一定的不良反應(yīng)[6]。而中藥治療PMOP的效果顯著、無(wú)毒副作用的優(yōu)點(diǎn)而被大多數(shù)PMOP患者所接受。

《開寶本草》言：“菟絲子味辛、甘、平，無(wú)毒……強(qiáng)陰，堅(jiān)筋骨?！币嘤形墨I(xiàn)佐證菟絲子藥用成分，菟絲子黃酮可抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝，還可調(diào)節(jié)骨產(chǎn)生與骨吸收的關(guān)系，加快機(jī)體雌激素的生成速度，從而預(yù)防雌激素降低引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥[7-8]?！侗静菪戮帯吩疲骸芭懽游犊?、甘，氣平，無(wú)毒，入腎經(jīng)……壯筋強(qiáng)力?！爆F(xiàn)代藥理研究證明，女貞子提取物可有效抑制破骨細(xì)胞的分化以及骨吸收功能，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖，從而進(jìn)一步預(yù)防骨質(zhì)流失[9]。無(wú)論是祖國(guó)醫(yī)學(xué)還是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，菟絲子和女貞子在治療骨質(zhì)疏松癥方面均有良好的療效。菟絲子偏溫，女貞子偏涼，兩者合用可發(fā)揮平補(bǔ)的作用，而菟絲子填腎精，女貞子滋腎陰，兩者合用，補(bǔ)益肝腎，填精益髓，能有效緩解PMOP患者腰膝酸軟、周身骨痛、潮熱盜汗的癥狀。若患者出現(xiàn)脾腎陽(yáng)虛腹瀉時(shí)則應(yīng)考慮去女貞子，加用溫陽(yáng)藥物(如鹿茸、淫羊藿、附子、肉桂)進(jìn)行治療。

本研究使用PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出菟絲子、女貞子配伍治療PMOP關(guān)聯(lián)度最高的基因包括JUN、AKT1、MAPK1、IL-6、RELA、MAPK8、MAPK14、EGFR、ESR1、VEGFA等。在PMOP的發(fā)病過(guò)程中，破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)，而IL-6是重要的破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)因子之一[10-11]，可與腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子協(xié)同調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并與IL-17信號(hào)通路密切相關(guān)。臨床上PMOP患者血清中IL-6和腫瘤壞死因子-α水平多有升高。AKT1參與調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，與成骨細(xì)胞相關(guān)，可調(diào)控骨形成的速度[12]。在骨形成與血管生成偶聯(lián)機(jī)制中，成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞可通過(guò)分泌VEGF相關(guān)細(xì)胞因子(如VEGFA)參與骨血管生成的調(diào)控，還可參與骨生成及骨重建[13]。體外實(shí)驗(yàn)證明，EGF可以激活破骨細(xì)胞，加快骨吸收的速度，還可抑制成骨細(xì)胞[14]，與EGFR共同參與成骨破骨的過(guò)程。JUN蛋白能與Fos家族內(nèi)的蛋白發(fā)生聚合反應(yīng)并變成異源二聚體，從而擔(dān)負(fù)起轉(zhuǎn)錄因子角色，發(fā)揮促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡的作用[11]。研究表明，JUN蛋白包含c-Jun、JunB、JunD，三者可以兩兩結(jié)合形成同源二聚體，也可以與Fos家族的蛋白形成異源二聚體，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，參與調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松癥中成骨細(xì)胞的凋亡[15]。

本研究通過(guò)KEGG富集研究顯示，菟絲子、女貞子可以通過(guò)糖尿病并發(fā)癥晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體通路作用于IL-1、IL-6、IL-8、caspase-3等靶點(diǎn)，從而達(dá)到有效治療PMOP的目的。研究表明，2型糖尿病與維生素D之間存在密切聯(lián)系，糖代謝與骨代謝之間也存在緊密關(guān)聯(lián)，胰島素拮抗程度越高，發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的可能性越大[16-17]；相關(guān)研究指出，菟絲子、女貞子均具有抗炎、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、控制血糖的作用[18-19]。骨質(zhì)疏松癥與頸動(dòng)脈硬化均是絕經(jīng)后婦女的常見病,有大型流行病學(xué)研究提示骨質(zhì)疏松癥與頸動(dòng)脈硬化顯著相關(guān)[20]。還有研究顯示，PMOP患者血清IL-17水平高于絕經(jīng)后骨質(zhì)正常和骨量降低的患者[21]。

破骨細(xì)胞在破骨過(guò)程中打開微小的孔洞，然后再被成骨細(xì)胞填滿，其中重要的鑿孔分子是超氧自由基(·O2-)[22]。研究發(fā)現(xiàn)菟絲子和女貞子均有清除氧自由基的作用[23]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)對(duì)破骨細(xì)胞的形成有促進(jìn)作用，且能顯著提高破骨細(xì)胞活性[24-26]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，去卵單小鼠破骨細(xì)胞內(nèi)HIF-1α水平升高，骨代謝破骨指標(biāo)Ⅰ型膠原交聯(lián)C端肽(C-terminal telopeptide of collagen type 1,CTX-1)也升高，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，若給予去卵巢小鼠HIF-1α抑制劑2-甲氧雌二醇，則破骨細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α水平較前下降，同時(shí)骨代謝破骨指標(biāo)CTX-1也較前下降，骨質(zhì)疏松程度有效減輕[25]。表明HIF-1α參與PMOP相關(guān)過(guò)程，可加重骨質(zhì)疏松程度。對(duì)去卵巢小鼠給予HIF-1α抑制劑后，其骨代謝指標(biāo)CTX-1開始出現(xiàn)下降，破骨細(xì)胞活性被抑制，減少骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。因此，結(jié)合臨床及現(xiàn)代藥理學(xué)推測(cè)菟絲子、女貞子配伍可能通過(guò)抗氧化抑制破骨細(xì)胞骨吸收作用達(dá)到抗PMOP的目的。另外，本研究KEGG通路結(jié)果顯示，部分通路之間存在協(xié)同作用，如調(diào)控成骨細(xì)胞的HIF-1通路，使VEGF和其他血管發(fā)生相關(guān)因子過(guò)表達(dá)，可促進(jìn)骨血管生成和骨形成[27]。以往研究證實(shí)，Hippo信號(hào)通路與骨代謝密切相關(guān)，而骨代謝的穩(wěn)定是在成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的骨吸收-形成平衡的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)[28]。Hippo-YAP信號(hào)通路是目前研究的熱點(diǎn)，補(bǔ)腎中藥通過(guò)該通路治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究完善。

綜上所述，菟絲子、女貞子可通過(guò)不同的信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化及活性，減少骨質(zhì)流失，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和活性，以及類激素作用，從而達(dá)到治療PMOP的目的。但是菟絲子、女貞子對(duì)腸鈣吸收是否有促進(jìn)作用尚未得到證實(shí)，仍需要進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)探究，從而明確菟絲子和女貞子有效活性成分作用的基因或蛋白，為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供新的思路。